蛋白質(zhì)生物標志物在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究進展

王英鵬，楊曉峰

1山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，太原 030000

2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院泌尿外科，太原 030000

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)第二大惡性腫瘤和第二常見致死原因[1]。根據(jù)臨床病理特征，可將膀胱癌分為非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）及肌層浸潤性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC），其中，MIBC是膀胱癌患者腫瘤特異性死亡的主要原因[2-3]。雖然NMIBC患者的生存率比MIBC高，但30%～50%的NMIBC患者都會復發(fā)，10%～20%的復發(fā)將進展為MIBC[4]。因此，尋找新的有效標志物來預測膀胱癌的治療效果和預后具有重要的臨床意義。蛋白質(zhì)比基因和RNA轉(zhuǎn)錄物能更好地反映細胞行為，蛋白質(zhì)分子功能的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程有著密不可分的關(guān)系。因此，對人膀胱癌組織樣本進行蛋白質(zhì)組學分析成為尋找生物標志物的一種可行方法。尋找有效可用的生物標志物，不僅要發(fā)現(xiàn)標志物與膀胱癌預后的關(guān)系，更要探索該標志物在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機制，才能更好地去指導臨床。現(xiàn)結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻，對蛋白質(zhì)生物標志物在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究進展進行綜述。

1 凝溶膠樣加帽蛋白（capping actin protein，gelsolin like；CAPG）

CAPG是凝溶膠蛋白/絨毛蛋白家族的成員，它與肌動蛋白結(jié)合，并以鈣依賴的方式調(diào)節(jié)細胞質(zhì)和細胞核的結(jié)構(gòu)。已經(jīng)確定，細胞質(zhì)中的CAPG影響細胞運動。在正常情況下，推測CAPG對細胞具有冗余效應(yīng)，該蛋白的失活僅顯示細胞功能的輕微缺陷。在病理條件下，CAPG通過調(diào)節(jié)肌動蛋白絲的周轉(zhuǎn)來控制細胞侵襲[5]。

1.1 CAPG與膀胱癌預后的關(guān)系

目前，關(guān)于CAPG與腫瘤臨床療效及預后關(guān)系的報道逐漸增多，在許多其他腫瘤領(lǐng)域，肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白被認為是潛在靶點，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CAPG的表達水平與人膠質(zhì)細胞瘤[6]、肝細胞肝癌[7]等腫瘤的遷移性和侵襲性呈正相關(guān)，高CAPG表達預示著腫瘤患者的不良預后。然而關(guān)于CAPG在膀胱癌中的臨床意義及與預后關(guān)系的報道還很少。一項包括113例患者的研究表明，膀胱癌及癌旁組織中CAPG表達水平明顯高于正常膀胱組織，且CAPG蛋白和CAPGmRNA高表達與腫瘤大小、TNM分期、腫瘤分級和無復發(fā)生存期顯著相關(guān)[8]。而Lyu等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，CAPG過表達與T分期及M分期無關(guān)，但與家族史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分級相關(guān)，這可能與兩項研究采用的蛋白質(zhì)分析方法不一樣相關(guān)。基于這兩項研究及以下CAPG在膀胱癌中的作用機制，可以相信CAPG不僅是潛在的預后生物標志物，也可作為治療膀胱癌的可能靶點。

1.2 CAPG高表達抑制Hippo信號通路

Hippo信號通路是一種高度保守的發(fā)育通路，其核心是由哺乳動物Hippo同系物巨噬細胞刺激蛋白1/2（macrophage stimulating 1/2，MST1/2）和大腫瘤抑制基因1/2（large tumor suppressor 1/2，LATS1/2）組成的激酶級聯(lián)反應(yīng)，在限制器官大小、腫瘤抑制、組織再生和干細胞自我更新方面發(fā)揮著重要作用[10]。Lyu等[9]首次在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)CAPG過表達使Hippo信號通路核心組分LATS1和其共激活因子單極紡錘體-結(jié)合蛋白1（mps one binder kinase activator protein 1，MOB1）去磷酸化，導致Hippo信號轉(zhuǎn)導失活，進一步引起Hippo信號通路下游效應(yīng)物Yes-相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）磷酸化降低，YAP移位入核并起到轉(zhuǎn)錄共激活因子的作用。另一方面，移位入核的YAP可與轉(zhuǎn)錄增強相關(guān)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（TEA do-main transcription factor，TEAD）結(jié)合并激活致癌基因，從而引起膀胱癌。同時發(fā)現(xiàn)YAP抑制劑維替泊芬可抑制體內(nèi)的YAP移位入核，抑制腫瘤生長。然而目前調(diào)節(jié)Hippo通路的上游信號在很大程度上是未知的。已經(jīng)表明的是，影響F-肌動蛋白細胞骨架的各種操作可以調(diào)節(jié)Hippo通路[11]。因此CAPG是否還可以通過F-肌動蛋白或其他因素抑制Hippo信號通路還需要進一步探索。

1.3 CAPG誘導上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT是上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程，是導致靜止上皮細胞獲得作為單細胞遷移和侵襲能力的重要過程，其在各種人類疾病，尤其是在腫瘤中具有關(guān)鍵作用[12-13]。Lyu等[9]在探索CAPG在膀胱癌中作用機制的研究中發(fā)現(xiàn)，在CAPG高表達時，間充質(zhì)標志物（波形蛋白和N-鈣黏蛋白）的表達上調(diào)，上皮標志物（E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白）的表達下調(diào)，并通過體內(nèi)及體外細胞系實驗證實了CAPG可作為EMT的誘導因子，增強膀胱癌的遷移及侵襲能力。這為CAPG作為潛在的膀胱癌預后生物標志物提供了一定的證據(jù)。但該研究僅是發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，并未深入探究CAPG是通過何種途徑來誘導EMT。目前關(guān)于CAPG與膀胱癌臨床療效及預后關(guān)系的報道還很少，單獨或者聯(lián)合其他預后標志物輔助臨床醫(yī)師做出正確的預后判斷還需大量且深入的研究來提供證據(jù)支持。

2 異質(zhì)核糖核蛋白 F（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F，hnRNP-F）

hnRNP-F屬于hnRNP家族的RNA結(jié)合蛋白，其功能涉及RNA代謝和基因表達調(diào)控的多個步驟，例如可變剪接、mRNA穩(wěn)定化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后修飾[14]。hnRNP-F被證明在包括膀胱癌在內(nèi)的許多腫瘤中發(fā)揮致癌作用[15]。

2.1 hnRNP-F結(jié)合靶向爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白 2（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX 2）促進腫瘤細胞增殖

TPX2是一種微管相關(guān)蛋白，參與細胞周期并主要在G1/S期轉(zhuǎn)換的增殖細胞中表達[16-17]，并被證明可調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1和p21的表達，在包括膀胱癌在內(nèi)的各種腫瘤中發(fā)現(xiàn)TPX2顯著異常表達，促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。hnRNP-F和TPX2蛋白之間的關(guān)系由Li等[19]首次報道，指出TPX2是hnRNP-F介導的膀胱癌細胞增殖和促進細胞周期進程所必需的。TPX2是hnRNP-F的下游靶標，二者表達水平呈正相關(guān)且可物理結(jié)合。二者結(jié)合后使細胞周期相關(guān)蛋白D1表達增加和p21表達降低，促進腫瘤細胞的G1/S期轉(zhuǎn)換，加速腫瘤細胞周期進程和細胞增殖。但該研究僅通過體外細胞系實驗證明了hnRNP-F在膀胱癌中促進腫瘤細胞增殖，并未通過小鼠腫瘤模型來證明hnRNP-F在體內(nèi)膀胱癌中是否存在同樣的情況。但在接下來的一項研究中證實了hnRNP-F在體內(nèi)可加速腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[22]。

2.2 hnRNP-F調(diào)節(jié)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子 1（Snail 1）mRNA穩(wěn)定性，誘導EMT

Snail1是EMT轉(zhuǎn)錄激活因子的核心組分之一，在EMT過程中廣泛表達，是EMT的關(guān)鍵標志物[20]。目前，人們普遍認為Snail1是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過直接抑制E-鈣黏蛋白基因（一種維持上皮表型所必需的基因）來啟動EMT[21]。Li等[22]首次證實hnRNP-F高表達可誘導EMT。在包括103例患者的隊列研究中，利用免疫組化法（immunohistochemistry，IHC）證明了hnRNP-F的高表達與膀胱癌患者高臨床T分期及預后不良有關(guān)，并建立了正交各向異性轉(zhuǎn)移裸鼠模型，表明hnRNP-F在體內(nèi)可加速腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，同時發(fā)現(xiàn)hnRNP-F與Snail1表達水平呈正相關(guān)，而其他EMT轉(zhuǎn)錄激活因子表達水平與hnRNP-F無關(guān)。進一步研究證實hnRNP-F與Snail1mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）結(jié)合顯著增加了Snail1mRNA的穩(wěn)定性，促進了Snail1蛋白的表達，Snail1蛋白觸發(fā)EMT，增強了腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。

2.3 hnRNP-F表達受磷脂酰肌醇- 3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI 3 K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）介導的叉頭框蛋白 O 1（forkhead box O 1，F(xiàn)OXO 1）磷酸化調(diào)節(jié)

在各種腫瘤中，活化的PI3K磷酸化并激活AKT，AKT在廣泛的細胞調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如細胞增殖、侵襲、遷移和代謝[23-24]。FOXO1是PI3K/AKT下游的分子，可被磷酸化抑制[25]。研究表明，與非腫瘤性膀胱黏膜組織相比，膀胱癌組織中FOXO1表達降低，并且FOXO1與良好的預后相關(guān)，并被認為是膀胱癌中的腫瘤抑制因子[26-28]。Li等[29]通過京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途徑分析發(fā)現(xiàn)，hnRNP-F與PI3K/AKT通路顯著相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)hnRNP-F是FOXO1的直接下游靶標，二者表達水平呈負相關(guān)。未磷酸化的FOXO1與hnRNP-FmRNA啟動子區(qū)域結(jié)合可顯著抑制hnRNP-F的表達，同時腫瘤細胞的增殖能力受到顯著抑制。但是當前的研究受到一些限制，首先，該研究結(jié)果是在人膀胱癌細胞系EJ和UMUC-3中進行的實驗，需要通過體內(nèi)動物實驗進一步證實。其次，該研究未考慮遺傳多態(tài)性因素。因此并不能排除可能影響關(guān)聯(lián)的可能性。

3 DEAD盒解螺旋體31（DEAD-box helicase 31，DDX31）/突變型 p53（mutant p53，mutp53）/表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路

DDX31是DEAD盒蛋白7（DEAD-box protein 7，DBP7）的人類同源物，其最初作為新的ATP依賴性RNA解旋酶在啤酒糖酵母基因組數(shù)據(jù)庫（BLAST）中被鑒定出來[30]。然而迄今為止，對DDX31的生物學功能還知之甚少。p53蛋白由抑癌基因腫瘤蛋白 p53（tumor protein p53，TP53）編碼，TP53突變后，mutp53不僅失去了野生型p53（wild typep53，wtp53）的腫瘤抑制功能，而且還通過調(diào)節(jié)剩余的wtp53或獨立于wtp53獲得促進腫瘤進展的功能[31]。

3.1 DDX31/mutp53與膀胱癌預后的關(guān)系

Daizumoto等[32]對77例膀胱癌組織標本進行p53和DDX31的IHC分析，結(jié)果顯示，pT分期和病理分級與DDX31表達顯著相關(guān)，而與p53無關(guān)，并且DDX31和p53蛋白均高表達的膀胱癌患者預后明顯差于DDX31低表達且p53蛋白高表達的患者，在膀胱癌病例中，特別是MIBC，細胞質(zhì)中DDX31的高表達和p53的高表達對應(yīng)著顯著較差的預后。這些發(fā)現(xiàn)提示著DDX31和p53的組合可能是膀胱癌預后的預測指標。

3.2 DDX31與wtp53/mutp53相互作用

Daizumoto等[32]在不伴TP53突變的人膀胱癌SW780細胞系中觀察到，DDX31低表達較DDX31高表達有更高的凋亡特異性p53靶基因（p53upregulated modulator of apoptosis，PUMA）和EI24自噬相關(guān)跨膜蛋白（EI24 autophagy associated transmembrane protein，PIG8）的表達，抑制腫瘤細胞凋亡。該團隊并未探究其機制，但結(jié)合該團隊之前在DDX31與腎細胞癌方面的研究[33]，DDX31可能是通過與核磷脂 1（nucleophosmin 1，NPM1）相互作用來穩(wěn)定wtp53蛋白水平，并且還直接與wtp53結(jié)合，從而抑制PUMA和EI24基因誘導的膀胱癌細胞凋亡。

紅細胞膜蛋白條帶4.1樣4B（erythrocyte membrane protein band 4.1 like 4B，EPB41L4B）在具有高遷移潛能的腫瘤細胞（如轉(zhuǎn)移性黑色素瘤）中上調(diào)，并促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[34]。核DDX31、mutp53、Sp1轉(zhuǎn)錄因子（Sp1 transcription factor，SP1）形成復合物使mutp53獲得腫瘤促進功能，結(jié)合并增強其靶基因EPB41L4B的表達，從而促進膀胱癌細胞侵襲和遷移。

3.3 DDX31、核仁素（nucleolin，NCL）和EGFR的三聯(lián)體調(diào)控EGFR/AKT信號通路

NCL是一種多功能穿梭蛋白，存在于細胞核、細胞質(zhì)和某些類型的細胞表面，且DDX31、磷酸核仁素（p-NCL）和EGFR形成的三聯(lián)體與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)[35]。EGFR/AKT信號通路的激活參與了膀胱癌細胞的侵襲行為[36]。Daizumoto等[32]在伴有TP53突變的人膀胱癌UM-UC-3細胞系中觀察到，DDX31、p-NCL、EGFR形成三聯(lián)體，起到了穩(wěn)定EGFR的作用，從而促進EGFR/AKT信號轉(zhuǎn)導的EGF配體非依賴性組成激活，并導致伴有TP53突變的MIBC細胞進展。并且該團隊制備了DDX31肽，可明顯抑制DDX31-NCL復合物的形成，成功抑制了小鼠體內(nèi)腫瘤的生長。可見DDX31肽是治療晚期MIBC的一種有效藥物。

4 脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）

FTO是一種常見的N6-甲基腺嘌呤（m6A）去甲基化酶，F(xiàn)TO的高表達與肥胖關(guān)系密切[37]，而且已被證明在胃癌、宮頸鱗狀細胞癌和膀胱癌中具有促癌活性[38-40]。

4.1 FTO與膀胱癌預后的關(guān)系

Zhou等[41]對20例膀胱癌組織標本進行了IHC分析，指出在膀胱癌組織中FTO的表達水平較正常尿路上皮組織顯著提高，并鑒定了人膀胱癌細胞系（T24、5637）中的FTO高表達，同時指出FTO的表達與TNM分期相關(guān)且FTO高表達患者的T分期較高。Tao等[40]對144例膀胱癌組織標本進行IHC分析后也給出了相似意見，指出FTO高表達的膀胱癌患者的總體生存率降低，F(xiàn)TO蛋白表達與膀胱癌患者的吸煙情況、病理分期和pT分期顯著相關(guān)。但是Wen等[42]給出了不同意見，其分析了30例膀胱癌組織與正常對照組之間FTOmRNA的表達，發(fā)現(xiàn)FTOmRNA在膀胱尿路上皮癌組織中顯著下調(diào)，蛋白質(zhì)印跡分析顯示與正常膀胱上皮細胞系相比，膀胱癌細胞系（5637、T24）中FTO表達降低，并且FTO在Ⅱ～Ⅳ期膀胱癌中的表達水平顯著下調(diào)。這可能與標本來源以及細胞培養(yǎng)基不同有關(guān)，相較前兩項研究的細胞培養(yǎng)基，后者在胎牛血清培養(yǎng)基中添加了1%青霉素和鏈霉素。

4.2 FTO通過FTO/miRNA-576/細胞周期蛋白依賴性激酶 6（cyclin dependent kinase 6，CDK 6）通路以m 6 A依賴的方式促進腫瘤增殖

RNA甲基化修飾占所有RNA修飾的60%以上，m6A是mRNA和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）水平上最常見的修飾之一。這種修飾的異常調(diào)節(jié)與許多惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[43]。Zhou等[39]通過體外細胞系實驗及小鼠腫瘤模型證實了FTO高表達可促進腫瘤組織的生長，而miRNA-576的高/低表達明顯逆轉(zhuǎn)了FTO低/高表達對細胞增殖和集落形成能力的影響，證明了二者存在直接關(guān)系。miRNA-576可與CDK6mRNA的3'-UTR結(jié)合位點結(jié)合，抑制CDK6的表達，而CDK6過表達可促進細胞增殖并降低DNA修復能力[34]，從而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。

4.3 FTO改變肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本 1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT 1）的m 6 A水平并促進膀胱癌進展

MALAT1廣泛表達于人類正常組織，并在惡性腫瘤組織及血漿中出現(xiàn)異常表達，幾乎參與基因調(diào)控過程的各個層面。越來越多的研究表明，MALAT1在肝細胞肝癌、非小細胞肺癌、胃癌、宮頸癌、膀胱癌以及結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中表達量升高[44]，與惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、預后等密切相關(guān)。Tao等[40]首次闡述了FTO基于其去甲基化的能力減少MALAT1mRNA 5'-末端的m6A修飾，從而延長MALAT1mRNA的半衰期，促進了膀胱癌進展。并且當抑制小鼠腫瘤中的FTO，可發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的生長明顯受到限制。同時發(fā)現(xiàn)了miRNA-384模擬物可抑制MALAT1的表達，明顯延長小鼠存活時間，但并未進行miRNA-384在高表達狀態(tài)下是否仍存在相同結(jié)果的研究。

5 小結(jié)

近年來，關(guān)于蛋白質(zhì)生物標志物與膀胱癌關(guān)系的研究日益增多，也證實了很多蛋白質(zhì)生物標志物與膀胱癌預后相關(guān)。但目前，臨床判斷膀胱癌患者的預后依然是根據(jù)腫瘤大小、TNM分期、病理學分級及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等來進行粗略預測，尚未開始大規(guī)模應(yīng)用生物標志物來判斷患者的預后，其原因可能是因為膀胱癌異質(zhì)性較強。綜上所述，可以看到膀胱癌組織中的蛋白質(zhì)生物標志物可以存在多種不同作用機制，同時，一種生物標志物可以存在多種不同的作用機制，這可能是利用生物標志物判斷預后效果較差的原因之一。存在多種不同致癌路徑也可能與腫瘤異質(zhì)性相關(guān)。隨著分子生物學及精準醫(yī)學的發(fā)展，會對了解蛋白質(zhì)生物標志物在膀胱癌中的作用及改善患者預后提供極大幫助。