產酸性蛋白酶深紅沙雷氏菌的篩選及其在種子萌發中的應用

彭欣，馮璨，馬香，李宏，唐燕瓊，李娟娟，劉柱

（海南大學生命科學學院，海口 570100）

土壤環境惡化導致作物減產，合理科學的施肥對增加作物產量具有重大意義。化肥因可以快速為植物生長提供需要的營養物質，得到了廣泛的使用[1]。隨著綠色農業的不斷發展，傳統化肥的弊端也逐漸顯現出來：有效成分單一，肥料利用率低，過度使用可導致水體的富營養化，且施用后會造成土壤污染與板結等[2]。液肥是液體肥料，具有無污染、肥效持久、可改善土壤結構和提高土壤肥力等優點[3]。當前液肥工業生產主要采用酶水解、酸堿水解等方法。酶水解除了需要將酶進行純化外，酶解反應還需要在比較溫和的條件下進行，對反應條件的要求比較嚴格；酸水解過程中的產物有異味，產生的酸液也會對環境造成污染；堿水解則會使L型氨基酸變成D型且存在不專一性[4]。與上述方法相比，直接利用微生物進行發酵在很大程度上節約了生產成本，是生產液肥最經濟且有效的手段[5]。

酸性蛋白酶是在酸性環境下可以水解蛋白的一類酶，主要由真菌中的各種霉菌（如根霉和曲霉等）產生，但目前產酶菌株類型單一，亟需開發新型產酶菌株。在魚類產品加工過程中，資源并不能全部得到利用，會產生60%以上的下腳料[6]，其富含魚蛋白，目前主要將其應用于制作飼料魚粉、生產微生物肥料、提取魚油、生產膠原蛋白的明膠等[7]。本文采用微生物發酵法，將產酸性蛋白酶的菌株直接加入魚下腳料中進行發酵，將其制備成酸性的生物液肥，該液肥具有一定促生作用，對于提高作物生產能力和緩解土壤鹽堿化程度具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 樣品來源 采樣地點位于海南省海口市東寨港紅樹林，林下土壤有機質豐富，水樣pH 5.5左右。土壤樣品采集表層和深層土壤，水樣品采集流動水和靜止水，裝在無菌玻璃瓶中，帶回實驗室進行后續研究。羅非魚下腳料來源于海口菜市場，用于陽性對照的氨基酸液肥購自廣州市沃梵生物科技有限公司，菜薹（Brassica parachinensis）種子購自穗豐種業。

1.1.2 主要培養基 LB培養基：酵母粉5.0 g·L-1，氯化鈉10.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，121℃滅菌20 min。

篩選培養基：酵母粉2.0 g·L-1，干酪素3.0 g·L-1，明膠5.0 g·L-1，瓊脂粉15.0 g·L-1，pH調至5.0~5.5，121℃滅菌20 min，倒平板備用。

發 酵 培 養 基：氮 源10.0 g·L-1，磷 酸 氫 二 鉀10.0 g·L-1，氯化鈉5.0 g·L-1，121℃滅菌20 min，碳源10.0 g·L-1（過濾除菌后加入已滅好菌的培養基中）。

1.1.3 主要試劑和儀器 三氯乙酸、碳酸鈉、酪氨酸、脫脂奶粉、磷鎢酸鈉、蛋白胨和酵母粉等購自于西隴科學股份有限公司，明膠、福林酚、干酪素和生理生化鑒定試劑盒等購自于北京索萊寶科技有限公司。

pH計（STARTER 3100），德國奧豪斯公司；紫外分光光度計（UV-1800），上海美譜達公司；高速冷凍離心機（320R），德國海蒂詩公司；PCR擴增儀（AG 22331），德國艾本德公司；超凈工作臺（SW-CJ-2D），蘇州凈化設備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS），上海申安公司；恒溫培養箱（HPX-9272），哈爾濱市東聯生化儀器有限公司；掃描電子顯微鏡（S-3000N），日立公司。

1.2 產酸性蛋白酶菌株篩選

1.2.1 初篩 取5 mL水樣和5 g土樣分別加入到100 mL LB液體培養基中，30℃、150 r·min-1過夜培養，獲得的菌液稀釋10、102、103、104、105、106倍，各取100μL涂布于含干酪素的篩選培養基平板上，在30℃恒溫培養箱中倒置培養2~3 d，觀察培養基上水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），挑選菌圈比（D/d）較大的菌株用于復篩。

1.2.2 復篩 將初篩菌株接種于發酵培養基中，過夜發酵，利用福林酚法[8]測定各株菌上清液中的蛋白酶活力，選取酶活力大的菌株作為篩選的最終菌株。酶活定義：40℃條件下1 mL酶液每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所消耗的酶量為1個蛋白酶活力單位，用U·mL-1表示。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌株形態學觀察 選取產酶量最高的菌株R3進行后續研究。將R3菌株在LB液體培養基中活化，然后取100μL涂布于LB平板上，30℃倒置培養12 h，觀察菌落外部形態；用接種環蘸取菌液后在試管內LB固體培養基上劃線，30℃培養12 h，制作細菌斜面，然后用無菌水反復沖洗斜面，制成菌懸液，取上述菌懸液與等量的2%（質量體積分數）磷鎢酸鈉水溶液混合成懸液，將懸液滴在銅網膜上3~5 min，待樣品干燥后，置于掃描電鏡下觀察菌株的外部形態及結構。

1.3.2 菌株鑒定 在無菌操作臺中將分離出的細菌接種于生理生化鑒定試劑盒中進行V-P實驗、甲基紅實驗、吲哚實驗，以及葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、尿素、硫化氫、檸檬酸鹽等生理生化測定，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[9]對菌株進行初步鑒定。

提取菌株基因組DNA[10]，選擇通用引物27F（3’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-5’）和1492R（3’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-5’）擴增菌株的16SrRNA基因序列[11]，將PCR擴增產物送至鉑尚生物技術有限公司進行測序，測序結果在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進 行BLAST比對，選取相似度較高菌株的16SrRNA基因序列，利用Clustal W進行多系列比對，采用MEGA軟件的鄰接法構建進化樹。

1.3.3 菌株最佳發酵條件篩選 以吸光度為指標，采用單因素實驗探究pH、溫度、發酵天數和魚下腳料比例對產酶能力的影響。固定的單因素條件為：pH 5.5，溫度30℃，發酵天數1 d。實驗水平如下：pH 3~10，不同pH的緩沖液配置如表1；溫度22、26、30、34、38、42℃；發酵天數1~4 d，魚下腳料和水比例1∶1、1∶4、1∶9、1∶19。

表1 不同pH緩沖液組分Table 1 Components of buffer solution with different pH

1.3.4 種子萌發試驗 挑選大小相對一致、顆粒飽滿、無病蟲傷害的菜心種子，用75%乙醇浸泡5 min，然后用超純水清洗干凈，發酵液稀釋1、5、10、15、20和25倍，共6個梯度，用氨基酸液肥作為陽性對照，清水作陰性對照。每組選取35顆種子均勻播撒在直徑為10 cm且鋪有各處理液浸潤濾紙片的平板內，置于恒溫培養箱中培養，光照12 h（光照強度3 000 lx）、溫度30℃。每個處理設置3個重復。

每天向平板內添加對應的處理液3 mL，每隔12 h記錄1次種子的發芽情況，并記錄種子萌發5 d后的根及芽長。

1.4 數據處理

用GraphPad-Prism 8對數據進行方差及顯著性分析。差異分析用t測驗，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 產酸性蛋白酶菌株的篩選

利用含干酪素的平板，從土壤樣品中篩選出40株有水解圈的菌株，編號為R1~40，從水樣品中篩選出10株，編號F1~F10。測量水解圈直徑（D）與菌落直徑（d），根據根據菌圈比（D/d）大小篩選6株出表現好的菌株，其中土壤樣品2株（F1和F6），水樣品4株（R3、R5、R25和R37）。利用福林酚法測定6株初篩菌株的酶活，結果如圖1所示。可以看出，R3菌株菌圈比（D/d）及酶活均最高，酶活約為160 U·mL-1，并與其他菌株差異顯 著（P＜0.05），因 此 選 用R3菌 株 進 行 后 續研究。

圖1 產酸性蛋白酶菌株的酶活菌圈比Fig.1 Enzymeactivity and D/d of acid proteaseproducingstrain

2.2 菌株鑒定結果分析

2.2.1 菌株形態學分析 從圖2可以看出，R3菌株外形呈橢圓狀，形態類似于蠶繭，大小約為0.8μm，表面粗糙，有些有絲狀突起，菌落外表呈紅色。

圖2 R3菌株形態特征Fig.2 Morphological characteristicsof R3 strain

2.2.2 菌株生理生化特征分析 R3菌株生理生化試驗結果如表2所示，V-P試驗和檸檬酸鹽實驗呈陽性，可以利用葡萄糖、蔗糖和麥芽糖；而甲基紅和吲哚試驗呈陰性，不能利用硫化氫和尿素。結合《伯杰細菌鑒定手冊》[9]，初步鑒定該菌為沙雷氏菌屬的細菌。

表2 R3菌株的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of R3 strain

利用16S通用引物進行PCR擴增，獲得約1 500 bp的片段，測序結果進行BLAST后，選取相似度高的序列構建進化樹，結果如圖3所示。可以看出，其與深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea）的遺傳距離最近。深紅沙雷氏菌具有產酸性蛋白酶、鐵載體及分解環境中有機磷的作用，可用于鹽堿地改良及提高植物抗逆性[12]。因此推測本研究篩選出的R3菌株具有產酸性蛋白酶的功能和改良鹽堿地的潛力。

圖3 R3菌株與其他相近菌株基于16SrRNA基因序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree among R3 strain and other similar strains based on 16SrRNA gene sequence

2.3 不同發酵條件對R3菌株酶活的影響

2.3.1 發酵時間對酶活的影響 分別取發酵1~4 d的上清液測定酶活，結果如圖4所示。可以看出，發酵2~3 d時的酶活最高，但與發酵1 d的酶活相比差異不顯著，故后續實驗可以采用發酵1 d的上清液進行分析。

圖4 不同發酵天數下的產酶活性Fig.4 Enzyme activity at different fermentation days

2.3.2 pH對酶活的影響 將發酵培養基的pH調至3~10，發酵1 d后測定酶活（圖5）。在pH為5時酶活達到最大值，150 U·mL-1，pH為6時酶活為110 U·mL-1，但是在pH 3~4及7~10時，酶活僅為20 U·mL-1左右，說明pH 5是菌株產酶的最適pH。

圖5 不同pH下的產酶活性Fig.5 Enzymatic activity at different pH

2.3.3 溫度對酶活的影響 溫度對酶活的影響如圖6所示，可以看出，該菌在30℃時產酶活性最高，為160 U·mL-1，低于或者高于這個溫度，酶活都顯著下降。當溫度低于25或者高于40℃時，酶活僅40 U·mL-1左右，因此，R3菌株的最適發酵溫度為30℃。

圖6 不同溫度下的產酶活性Fig.6 Enzyme activity at different temperature

2.3.4 魚下腳料含量對酶活的影響 從圖7可以看出，魚下腳料勻漿與水的比例對產酶影響顯著，在魚下腳料與水的比例為1∶1和1∶4時，發酵所產酶活差異不顯著，但顯著高于其他比例處理，1∶19時所產生的酶活更低，原因是由于培養基中營養物質含量低，不能滿足菌株的大量生長。所以結合酶活及經濟效益，最后選用魚下腳料和水的比例為1∶4進行發酵。

圖7 魚下腳料與水不同比例下的酶活Fig.7 Enzyme activity under different proportion of fish to water

2.4 魚下腳料發酵液肥對菜心種子萌發的影響

2.4.1 對種子萌發的影響 不同處理下種子萌發情況如表3所示，可以看出，在12 h之內任何處理的種子均沒有萌發；在24 h時，添加了氨基酸液肥的種子萌發率超過50%，清水及發酵液原液組（稀釋1倍）仍無萌發現象，其他發酵液組萌發情況隨稀釋倍數而不同；在48 h時，清水處理的種子出現了萌發，此時液肥的萌發率達到88.57%；在60 h時，發酵液稀釋20倍后處理的種子萌發率達到88.57%，萌發率僅低于液肥組，遠遠高于清水組。結果表明，當發酵液稀釋倍數大于5時，處理60 h的菜心種子萌發率比清水組顯著提高，其中以稀釋15和20倍的發酵液促萌發作用最為明顯，但是當發酵液不稀釋時，60 h后發芽率甚至低于清水組，表明發酵液含量高抑制種子發芽。

表3 種子萌發率Table 3 Seed germination rate (%）

2.4.2 對根長和芽長的影響 萌發5 d后測量根長和芽長，結果如圖8所示。可以看出，各處理組間芽長無明顯差異，但不同處理間根長差異較大。使用氨基酸液肥處理后，菜心種子根非常短小且粗壯；用清水和稀釋25倍的發酵液處理的根長最長；在一定范圍內，隨發酵液含量的增加根長逐漸變短，但當稀釋倍數達到10倍時，根長又逐漸變長。由于添加發酵液原液和稀釋5倍的溶液處理時，種子萌發不整齊，且根和芽均沒有生長，沒有相應數據。

圖8 不同處理組的根長與芽長Fig.8 Root length and bud length of different treatment groups

3 討論

深紅沙雷氏菌對植物生長具有一定促進作用，但酸性或堿性的外界環境也會對植物生長產生影響，因此，利用該類菌株制備的發酵液對植物生長的促進能力還有待進一步考究。杜秉海等[13]獲得了一株可以在pH 12和10%NaCl中生長的深紅沙雷氏菌，LB培養基發酵后蛋白酶活可達到80.728 U·mL-1，通過噴灑該菌的發酵液降解土壤中的蛋白質，增加氨基酸含量，可以改善小麥在鹽堿環境下的生長狀況。本研究中分離出的產酸性蛋白酶深紅沙雷氏菌酶活較高，發酵1 d酶活就可以達到150 U·mL-1左右，利用其制備的魚下腳料發酵液可有效提高菜薹種子萌發率。但在第4天后，酶活顯著降低，推測其中的營養物質基本消耗完，不足以維持細菌的正常生長，之前產生的蛋白酶作為一種氮源和碳源又被細菌利用，從而導致蛋白酶含量降低。

肥料用量也會影響種子的萌發[14]，本研究中用不同稀釋倍數的發酵液處理種子后，某些稀釋倍數下有促進種子萌發的效果，可能是發酵液中天冬氨酸和纈氨酸導致，但是對種子萌發的促進作用依賴于用量，并不是用量越大促進效果越明顯。這與很多植物生長調節劑原理相似，例如生長素可以促進作物的生長，但當含量過高時反而抑制作物的生長[15]。目前幾乎未見沙雷氏菌可以使植物致病的報道或研究，且在本研究中所有菜薹種子的萌發及其生長也未見致病性。在投入適宜比例的魚下腳料后，使用深紅沙雷氏菌發酵產生了大量的短肽和氨基酸，其中富含的天冬氨酸和纈氨酸具有促進種子萌發的功能[16]，大大提高了種子萌發率。

另外，為能更好地證明本研究所使用的深紅沙雷氏菌發酵液對菜薹種子萌發的促進作用，本研究以市場上購買的氨基酸液肥為陽性對照，其含有18種L-氨基酸以及Cu、Fe、Mn和Zn等多種微量元素，添加微量元素的主要作用僅僅是增加葉綠素的合成，從而增強光合作用，并沒有添加對種子萌發有影響的微量元素。

本研究篩選出的深紅沙雷氏菌在pH 5的酸性環境酶活性較高。針對目前一些化工廠排出的廢氣污染空氣造成酸雨，進而污染土地造成酸性土地等問題，未來可以直接將該菌株添加到酸性土壤中降解其中的蛋白成分，改良酸性土壤，并對植物生長起到促進作用。