椰子ALDH基因家族的鑒定及生物信息學分析

武映宏，黃東益，王 永，張大鵬，劉 蕊，孫熹微，肖 勇

（1. 海南大學 熱帶作物學院，?？?570228;2. 中國熱帶農業科學院 椰子研究所/海南省熱帶油料作物生物學重點實驗室，海南 文昌 571339）

內源性醛分子是一些生物合成與代謝途徑的中間產物，這些途徑包括碳水化合物、維生素、類固醇、氨基酸和脂類的代謝過程[1]。植物在逆境脅迫下，會產生醛類物質，將對植物產生毒害作用。醛脫氫酶(ALDHs)是NAD(P)+依賴性酶，其可以將有毒醛類物質氧化成羧酸，并降低脂質過氧化，提高植物對逆境的耐受性，這是植物體內重要的解毒機制[2]。據報道，在擬南芥中發現14個ALDH基因拷貝[3]，擬南芥的ALDH3I1和ALDH7B4在提高植物耐受生物和非生物脅迫方面發揮著重要作用[4?5]；擬南芥中ALDH3F1編碼產生乙酸鹽的醛氫酶，通過調節FLC位點上的H3K9Ac來控制開花時間，ALDH3F1突變導致開花時間早，ALDH3F1過表達導致開花晚[6]；擬南芥中ALDH3家族的其他2個基因ALDH3I1與ALDH3H1在外源ABA、高鹽、脫水和重金屬等環境下誘導表達，證明其在氧化應激反應中發揮作用。ALDH3I1在葉片中特異表達，而在滲透壓與外源ABA處理下，ALDH3H1在根中被誘導表達[3]。在水稻中共有19個ALDH基因拷貝[7]，對水稻幼苗進行干旱、高鹽及脫落 酸 處 理，發 現OsALDH2-2、OsALDH3-1和OsALDH3-2在干旱和高鹽脅迫下，下調表達，而OsALDH2-4、OsALDH3-4、OsALDH7、OsALDH10-1和OsALDH18-2在干旱和高鹽脅迫下誘導表達，OsALDH5和OsALDH12僅受干旱脅迫誘導表達，OsALDH18-1僅在高鹽脅迫下上調表達；水稻胚乳中ALDH7功能的喪失將導致種子干燥和貯藏過程中的褐變，表明OsALDH7對種子采后保持活力至關重要。AKAMURA[8]發現，BADH基因編碼的甜菜堿脫氫酶能催化甘氨酸合成甜菜堿（GB），甜菜堿作為一種無毒或保護性的細胞質滲透壓調節劑，在葉片中積累，可以抵御非生物脅迫，從而增強植物的抗逆性。BRADBURY[9]研究結果顯示，水稻8 號染色體上編碼BADH基因與香味相關，水稻中常見的BADH突變類型包括badh2-E7[10]、badh2-E2[11]、bahd2-E4-5[12]等，該基因的突變導致催化GB合成的酶活性喪失，從而使得上游底物γ-氨基丁醛(GABald)自發環化形成 Δ1-吡咯啉，這是香味物質2-AP的關鍵前體[10]。此外，ALDH基因家族成員在果樹中也被陸續鑒定，如在葡萄基因組中，鑒定出23個ALDH家族成員[13]，在蘋果中共鑒定39個ALDH基因拷貝[14]，它們在生物和非生物脅迫下發揮重要作用。

椰子(Cocos nuciferaL., 2n=32)屬于棕櫚科椰子屬，單子葉多年生常綠喬木，是一種重要的熱帶水果和油料作物，具有極高的綜合利用經濟價值，被稱為“寶樹”[15]。椰子作為一種濱海經濟作物，具有很好的逆境耐受性，我國培育的“文椰4號”椰子新品種，有一種特殊的芋頭香味，深受消費者喜愛。ALDH基因家族在逆境調控以及香味調控中發揮重要作用，但在椰子中鮮有研究報道。本研究旨在鑒定椰子的ALDH基因家族，分析其基因結構、保守結構域、系統發育樹及其表達模式，為椰子ALDH家族的基因功能闡釋奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 椰子ALDH基因家族的鑒定在NCBI(National Center for Biotechnology Information) 網站上下載水稻ALDH基因家族的蛋白質序列，利用BLAST軟件將水稻OsALDH基因家族蛋白序列與椰子CDS序列數據庫進行比對，閾值Evalue設置為1e?10，篩選椰子ALDH基因家族的CDS序列，共鑒定13個椰子CnALDH基因序列。應用TB tools軟件將CDS序列翻譯成蛋白質，在Pfma（http://pfam.xfam.org/ search）數據庫中進行結構域的預測，去除不含有ALDEH結構域的序列，最終獲得椰子ALDH基因家族成員。

1.2 椰子ALDH基因家族的理化性質分析在ExPASy數據庫（https://web.expasy.org/protparam/）中找到“ProtParam”選項，對椰子ALDH蛋白家族的氨基酸大小、分子質量、等電點基本信息進行分析，并通過WOLFPSORT網站對ALDH基因家族成員進行亞細胞定位信息的預測。

1.3 構建進化樹利用TB tools繪制椰子ALDH基因拷貝的結構圖。使用MEGA X軟件將椰子ALDH基因家族的蛋白序列與水稻OsALDH基因家族序列進行多序列比對，并用Neighbor-Joining方法構建進化樹，Bootstrap設置為 1 000 次。

1.4 椰子ALDH基因家族保守結構域（motif）分析通過GeneDoc軟件對椰子ALDH基因家族的蛋白質序列進行多序列分析，再利用 MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在線工具對比得到的椰子蛋白序列與水稻OsALDH基因家族序列進行 motif 搜索,將預測的motif數值設定為10。在Weblogo3（http://weblogo.threeplusone.com/）對所得的多序列分析結果繪制相應保守域結構的logo。在SWISS-MODEL上對CnAMADH2基 因進行蛋白質三級結構同源建模。

1.5 椰子CnALDH10_A8（CnAMADH2）基因的克隆在NCBI (National Center for Biotechnology Information) 網站上下載水稻和擬南芥BADH基因的蛋白質序列，利用BLAST軟件將2個物種的BADH基因的蛋白序列與椰子CDS序列數據庫進行比對，比對得出的CnAMADH2基因全長為16 359 bp，有14個外顯子。針對該基因的第14個外顯子設計引物，在香水椰子、高種椰子中擴增該基因的第14外顯子并測序，在群體中驗證是否存在堿基突變。

1.6 椰子ALDH基因家族的表達量分析在 NCBI(National Center for Biotechnology Information)數據庫的SRA (Sequence Read Archive)數據庫下載不同品種椰子組織（SRR1063404、SRR1063407、SRR1125016、SRR-1173229、SRR1273180）與椰子胚（SRR1273070）、胚乳（SRR1265939）及胚愈傷組織（SRR1137438）的轉錄組原始數據，所得結果用TB Tools進行聚類并繪制成熱圖。

2 結果與分析

2.1 椰子ALDH基因家族的鑒定及理化性質與亞細胞定位分析通過椰子ALDH基因家族鑒定，獲得12個ALDH基因家族成員。根據AGNC注釋標準，氨基酸序列與先前鑒定的ALDH序列相同超過40%的ALDH組成1個家族，而序列相同超過60%的ALDH組成1個亞家族，將12個ALDH基因家族成員分為9個家族。其蛋白質理化性質及亞細胞定位如下（表1）。

表1 CnALDH基因家族理化性質分析

結果表明，CnALDH基因家族氨基酸的分子量在53 273.64 ～ 91 359.59 Du之間。等電點在5.35～8.68之間，其中CnALDH2_B4、CnALDH2_B7、CnALDH2_C4、CnALDH7_B4、CnALDH10_A8、CnALDH11_A3、CnALDH12_A1為酸性蛋白質，其他CnALDH為堿性蛋白質。CnALDH基因家族編碼氨基酸的數量在495～814之間，大多數基因家族成員編碼的氨基酸數量差別不大，其中CnALDH3_F1編碼的氨基酸數量最長，為814個氨基酸。CnALDH3_F1與擬南芥ALDH3_F1同源性較高，而擬南芥ALDH3_F1調節植物開花時間，并不被外界環境脅迫所誘導，CnALDH基因家族成員大多數分布在葉綠體中。

2.2 椰子CnALDH基因與水稻OsALDH基因家族進化樹分析將椰子CnALDH基因家族的外顯子和內含子相關數據導入TB Tools。隨后使用MEGA X軟件將椰子、水稻的ALDH基因進行多序列比對，使用鄰接法構建系統進化樹（圖1），椰子ALDH基因家族結構域水稻和擬南芥的結構相似。此外還對椰子ALDH基因家族的外顯子-內含子結構進行了研究。

圖1 椰子、擬南芥和水稻ALDH基因家族的系統發育樹

基因結構分析顯示，椰子ALDH家族外顯子個數變異為9～17。家族內外顯子-內含子結構差異在多基因家族的進化中起關鍵作用。結合系統進化樹結果分析發現，親緣關系相近的基因具有相似的基因結構，如CnALDH2-B4與CnALDH2_B7均含有11個外顯子；不同基因家族成員基因結構則相差較大（圖2）。椰子基因組中共鑒定出12個基因家族成員，分屬于9個不同的亞族。

圖2 椰子CnALDH基因家族結構

2.3 椰子ALDH基因家族蛋白結構分析采用MEME軟件，分析了ALDH蛋白質的保守結構域（圖3）。共搜索到10個motif（圖4），其中最保守的結構域為motif 1。CnALDH2_B4、CnALDH2_B7、CnALDH2_C4均屬于同一個亞族，他們的motif構成一致。CnALDH3_F1與CnALDH3_H1均不含有motif 8和motif 9。與其他ALDH基因家族motif構成相比，CnALDH12_A1motif構成差別較大，根據水稻中對該亞家族的研究結果，推測椰子中這兩個基因家族成員可能行使不同的功能。

圖3 椰子CnALDH基因家族保守域多序列比對

圖4 椰子CnALDH基因家族 motif 分析

本研究利用 SWISS-MODEL 在線對椰子CnAMADH2基因以及該基因的變異序列進行三維結構同源建模。圖5-A為非香型椰子CnAMADH2基因的蛋白質結構，圖5-B為香水椰子中CnAMADH2基因的蛋白質結構。該基因第14外顯子上的G/C突變導致蛋白質結構發生變化，引起CnAMADH2基因的功能喪失。

圖5 椰子 CnAMADH2基因三維結構模型

2.4 椰子CnALDH10_A8（CnAMADH2）基因第14外顯子擴增結果根據目的基因序列設計引物，左引物（CnA-exon11-F:5′AGTATGAGAAGA TCAAAAAGTTCA3′）設計在第11外顯子上，右引物（CnA-exon14-R:5′CCATTCCCCAAGTTCACG3′）設計在第14外顯子，全長為1 095 bp（圖6）。取13個樣品的新鮮嫩葉提取基因組DNA，擴增后得到的測序結果如圖7所示，香型椰子基因型為CC純合，非香型椰子基因型為GG純合，而樣品6號為GC雜合香水椰，該測序結果與NCBI測定結果一致。

圖6 椰子 CnAMADH2第14外顯子擴增結果

圖7 椰子 CnAMADH2第14外顯子測序結果

2.5CnALDH基因家族在不同組織中表達量分析在 NCBI 數據庫中下載不同品種椰子葉片、椰子胚、胚乳及胚愈傷組織的轉錄組數據。通過計算RPKM值，得到該家族成員在不同組織中的表達量，采用TBtools繪制熱圖（圖8）。除CnALDH12_A1和CnALDH22_A1外，其 他 的ALDH基因家族成員均在葉片中有高水平表達。CnALDH22_A1在胚、胚乳與胚愈傷組織中表達。根據椰子與水稻進化樹分析得出CnALDH12_A1與水稻OSALDH18家族的同源性較高，而水稻OsALDH18編碼P5CS，該物質可以合成脯氨酸抵抗滲透脅迫，但在椰子中幾乎不表達。CnALDH10在各個時期均有高水平的表達，說明其在椰子整個生長周期應對環境脅迫，這可能與椰子本身較強的抗逆性有關。CnALDH2_B4、CnALDH2_B7、CnALDH2_C4均屬于椰子CnALDH2家族，但在椰子不同生長時期發揮作用，CnALDH2_C4僅在葉片中表達。CnALDH7_B4在愈傷組織、胚乳及葉片中表達量較高。

圖8 椰子CnALDH基因家族在不同組織器官中的表達譜分析

3 討 論

本研究通過生物信息學方法，鑒定椰子ALDH基因家族成員。研究結果表明，水稻基因組包括19個ALDH基因家族成員，而椰子中僅鑒定出12個。分析椰子ALDH基因家族的蛋白理化性質發現。除CnALDH3_F1,其他基因編碼的氨基酸數量相差不大。對椰子motif分析發現，所有椰子ALDH基因家族成員均含有motif1。

研究椰子ALDH基因家族在葉片、胚、胚乳、胚愈傷組織表達模式發現，CnALDH10_A8在植物各個時期均有表達。ALDH10家族的作用是催化甜菜醛脫氫為甘氨酸甜菜堿，甘氨酸甜菜堿作為一種滲透調節物質，可以幫助植物抵抗缺水、脫水的不良環境[8]。在大豆中，非生物脅迫使大豆中二胺氧化酶活性增加，迫使根系合成大量γ-氨基丁酸[7]。對椰子抗逆性研究發現，高種椰子比香水椰子抵抗逆境的能力強。BRADBURY[10]發現香水椰子中編碼BADH基因14外顯子上一個堿基的缺失阻斷了GB的合成，由此可以合理推測該基因的突變是導致香水椰子不耐逆境的其中一個原因。ALDH12和ALDH18家族均參與脯氨酸的代謝，該基因家族受干旱誘迫誘導，介導植物的應激反應和ROS的積累[16?17]。擬南芥中，外源脯氨酸和高鹽誘導ALDH12基因的表達。CnALDH12_A1在椰子轉錄組樣本中表達量較少，其表達量是否與脯氨酸代謝有關需要進一步的實驗證明。ABA能誘導脫水耐性的獲得[18]。KIRCH等[19]報道了擬南芥中ALDH7_B4基因的表達是由脫落酸激活的，它調節脫水應激反應和種子脫水通路。研究證明，OsALDH7是種子成熟的關鍵基因，胚乳中該基因的缺失導致種子在干燥和貯藏中發生褐變[20]。根據CnALDH7_B4的表達譜推測該基因在胚乳中的表達也與種子成熟有關。植物中與滲透脅迫誘導有關的ALDH基因家族為ALDH3、ALDH7、ALDH10、ALDH11和ALDH12中的大部分成員，ALDH3_H1在擬南芥的葉片中低水平表達[1]，而ALDH3_F1的表達則與開花有關[6]，ALDH11_A3催化植物特有的一種經典的糖酵解“旁路”反應[1]。

此外，在果樹中也陸續發現ALDH基因家族的存在。對葡萄ALDH基因家族的研究發現，該基因家族除了在干旱等非生物脅迫發生作用，霜霉病侵染時，部分抗病品種的ALDH基因家族成員表達量發生顯著變化[13]。椰子中ALDH基因的表達是否也受病害的誘導還未知。

椰子基因組的完整序列極大地幫助了研究人員將椰子作為一種經濟作物進行改良，為提高椰子的抗逆性以及篩選優良樹種奠定了分子基礎。椰子基因組包含12個ALDH超家族基因，編碼了9個不同的蛋白質家族，其中大多數家族都與應激條件有關。目前，ALDH基因家族在擬南芥和水稻模式植物中研究較為透徹，在葡萄、蘋果、香蕉等[14?15]果樹的ALDH基因家族也被陸續研究，而在椰子中對ALDH基因家族的研究鮮見報道。分析該基因家族的序列信息、基因結構，與水稻[5]等作物系統發育關系及在椰子不同組織的表達模式，可預測或識別椰子中各個ALDH蛋白或蛋白質家族發揮作用的途徑，并為進一步研究ALDH基因家族的生物學功能奠定基礎。