青花椒精油對致齲菌的體外抑菌活性

程志敏，陳彥榮，王建輝，劉冬敏，方 芳，張 博，牟鳴薇，謝雨菲，易金枝

（長沙理工大學食品與生物工程學院，湖南 長沙 410114）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSiebold & Zucc.）是蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物，果實油腺飽滿，氣味芬芳獨特，是我國傳統香辛料[1-2]。在民間醫學中，花椒屬植物常被用于治療牙痛、腹瀉等疾病[3]。從青花椒果皮中提取得到的青花椒精油（Z. schinifoliumessential oils，ZSEOs）具有廣譜抑菌活性。Lei Hong等[3]報道了花椒精油對大腸桿菌（Escherichia coli）的最小抑菌質量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為24 mg/mL，能夠顯著抑制E. coli的生長并對其形態結構產生不利影響。Li Ren等[4]研究發現毛大葉臭花椒精油中芳樟醇的相對含量高達79.00%，對E. coli、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠菌（Candida albicans）、煙曲霉（Aspergillus funigatus）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）均具有抑菌活性。此外，ZSEOs對表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）也具明顯抑制作用，最小殺菌質量濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）均為5 mg/mL[5]。然而，關于ZSEOs對致齲菌如變形鏈球菌（Streptococcus mutans）的體外抑菌活性鮮有報道。

齲齒是人類最常見的傳染病之一，是一種由特定細菌引起的多種微生物共同作用導致的疾病[6]。血鏈球菌（S. sanguinis）是最早定植于牙齒表面上的細菌之一，其定植后促進了S. mutans和其他細菌的定植與黏附[7-8]。研究表明，S. mutans和遠緣鏈球菌（S. sobrinus）與人類齲齒密切相關[9-11]。目前，由于洗必泰（chlorhexidine，CHX）[12]等抗生素存在耐藥性、毒副作用等不良影響，研究人員逐漸將目光轉向具有抗齲活性的天然產物，如檸檬精油[11,13]等。研究結果顯示，檸檬精油及其主要成分檸檬烯均能抑制S. mutans和S. sobrinus的增殖，檸檬精油對兩種細菌的MIC均為4.50 mg/mL[11,13]。青花椒與檸檬同屬蕓香科植物，ZSEOs可能對致齲菌也存在抑制活性，但迄今鮮見理論數據支撐。

本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取ZSEOs，通過全二維氣相色譜-飛行時間質譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）確定ZSEOs的化學組成，通過測定抑菌圈直徑、MIC、MBC、致齲菌生長曲線研究ZSEOs對3 種致齲菌的體外抑菌活性，并通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察ZSEOs作用于致齲菌后菌體的形態變化，初步探討ZSEOs抑菌機制，為ZSEOs作為潛在的天然齲病抗菌劑提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

S. mutans（北納保藏中心（BeNa Culture Collection，BNCC）234186）、S. sanguinis（BNCC 134927）和S. sobrinus（BNCC 353916）購買于商城北納創聯生物技術有限公司。

實驗所用青花椒分別產自重慶江津、四川金陽、貴州德江以及云南昭通。

無水硫酸鈉（分析純）、95%（體積分數，下同）乙醇（分析純）、叔丁醇（化學純） 國藥集團化學試劑有限公司；腦心浸出液肉湯（brain heart infusion，BHI）美國BD公司；瓊脂粉、Gluta固定液（SEM專用，2.5%）北京索萊寶科技有限公司；CHX、碘硝基氯化四氮唑藍（p-iodonitrotetrazolium chloride，INT） 上海源葉生物科技有限公司；厭氧產氣袋C-01、厭氧指示劑C-22日本三菱瓦斯化學株式會社。

1.2 儀器與設備

LDZM-80L立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；BBS-SDC醫用潔凈工作臺 濟南鑫貝西生物技術有限公司；Pegasus?4D GC×GC-TOFMS儀 美國LECO公司；VERSA max酶標儀 美國分子儀器公司；JSM-IT500 SEM 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 ZSEOs的提取

參考文獻[14]采用水蒸氣蒸餾法從產于重慶江津、貴州德江、四川金陽、云南昭通的青花椒果皮（圖1）中提取ZSEOs，分別記為ZS1EO、ZS2EO、ZS3EO、ZS4EO。將ZSEOs收集于棕色螺紋瓶中，無水硫酸鈉干燥12 h，4 ℃冷藏備用。按下式計算精油得率。

圖1 4 個不同產地青花椒的干燥果皮Fig. 1 Dry pericarp of Zanthoxylum schinifolium from four production areas in China

1.3.2 ZSEOs組成分析

采用GC×GC-TOFMS分析ZSEOs組成：第一維柱DB×WAX（30 m×250 μm，0.25 μm），進樣溫度250 ℃、進樣量0.5 μL，初始溫度60 ℃保留1 min，以5 ℃/min升至260 ℃，保留4 min。以He（99.9999%，1.0 mL/min）為載氣，分流比10∶1。第二維柱DB-17MS（2 m×100 μm，0.10 μm），柱溫高于第一維柱15 ℃。調制解調器溫度始終高于第二維柱15 ℃。全二維分析時調制周期4.0 s、接口溫度270 ℃、離子源溫度230 ℃、電子轟擊離子源70 eV、檢測器電壓1 670 V、采集頻率50 張/s，質譜掃描范圍為m/z33～550。

GC×GC-TOFMS結果經NIST17 MS Search檢索后進一步根據質譜圖鑒定ZSEOs的組成。通過峰面積歸一化法確定各組分的相對含量。

1.3.3 ZSEOs抑菌活性測定

1.3.3.1 菌懸液的制備

將保藏S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus標準菌株的甘油管于37 ℃水浴1 min快速解凍。在無菌條件下，按照5%（體積分數）接種量分別接種至BHI液體培養基中，37 ℃厭氧培養24 h[15]（后同），然后分別劃線接種至BHI瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養24 h后，挑取典型單個菌落接種至BHI液體培養基中培養。充分振蕩混勻，測定630 nm波長處光密度值OD630nm，調整菌懸液濃度至1×107CFU/mL（OD630nm＝0.2）備用。

1.3.3.2 抑菌圈直徑的測定

采用牛津杯法[16]測定4 種ZSEOs對3 種致齲菌的抑菌活性。用95%乙醇溶液將受試ZSEOs稀釋至質量濃度32 mg/mL備用。在無菌操作臺中，將20 mL高溫高壓滅菌后的BHI瓊脂培養基冷卻至45～50 ℃，然后注入200 μL菌懸液（1.3.3.1節制備，濃度1×107CFU/mL，下同），振蕩混勻，迅速傾入均勻放置了3 個牛津杯（直徑6 mm）的無菌培養皿（直徑9 cm）中，待培養基凝固后取出牛津杯，吸取4 種待測ZSEOs樣液各100 μL，分別注入相應標記孔中。分別以等體積95%乙醇溶液和0.5 mg/mL CHX溶液作為陰性對照和陽性對照。將培養皿置于37 ℃厭氧培養24 h，觀察并記錄抑菌圈直徑。實驗獨立重復3 次，結果取平均值。

1.3.3.3 MIC和MBC的測定

采用肉湯微量稀釋法[17]測定ZSEOs對3 種致齲菌的MIC和MBC。首先，將ZSEOs用BHI液體培養基連續二倍稀釋至終質量濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 mg/mL。吸取100 μL菌懸液和100 μL含不同質量濃度ZSEOs的BHI液體培養基加入96 孔板中，每個質量濃度6 個復孔。以等體積BHI液體培養基為陰性對照組，以等體積0.5 mg/mL CHX為陽性對照組。空白對照組中不添加菌液。將96 孔板于37 ℃厭氧培養24 h。然后每孔加入40 μL INT染劑（質量分數0.02%，下同）。在微生物存在的情況下，INT指示劑的顏色將從透明變為粉紅色或紅色[17]。MIC為加入INT染劑后微孔中溶液不變色的最低ZSEOs劑量。然后從所有未變色的微孔中分別吸取10 μL混合培養物，分別對應加入100 μL含不同質量ZSEOs的新鮮BHI液體培養基中，37 ℃厭氧培養24 h后加入20 μL INT染劑進行第二次INT染色。MBC為加入INT染劑不引起微孔中溶液變色的最低ZSEOs劑量。

1.3.3.4 致齲菌生長曲線的測定

由抑菌圈直徑及MIC、MBC結果篩選出抑菌活性最優的青花椒精油（ZSXEO）。根據Lei Hong等[3]的方法作適當修改，通過測定致齲菌生長曲線，初步探討ZSXEO對3 種致齲菌生長的影響。于96 孔板中，將菌懸液與新鮮BHI液體培養基按照體積比1∶10混合，于37 ℃厭氧培養。在細菌生長的延遲期和對數生長期分別向培養基中加入終質量濃度為MIC的ZSXEO。繼續培養，每隔2 h采用酶標儀測定630 nm波長處的光密度值OD630nm，繪制生長曲線。陽性對照組中將ZSXEO替換為CHX（0.5 mg/mL），陰性對照組中不添加ZSXEO。

1.3.3.5 菌體微觀結構觀察

通過觀察ZSXEO處理后3 種致齲菌的形態變化，初步探討ZSXEO的抗菌機理。參考Khaleda等[18]報道的方法并作適當修改。將無菌細胞爬片置于24 孔板底，每孔加入1.5 mL BHI液體培養基和0.5 mL菌懸液，37 ℃厭氧培養24 h。觀察到細菌附著生長于玻片上后，棄去上清液并用0.01 mol/L pH 7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗。用BHI液體培養基將ZSXEO稀釋至MIC，取2 mL稀釋液加入孔板，分別以等體積BHI培養基和CHX溶液（0.5 mg/mL）為陰性對照組和陽性對照組，37 ℃厭氧培養24 h。用PBS洗滌載菌玻片2 次，室溫干燥后置于Gluta固定液（電子顯微鏡專用，2.5%）中固定4 h。棄上清液，PBS洗滌2 次，依次加入35%（體積分數，后同）、50%、75%、90%乙醇溶液和無水乙醇進行梯度脫水，而后加入叔丁醇脫去乙醇，30 min/次。最后，用陰極噴涂鍍金，在20.0 kV加速電壓下用SEM觀察菌體形態變化。

1.4 數據處理與分析

實驗設置3 個平行，數據采用Excel 2019軟件進行處理，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS Statistics 22.0軟件進行單因素方差分析，采用Bonferroni檢驗進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。采用GraphPrism 9軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 ZSEOs的得率

采用水蒸氣蒸餾法對產自重慶江津、貴州德江、四川金陽和云南昭通的青花椒進行精油提取，ZSEOs得率分別為（5.21±0.15）%、（7.27±0.03）%、（6.61±0.36）%和（10.21±0.22）%，均為淡黃色油狀液體。

2.2 ZSEOs的化學組成

重慶江津（ZS1EO）、貴州德江（ZS2EO）、四川金陽（ZS3EO）和云南昭通（ZS4EO）4 個產地的ZSEOs中相對含量在0.1%以上的化學成分分別有63、64、59 種和63 種，分別占精油總量的97.49%、97.65%、96.99%和98.05%（表1）。所有ZSEOs樣品中均富含芳樟醇（18.86%～22.00%）、檸檬烯（9.56%～14.84%）、β-月桂烯（5.79%～12.70%）、檜烯（5.49%～8.93%）和β-蒎烯（3.33%～6.41%）。其次，橙花叔醇在ZS1EO（4.80%）、ZS2EO（4.09%）、ZS3EO（3.00%）中相對含量較高而在ZS4EO中相對含量較低（0.14%），ZS4EO中β-側柏酮（6.19%）的相對含量較高。

表1 我國4 個產地青花椒精油的化學成分GC×GC-TOFMS分析結果Table 1 Chemical compositions of ZSEOs from four different production areas as determined by GC × GC-TOFMS

續表1

青花椒的精油提取率和化學組分間的差異可能與青花椒的品種、產地、提取與檢測方法等因素有關[19]。Li Ren等[4]采用同時蒸餾萃取法從西雙版納青花椒果皮中提取精油，精油得率為4.8%，經氣相色譜-質譜聯用鑒定出25 種化合物（98.29%），主要成分為芳樟醇（79.00%）、檸檬烯（4.97%）和β-側柏烯（4.29%）。此外，麻琳等[20]采用水蒸氣蒸餾法從江津青花椒果皮中提取精油，精油得率為2.4%，經氣相色譜-質譜聯用鑒定出34 種化合物（99.55%），其中R-樅松油烯（36.51%）和芳樟醇（21.60%）含量豐富。本研究中4 個產地的ZSEOs中均含有芳樟醇（18.86%～22.00%）和檸檬烯（9.56%～14.84%），但未檢出β-側柏烯和R-樅松油烯。

芳樟醇（C10H18O）是一種廣泛存在于植物精油中的單萜烯醇，對P.aeruginosa、S. aureus等多種微生物具有抑菌活性[21]。Liu Ying等[11]研究表明S. sobrinus對檸檬烯較為敏感。化合物分子的電荷密度與其抑菌活性密切相關[22]。芳樟醇中負電荷主要集中在氧原子和碳原子上，且羥基官能團上氧原子的電荷密度（密里根常數為-0.520 8）大于其他原子，因此更容易發生親電反應，成為活性中心與菌體結合，進而發揮抑菌作用。檸檬烯（C10H16）分子結構中有2 個C＝C，雙鍵相鄰甲基上的碳原子密里根常數分別為-0.420 4和-0.352 1，電荷密度較大，具有成為菌體結合位點的可能性。此外，亦有體外研究表明β-石竹烯（0.26%～0.90%）可有效抑制S. mutans的生長[23]。值得一提的是，4 個產地青花椒精油中鑒定得到的其他組分，如α-蒎烯[24]（1.65%～2.59%）、(Z)-芳樟醇氧化物（呋喃）[25]（0.40%～1.13%）、(-)-氧化石竹烯[26]（0.21%～0.45%）等也被報道過具有良好的抑菌效果，表明本研究中含以上活性成分的ZSEOs也可能具有良好的抑菌活性。

2.3 ZSEOs的抑菌活性

2.3.1 抑菌圈直徑

由表2和圖2可知，受試ZSEOs對S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus的抑菌圈直徑范圍分別為13.41～17.73、15.18～20.95 mm和11.61～15.97 mm。S. sanguinis對ZSEOs的耐受力較弱，而S. sobrinus對ZSEOs的耐受力較強。值得注意的是，ZS1EO處理組的抑菌圈直徑均為最大值。ZS1EO對S. mutans的抑菌圈直徑（（17.73±0.22）mm）大于其對S. sobrinus的抑菌圈直徑（（15.97±0.70）mm），但差異無統計學意義（P＞0.05）。ZS1EO對S. sanguinis的抑菌圈直徑最大，為（20.95±0.40）mm，顯著大于其他精油處理組和陽性對照組（P＜0.05）。本研究中，95%乙醇溶液處理對3 種致齲菌幾乎均無抑制作用，相應抑菌圈直徑與各ZSEOs處理組相比具有顯著差異（P＜0.05）。抑菌圈測定結果初步表明，ZSEOs對3 種致齲菌均有一定的體外抑制效果，其中ZS1EO的抑菌活性最為突出。

表2 青花椒精油對3 種致齲菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of inhibition zones of ZSEOs against three cariogenic bacteria mm

圖2 青花椒精油對3 種致齲菌的抑菌圈Fig. 2 Inhibition zones of ZSEOs against three cariogenic bacteria

2.3.2 4 種ZSEOs的MIC和MBC

如表3所示，4 種ZSEOs對S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus的MIC范圍分別為1～2、0.5～2 mg/mL和1～4 mg/mL，MBC的范圍分別為1～4、1～4 mg/mL和2～8 mg/mL。ZSEOs對3 種鏈球菌有不同程度的抑制作用，其中ZS1EO的抑菌效果最優，此結果與抑菌圈實驗結果基本一致。ZS1EO對S. sanguinis的MIC（0.5 mg/mL）最小，對S. mutans和S. sobrinus的MIC均為1 mg/mL。此外，S. sobrinus對ZSEOs的耐受力相對較強，ZS1EO對S. sobrinus的MBC為2 mg/mL。抑菌圈實驗結果、MIC和MBC實驗結果表明，4 種精油中ZS1EO對3 種致齲菌的抑菌活性最為突出。

表3 ZSEOs對3 種致齲菌的MIC和MBCTable 3 MIC and MBC of ZSEOs against three cariogenic bacteria

植物精油對致齲菌的抑菌活性可分為3 個程度：強（MIC＜0.1%（體積分數，下同））、中等（MIC≤1.0%）和弱（MIC＞1.0%）[27]。基于此標準，在本研究中，ZS1EO（密度為0.83 g/mL）對S. sanguinis（MIC＝0.5 mg/mL）具有較強的抑制作用，對S. mutans（MIC＝1 mg/mL）和S. sobrinus（MIC＝1 mg/mL）具有中等的抑菌活性。Lemes等[28]評估了來檬（Citrus aurantifolia）果皮精油對6 種致齲菌的抑制作用，結果顯示來檬果皮精油對S. sanguinis和S. sobrinus的MIC分別為100 μg/mL和200 μg/mL，抑菌活性中等；對S. mutans的MIC為20 μg/mL，抑菌活性最強。不同精油對同種鏈球菌MIC與MBC的不同基本歸因于精油化學組成間的差異。同種精油對不同鏈球菌抑菌活性的差異可能和細菌應激后的反應調節機制以及精油發揮抑菌作用的機制差異有關。綜上，由于ZS1EO的抑菌活性最為明顯，因此選擇ZS1EO進行后續實驗。

2.3.3 致齲菌的生長曲線

ZS1EO對S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus生長曲線的影響如圖3所示。致齲菌生長經歷了3 個明顯的階段，即延遲期、對數生長期和穩定期。S. mutans和S. sanguinis的對數生長期在4 h出現，持續8 h后進入穩定期。S. sobrinus的對數生長期在2 h出現，8 h后進入穩定期。在延遲期將MIC ZS1EO與細菌共同孵育，隨著時間的延長，3 種致齲菌的OD值均與各自初始OD值持平，表明菌體停止增殖。于對數生長期初始階段加入MIC ZS1EO，3 種鏈球菌的OD值均呈下降趨勢。隨著ZS1EO作用時間的延長，S. mutans和S. sanguinis的生長幾乎完全被抑制。

圖3 MIC ZS1EO對3 種致齲菌生長曲線的影響Fig. 3 Effect of MIC ZS1EO on the growth curves of three cariogenic bacteria

生長曲線可以部分反映細菌在一定環境下的生長和增殖情況[21]。本實驗結果表明，在細菌生長的延遲期和對數生長期初始階段添加MIC ZS1EO均可導致3 種致齲菌停止增殖，ZS1EO對3 種致齲菌的抑菌活性較強。此結果與Lei Hong等[3]報道的花椒精油對E. coli生長的抑制效果類似，在延遲期和對數生長期加入0.5×MIC（12 mg/mL）精油，E. coli的生長均會受到影響。

2.3.4 致齲菌微觀結構觀察結果

通過SEM觀察3 株致齲菌經MIC ZS1EO處理24 h后的形態變化，初步探討ZS1EO的抑菌機制，結果如圖4所示。與陰性對照組相比，處理后的細菌菌體發生了明顯的形態學改變。陰性對照組鏈球菌細胞膜表面整齊、光滑、致密，鏈狀結構完整。然而，經ZS1EO處理后的3 種致齲菌斷鏈現象明顯；菌體細胞呈現出明顯的細胞膜形狀異常，細胞膜出現凹陷、破裂和皺縮；菌體相互黏附。此結果與陽性對照組的結果相似。值得注意的是，與其他菌株相比，S. sanguinis菌株對ZS1EO的耐受力最弱，菌體破壞程度更明顯，與抑菌圈實驗和MIC、MBC實驗結果相吻合。以上結果表明，ZS1EO對3 株致齲菌抑制作用由強到弱依次為S. sanguinis、S. mutans、S. sobrinus。

圖4 3 種致齲菌的SEM圖像（×20 000）Fig. 4 SEM micrographs of three cariogenic bacteria (× 20 000)

植物精油的親脂性使精油能夠穿過細菌的細胞膜和線粒體膜，破壞細菌的膜結構，使膜通透性增強，細菌細胞內容物外泄，從而導致菌體形態的改變[29]。陳夢玲等[30]研究發現經2×MIC（0.5%）牛至精油處理后，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）表面破裂、外膜剝落，最終導致菌體死亡。SEM觀察結果表明，ZS1EO可以通過破壞3 種致齲菌的鏈狀結構與細胞膜完整性，使菌體產生不可逆損傷，從而發揮其抑菌作用。

3 結 論

本實驗利用GC×GC-TOFMS技術分析了4 個產地ZSEOs的化學組成，并評估了ZSEOs對3 種常見致齲菌的體外抑菌活性。研究結果表明，受試ZSEOs的主要成分為芳樟醇（18.86%～22.00%）、檸檬烯（9.56%～14.84%）、β-月桂烯（5.79%～12.70%）、檜烯（5.49%～8.93%）和β-蒎烯（3.33%～6.41%）。4 個產地的ZSEOs對S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus生長均有不同程度的抑制效果，其中ZS1EO的抑菌活性最強。ZS1EO對3 種致齲菌的抑菌活性強度：S. sanguinis＞S. mutans＞S. sobrinus。此外，精油處理后3 種致齲菌鏈狀結構的破壞以及細胞膜凹陷、破損所致菌體的不可逆損傷可以初步解釋ZS1EO發揮其抑菌活性的機制。鑒于此，作為我國傳統香辛料使用的青花椒可能是一種潛在的齲病抗菌劑的來源。本研究僅評價了ZSEOs對3 種致齲菌的體外抑菌活性，ZSEOs的抑菌成分及其抑菌機制有待進一步研究。