固始雞臍帶間充質干細胞原代培養及其誘導分化潛能研究

吳月，王育南，宋哈楠，關偉軍，李楠

（1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯 154007；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193）

臍帶(umbilical cord，UC)由羊膜外層、華通膠、2條動脈和1條靜脈組成，為發育中的胎兒提供暢通無阻的血流[1]。臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）與骨髓間充質干細胞相比具有供應充足、采集無痛、無供區發病率、體外自我更新速度快等特征[2]，與胚胎干細胞相比沒有倫理道德爭議。并且干細胞可以從臍帶的不同部位獲得，臍帶血來源的造血干細胞被稱為“珍貴的生命備份”[3]，而華通膠來源的UCMSCs對子宮內膜損傷[4]、糖尿病[5-6]、急性肺損傷[7]等疾病均具有良好的治療效果。最近研究表明，在當前新冠病毒患者缺乏有效治療方法的關鍵時刻，UCMSCs作為一種無創治療方法非常有效且具有臨床應用和推廣前景[8]。當前最常用的UCMSCs體外培養體系是原代培養，不但可以在體外再現細胞發生、增殖以及分化過程，而且能夠直觀觀察到各種因素的影響，并且原代培養的細胞遺傳背景、培養條件均一致，所獲得的試驗結果更具有說服力和參考價值[9-11]。間充質干細胞具有在體外形成骨、軟骨、脂肪細胞的能力，成為識別干細胞的一種方法，利用干細胞制造特定類型的細胞和重建受損或病變組織的前景得到干細胞研究人員和臨床醫生密切關注。目前，干細胞領域誘導分化仍是研究熱點，有學者認為多向分化潛能是其重要的應用價值[12-13]。

固始雞產于河南省固始縣，是我國優良的肉蛋兼用品種，抗逆性和免疫力普遍較強。目前，對禽類UCMSCs研究相對較少，同時雞臍帶具有來源豐富、采集簡單及易在體外培養、擴增和導入外源目的基因的特點[14]。本研究以固始雞臍帶為材料進行原代培養及誘導分化潛能研究，不僅可以為今后研究UCMSCs提供試驗材料，還可以為再生醫學療法提供新的干細胞來源，為組織工程技術提供種子細胞。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗動物 14日齡健康固始雞雞胚由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所家禽試驗基地提供。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白酶（trypsin）、胎牛血清（fetal bovine werum,FBS）、DMEM/F12培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）購自Gibco公司；膠原酶Ⅳ購自Sigma公司；封閉用山羊血清、FITC標記山羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；CD29、CD44、CD90、CD166一抗購自美國Abcam公司；反轉錄酶購自TaKaRa公司；胰島素生長因子-1(IGF-1)、堿性成纖維生長因子（bFGF）均購自英國Perotech公司；Giemsa染色液購自索萊寶公司。

1.1.3 主要儀器 TE-2000-E聚焦顯微鏡，日本Nikon；TH4-200倒置生物學顯微鏡和DP-12圖像采集系統，日本Olympus；88×3種蛋全自動孵化機，山東科裕孵化設備有限公司；BB160UV/BB5060UV CO2培養箱，德國Heraeus；無菌超凈工作臺，哈爾濱哈東聯電子技術開發有限公司;離心機，德國Eppendor公司。

1.2 方法

1.2.1 UCMSCs分離培養 取固始雞14日齡胚胎，在無菌條件下分離臍帶，放入含PBS小皿中仔細清洗，去除血管組織及臍帶外膜，分離出華通膠放入干凈小皿中并將其剪成1 mm3大小的小塊，然后用Ⅳ型膠原酶在適當溫度下消化約15 min，見大量細胞從組織塊中分離后用完全培養基終止消化，所得懸浮液經200目篩網過濾，棄去組織塊。1 200 r·min-1離心5 min，將細胞用2 mL完全培養基（DMEM/F12培養基、10%FBS、8 ng·mL-1bFGF）重懸，接種于60 mm細胞培養皿，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。接種24 h后，用PBS洗滌去除非貼壁細胞，當細胞達到一定密度時用胰蛋白酶進行傳代培養，4代左右細胞逐漸純化。

1.2.2 UCMSCs不同代次的生長曲線及群體倍增時間計算 取P3、P9、P15代的UCMSCs，細胞融合度達到約85%時，胰蛋白酶消化收集細胞，取出細胞懸液10μL，用完全培養基稀釋，將細胞含量調整為1×104cell·mL-1，然后接種于24孔板中培養。每24 h計數1次，每次取3個孔（每孔設置3個重復孔），得出平均細胞數，用公式（1）計算群體倍增時間（populotion doubling time，PDT），繪制生長曲線。

式中，t0為培養開始時間，t為培養結束時間，N0為初始培養細胞數，Nt為最終培養細胞數。

1.2.3 UCMSCs不同代次的克隆形成能力檢測 取P3、P9、P15代的UCMSCs，用胰蛋白酶消化后收集細胞，完全培養基稀釋細胞懸液接種于6孔板中，接種量100 cell·孔-1，在CO2培養箱中連續培養14 d，顯微鏡下觀察得到較多克隆團時，吸出培養基，用PBS洗去殘留培養基，多聚甲醛固定15 min，加入Giemsa工作液染色20 min，用PBS洗凈染色液，顯微鏡下進行觀察克隆形態及個數，計算克隆形成率。

1.2.4 免疫熒光檢測表面標記物 將UCMSCs接種在6孔板上。當細胞密度達到70%時，用PBS洗去殘留培養基，4%多聚甲醛在室溫下固定15 min，用PBS洗去殘留固定液。用TritonX-100通透細胞10 min，PBS洗去殘留，山羊血清室溫孵育30 min。然后加入配置好的一抗CD29(1∶100)、CD44(1∶100)、CD73(1∶200)、CD90(1∶500)，并將樣品在4℃孵育過夜。次日去除一抗，用PBS洗去一抗殘留。然后加入FITC偶聯的山羊抗小鼠二抗或FITC偶聯的山羊抗兔二抗，室溫暗孵育1 h。PBS在黑暗中洗滌3次。最后，DAPI孵育細胞15 min，PBS洗去殘留。使用共聚焦顯微鏡獲取圖像。

1.2.5 多功能相關基因鑒定 采用Trizol法提取細胞總RNA,經TaKaRa反轉錄試劑盒合成cDNA，反轉錄體系20 uL。反轉錄條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃保存。用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物（表1），利用RT-PCR檢測特異基因表達量，包括間充質干細胞特異性標記基因CD29、CD44、CD73和CD90、CD166，造血干細胞特異性標記基因CD34和CD45，成骨特異性基因Collage typeⅠ和osteopontin，成脂特異性基因LPL、PPAR-γ成軟骨特異性基因SOX9、ACAN。PCR擴增反應體系50μL，反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 min，72℃延伸30 s，25個循環，72℃終延伸2 min。反應結束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察多功能性相關基因表達情況。

表1 引物信息表Table 1 Table for primer information

1.2.6 誘導分化能力的鑒定 在L-DMEM中加入10%胎牛血清、10-7mol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-磷酸甘油和50 mg·L-1抗壞血酸，培養2周，誘導UCMSCs向成骨細胞分化[2]。為誘導細胞成脂分化，需要在L-DMEM中添加10-7mol·L-1的地塞米松、5μg·mL-1胰 島 素、0.5 mmol·L-1IBMX和60 mol·L-1吲哚美辛。為誘導分化為成軟骨細胞，在基礎培養基中加入2.5%FBS、1%ITS、50 ng·mL-1脯氨酸、0.5 mmol·L-1丙酮酸鈉、50μg·mL-1VC、10 ng·mL-1IGF-1[1-2]。誘導培養基每3 d更換1次，每次換液后倒置顯微鏡下觀察細胞。成骨誘導15 d后，特異性茜素紅染色用以檢測鈣結節。成脂誘導7 d后，油紅O染色檢測累積的油滴。成軟骨誘導15 d后，阿利新蘭染色，并分別對誘導后細胞進行RT-PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 不同代次UCMSCs形態對比

從華通膠中分離出來的原代細胞于24 h粘附在培養皿上，48 h后開始增殖，細胞迅速擴張，呈成纖維細胞樣形態；大約2 d后，細胞90%融合，低代次間細胞形態無明顯差異，連續傳代后細胞形態保持穩定，但細胞培養到第30代左右，可見細胞形態發生變化，由長梭形逐漸變為多角形（圖1）。

圖1 固始雞臍帶間充質干細胞形態Fig.1 Cell morphology of Gushi chicken UCMSCs

2.2 UCMSCs增殖特點

如生長曲線（圖2）所示，P3、P9和P15代UCMSCs的生長和增殖相似。經過1～2 d的潛伏期后，細胞生長進入對數期，6 d左右趨于平穩，7 d時進入衰退期。經計算得出P3、P9和P15的PDT分別為44.18、45.41和48.51 h，符合MSCs的增值特點。

圖2 固始雞臍帶間充質干細胞P3、P9、P15代生長曲線Fig.2 Growth curvesof Gushichicken UCMSCsat P3，P9，and P15

2.3 不同代次UCMSCs的克隆形成率

2周后用Giemsa染色觀察3種不同傳代的UCMSCs的克隆形成情況。P3、P9和P15代間充質干細胞的克隆形成率分別是（32.33%±1.52%）、(26.66%±2.30%)和（20.00%±2.00%）（圖3）。P3代間充質干細胞的增殖能力高于P9(P＜0.05)，P9代也高于P15代(P＜0.05)。這些結果表明，培養的UCMSCs的增殖能力以傳代依賴的方式顯著下降。

圖3 不同代次克隆形成率Fig.3 Colony forming efficiency of different passages

2.4 UCMSCs表面標志物鑒定

免疫熒光檢測結果顯示，間充質干細胞特異性標記基因CD29、CD44、CD90和CD166均呈陽性表達，原始造血祖細胞標志物CD34為陰性（圖4）。RT-PCR結果（圖5）顯示，UCMSCs表達CD29、CD44、CD73和CD90、CD166，不表達CD34和CD45。這與國際細胞治療學會組織干細胞委員會指定的MSCs表面標記物相對應，證明所分離的細胞為臍帶間充質干細胞。

圖4 免疫熒光檢測雞臍帶間充質干細胞表面標志物Fig.4 Detection of Gushichicken UCMSCs markers by immunofluorescence staining

圖5 測標記基因RT-PCR的結果Fig.5 RT-PCRresult of marker genes

2.5 UCMSCs成脂誘導分化

成脂誘導液誘導3 d后，細胞形態由成纖維細胞樣變為扁球形。隨著誘導時間的延長，脂滴的數量逐漸增加。7 d后油紅O染色為陽性,且RT-PCR分析顯示，誘導細胞表達脂肪細胞特異性基因脂蛋白脂酶(LPL)、過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPAR-γ)(圖6)。

圖6 固始雞臍帶間充質干細胞成脂分化油紅O染色和RT-PCR檢測Fig.6 Adipogenic differentiation of Gushichicken UCMSCs tested by oilred Ostaining and RT-PCR

2.6 UCMSCs成骨誘導分化

經成骨誘導后UCMSCs的形態并未發生明顯的變化，但隨著誘導時間的延長結晶顆粒變得明顯，誘導2周后茜素紅染色液顯示細胞呈陽性，且RT-PCR分析顯示，成骨誘導后的細胞表達Ⅰ型膠原蛋白(collage typeⅠ)和骨橋蛋白(osteopontin,OPN)基因(圖7)。

圖7 固始雞臍帶間充質干細胞成骨分化鈣沉積茜素紅和RT-PCR檢測Fig.7 Osteoblast differentiation of Gushichicken UCMSCsby calciumdeposits within differentiated osteoblast and RT-PCR

2.7 UCMSCs成軟骨誘導分化

經成軟骨誘導后UCMSCs的形態并未發生明顯的變化，但隨著誘導時間的延長軟骨結節變得明顯，誘導2周后阿利新蘭染色液顯示細胞呈陽性，且RT-PCR分析顯示成軟骨誘導后的細胞表達SOX9基因和ACAN基因(圖8)。

圖8 固始雞臍帶間充質干細胞成軟骨分化阿利新蘭和RT-PCR檢測Fig.8 Chondrocyte differentiation of Gushi chicken UCMSCs by allianz staining and RT-PCR

3討論

臍帶將胚胎附著在胎盤上，保證懷孕期間胎兒持續的營養和氧氣供應。臍帶由2條臍帶動脈和1條臍帶靜脈和圍繞在臍帶血管周圍的粘液樣結締組織(即華通膠)組成。“臍帶”是造血干細胞/祖細胞(hematopoietic stem/progemtor cell，HSPC)和間充質基質細胞(mesenchymal stromal cell，MSC)的重要來源。臍帶間充質干細胞具有高度自我更新、多向分化潛能和低免疫原性的特點。在組織工程和基因治療領域取得了一系列成果[15-16]。

目前常用的UCMSCs分離方法有組織塊貼壁法和膠原酶消化法。組織塊貼壁法是將華通膠部分人工剪成1 mm3的組織碎片，加入完全培養基，37℃培養5 d內不予干擾，以使細胞從碎片中爬出。需要注意的是，組織塊碎片過于干燥或者碎片未貼牢漂浮在培養基中都導致細胞無法爬出。此外，這種方法可能無法提供一致的細胞種類，一般可以分離出2種細胞：MSCs和上皮細胞。膠原酶消化法當天即可獲取大量一致的MSCs，即使可能出現混有血細胞的情況，但是血細胞不貼壁，第2天換液即可去除。本試驗選取酶消法[17]從臍帶組織中獲取UCMSCs。觀察體外細胞生長模式，P3、P9、P15代生長曲線均呈S形，群體倍增時間隨著代次的增加由44.18 h逐漸增加至48.51 h。克隆形成率由（32.33%±1.52%）逐漸降低至（20.00%±2.00%），這是由于繼代培養中外部條件造成機械和化學損傷，細胞需要適應和恢復期。傳代的增加和外部環境的影響會導致細胞逐漸衰老[18-20]。

表面標記物是鑒定間充質干細胞的另一種方法。本研究表明，雞UCMSCs表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等間充質干細胞表面標記物基因，但不表達原始造血祖細胞標志物CD34和泛白細胞標志物CD45。這與國際細胞治療學會組織干細胞委員會指定的MSCs表面標記物相對應[21]。并且在人類、兔、綿羊之間UCMSCs的表面標志物并沒有明顯差異[22-24]，然而不同來源MSCs既存在一些共性，也具有一些不同的特性，這些標志物的可變表達可能來自物種差異、組織來源和培養條件。

在成骨分化過程中，茜素紅染液檢測到磷酸鈣沉積，RT-PCR檢測成骨特異性基因CollagetypeⅠ和OPN表達陽性。在小鼠脂肪組織來源的MSCs成骨分化過程中，檢測到collagetypeⅠ的表達，與本研究結果一致。在其他關于間充質干細胞成骨誘導的研究中也報告了OPN的表達[25-26]。然而，雞UCMSCs成骨誘導率與脂肪間充質干細胞以及骨髓間充質干細胞成骨誘導率均有較大差異[27-28]，這可能是由于在體內很難復制出指導細胞分化的復雜的信號通路。然而，MSCs分離、擴增和分化的方法正在不斷改進，敲除相關基因可以調控MSCs的成骨分化[29]。

現成熟的化學成脂誘導液大致有3種配方，本研究以地塞米松、吲哚美辛、IBMX和胰島素為主要試劑配制誘導液。IBMX和地塞米松通過增加cAMP水平來調節PPAR-γ的表達，吲哚美辛能夠誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。胰島素與胰島素受體結合，激活ERK等信號通路，參與細胞周期、DNA復制和細胞分化[30-32]。本試驗分化誘導7 d后油紅O染色呈現陽性，成脂特異性基因PPAR-γ和LPL表達陽性，與其他成脂誘導研究一致[33]。然而Saben等[34]成脂誘導可達14 d，因此，向脂肪細胞分化結果的現有差異可能是由于誘導方法的差異。

MSCs在軟骨再生中具有良好的轉化潛能，MSCs衍生的外泌體或者過表達SOX9均可促進軟骨細胞增殖和抑制凋亡[35]。然而，基于MSCs的組織工程在治療軟骨缺損方面的效果并不令人滿意，例如在透明關節軟骨中發現，MSCs的體外軟骨形成的過程中還促進了纖維軟骨樣特征的誘導，如Ⅰ型膠原蛋白。因此，在異位移植后，分化的MSCs發生了廣泛的損傷和血管生成，所以如何生成穩定的軟骨細胞并保持軟骨形成能力以改善其治療效果仍然是懸而未決的問題[36]。但是有研究表明，軟骨形成預處理和機械刺激在軟骨工程中的協同效應可以維持MSCs的軟骨形成潛力[37]，這可能會為干細胞用于軟骨修復提供啟示。

本研究成功地分離出雞臍帶間充質干細胞，建立了穩定的體外分離、培養、擴增體系，并對其自我更新潛能、生物學特性和分化能力進行評估，可為今后研究臍帶間充質干細胞提供試驗材料，為組織工程學和再生醫學療法提供新的干細胞來源。