基于不同消化階段探究多酚對葉黃素吸收的促進(jìn)作用

肖亞茹，張鐘元,*，聶梅梅，李大婧，徐亞元，戴竹青，馮 蕾，張國棟

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；3.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江蘇 南京 210014；4.江蘇艾蘭得營養(yǎng)品有限公司，江蘇 靖江 214500）

類胡蘿卜素是廣泛存在于自然界中的色素，具有抗氧化、抗癌、預(yù)防心血管類疾病、預(yù)防眼部疾病等重要的生理功能[1]。其中，葉黃素和玉米黃質(zhì)是存在于人眼視網(wǎng)膜黃斑的類胡蘿卜素，可抵抗眼部氧化、光損傷，對眼睛起重要的保護(hù)作用[2-3]。但類胡蘿卜素不易吸收，食用富含類胡蘿卜素的食物和膳食補(bǔ)充劑并不意味著人體就能夠吸收并利用大量的類胡蘿卜素，已有報(bào)道表明食品基質(zhì)中類胡蘿卜素最終可被人體利用的比例低于5%。這是由于類胡蘿卜素的吸收過程復(fù)雜。首先，類胡蘿卜素從食物基質(zhì)中釋放出來，然后在消化過程中并入腸道的混合膠束中，通過被動(dòng)擴(kuò)散過程被腸道上皮細(xì)胞吸收，經(jīng)淋巴循環(huán)運(yùn)輸至組織器官[4]。在整個(gè)吸收過程中，類胡蘿卜素種類和結(jié)構(gòu)、促進(jìn)和拮抗因子等諸多因素顯著影響類胡蘿卜素生物利用度[5-6]。

在日常飲食中類胡蘿卜素通常與蛋白質(zhì)、脂肪等常量營養(yǎng)素及膳食纖維、礦物質(zhì)、多酚等微量營養(yǎng)素一同被消化吸收，這些營養(yǎng)素與類胡蘿卜素相互作用，能夠影響后者在人體的吸收[6]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)多酚可以調(diào)控類胡蘿卜素腸道吸收、代謝過程。體外研究發(fā)現(xiàn)柑橘黃烷酮、花青素能有效地促進(jìn)人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞吸收β-胡蘿卜素、葉黃素、β-隱黃質(zhì)[7-9]。研究表明小鼠經(jīng)槲皮素干預(yù)后β-胡蘿卜素在小鼠肝臟中的積累增加[10]；同時(shí)喂食橙皮苷（hesperidin， HES-G）和β-胡蘿卜素顯著增加了蒙古沙鼠血漿中視黃醇的含量[11]。但現(xiàn)有研究主要集中在多酚對類胡蘿卜素吸收影響的宏觀調(diào)控上，鮮有多酚調(diào)控類胡蘿卜素吸收的機(jī)制研究。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)柑橘黃烷酮通過活化細(xì)胞受體蛋白B類I型清道夫受體（scavenger receptor class B type I，SR-BI）、CD36的表達(dá)促進(jìn)β-胡蘿卜素細(xì)胞吸收[12]，但多酚對葉黃素的吸收機(jī)制尚不明確。并且目前對類胡蘿卜素吸收代謝的研究都是分析單一的某一個(gè)階段，鮮有對類胡蘿卜素吸收的各個(gè)階段同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以課題組前期所進(jìn)行的柑橘黃烷酮對β-胡蘿卜素腸道吸收代謝研究為基礎(chǔ)，對多酚在葉黃素不同消化階段的影響進(jìn)行詳細(xì)研究，通過構(gòu)建體外消化、細(xì)胞和小鼠模型，研究多酚對葉黃素體外消化、細(xì)胞吸收及體內(nèi)吸收3 個(gè)階段的影響，多階段探究多酚對葉黃素吸收的影響，有利于全面闡明多酚對葉黃素吸收代謝的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性C57BL/6小鼠（6～8 周）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001；使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2017-0007。

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株（Caco-2）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

葉黃素（純度≥80%）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、姜黃素、花青素、槲皮素（純度≥98%）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰酶（250 U/mg） 上海源葉科技有限公司；橙皮素（hesperetin，HES）、HES-G、黃腐酚（純度≥98%） 美國Sigma公司；豬膽鹽北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0、0.01 mol/L）、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 美國Gibco Laboratories公司；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6 孔Transwell（聚碳酸酯膜）細(xì)胞培養(yǎng)板美國康寧公司；抗SR-BI抗體、抗β-actin抗體、抗尼曼-匹克C1型類蛋白（Niemann-Pick C1L1，NPC1L1）抗體、抗CD36抗體、二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G） 美國Cell Signaling Technology公司；膽固醇、油酸、甘油酯、亞油酸、正己烷、丙酮、無水乙醇、三氯甲烷均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；體外消化儀 澳大利亞NI公司；FE20 pH計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BS224S電子分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器公司；DW-86L828型超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、D10氮?dú)獯祾邇x 杭州奧盛儀器有限公司；組織研磨機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、MZS90納米粒度測定儀 英國馬爾文儀器有限公司；XD-202倒置顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司；BHC-1300IIA/B2型生物潔凈安全柜蘇州凈化設(shè)備有限公司；TDL-80-2C低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；ERS-2上皮跨膜細(xì)胞電阻儀美國密理博公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葉黃素膠束制備

葉黃素膠束的制備參考文獻(xiàn)[12]的方法并略作修改。取56.8 mg葉黃素用甲醇溶解并定容至50 mL，制得2 mmol/L葉黃素貯備液。取一定體積的葉黃素貯備液與不同食物組分溶解于三氯甲烷，用氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)溶劑后重懸于PBS中，渦旋10 min，超聲30 min，得含有不同食物組分（終濃度2.5 mmol/L單油酰甘油、2.5 mmol/L油酸、12 mmol/L牛磺膽酸鈉、0.5 mmol/L膽固醇、2.5 mmol/L亞油酸和1 mmol/L EGC、EGCG、黃腐酚、HES、HES-G、花青素、姜黃素、槲皮素）的葉黃素膠束，其中葉黃素的濃度為200 μmol/L。以未加入食物組分的葉黃素膠束為對照組。

1.3.2 葉黃素生物可及性測定

生物可及性是指在消化過程中從食物基質(zhì)中釋放出來的有可能被機(jī)體攝取和吸收的活性物質(zhì)比例。如類胡蘿卜素的生物可及性通常指攝入的類胡蘿卜素占膠束的比例[13]。葉黃素生物可及性測定參考文獻(xiàn)[14]的方法并略作修改。將裝有5 mL 1.3.1節(jié)葉黃素膠束消化管置于體外消化儀中，采用自動(dòng)進(jìn)樣器加入10 mL胃液（140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、10 mmol/L CaCl2·2H2O、3.5 mmol/L KH2PO4）和2 mL質(zhì)量濃度3.2 mg/mL的胃蛋白酶溶液（用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 2），設(shè)置消化溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、消化時(shí)間1 h，模擬胃消化階段。

胃消化階段結(jié)束后用1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)至pH 7，采用自動(dòng)進(jìn)樣器加入20 mL腸液（含5 mg/mL胰酶、31.13 mg/mL膽鹽的0.1 mol/L NaHCO3溶液），設(shè)置消化溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、消化時(shí)間2 h，模擬腸消化階段。

體外消化液葉黃素提取參考文獻(xiàn)[15]并略作修改。取10 mL腸消化液，離心（8 000 r/min、10 min）取上清液，加入等體積正己烷-乙醇-丙酮溶液（體積比為2∶1∶1）萃取，輕微振蕩，靜置分層，反復(fù)萃取至下層無色，合并萃取液，用氮?dú)獯祾邇x吹干有機(jī)溶劑后甲醇復(fù)溶，采用高效液相色譜測定葉黃素質(zhì)量濃度。

葉黃素的生物可及性按下式計(jì)算。

式中：ρ1為消化液中葉黃素質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為消化液體積/mL；ρ2為初始葉黃素膠束質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V2為初始葉黃素膠束體積/mL。

1.3.3 粒徑、ζ-電位的測定

取1.3.1節(jié)制備的膠束溶液，用PBS稀釋10 倍后利用納米粒徑測定儀于室溫條件下測定平均粒徑和ζ-電位。

1.3.4 細(xì)胞吸收葉黃素水平的測定

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱（5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2、37 ℃，下同）培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用含0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液將貼壁細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞懸液后以2×105個(gè)/mL接種至含有0.5 mL完全培養(yǎng)基的Transwell的聚碳酸酯膜上，下層加入1.0 mL 高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)21 d后備用[16]。采用ERS-2上皮跨膜細(xì)胞電阻儀測定各孔細(xì)胞單層膜跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）確定其完整性，當(dāng)TEER大于500 Ω·cm2時(shí)可用于細(xì)胞吸收葉黃素水平的測定[17]。Caco-2細(xì)胞吸收葉黃素前，用PBS清洗2 遍，向細(xì)胞單層膜中分別加入SR-BI蛋白抑制劑BLT-1（block lipid transport-1）、NPC1L1蛋白抑制劑依澤替米貝（ezetimibe，EZT）、CD36蛋白抑制劑磺基-N-琥珀酰亞胺酯油酸（sulfo-N-succinimidyloleat，SSO），蛋白抑制劑濃度均為30 μmol/L，預(yù)處理30 min后，在上層加入0.5 mL葉黃素膠束，在下層加入1.0 mL高糖DMEM培養(yǎng)基，以不添加蛋白抑制劑為對照組，將Transwell置于培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)5 h[18]。本實(shí)驗(yàn)選擇的培養(yǎng)時(shí)間代表正常生理狀態(tài)下通過腸道吸收時(shí)間。孵育結(jié)束后吸棄上、下層培養(yǎng)液，用含有5 mmol/L牛黃膽酸鈉PBS清洗細(xì)胞單層膜兩遍，以去除附著在表面的葉黃素，用細(xì)胞刮子小心地刮取細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮于1 mL PBS中。

葉黃素的提取[12]：取1 mL懸有細(xì)胞的PBS，加入等體積氯仿-甲醇（體積比2∶1）萃取劑輕微振蕩，靜置分層，反復(fù)萃取至下層（水相）無色，合并萃取液，用氮?dú)獯祾邇x吹干有機(jī)溶劑后用200 μL無水甲醇復(fù)溶，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析葉黃素質(zhì)量濃度水平以表征細(xì)胞吸收葉黃素水平。

1.3.5 蛋白免疫印跡

總蛋白的提取：取1.3.4節(jié)刮取的細(xì)胞樣品，加入2 mL PBS重懸，離心（12 000 r/min、10 min）得細(xì)胞樣品[19]。加入適量蛋白裂解液，置于冰上裂解細(xì)胞1 h，離心（12 000 r/min、10 min）后棄去上清液，得到總蛋白樣品。參考二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒說明書測定樣品中蛋白質(zhì)量濃度。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）與轉(zhuǎn)膜：上樣量為20 μg進(jìn)行SDS-PAGE；采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。將PVDF膜置于5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）脫脂牛奶封閉液中，于37 ℃ 培養(yǎng)箱中封閉1.5 h，采用TBST清洗3 次，每次10 min。

抗體孵育：將PVDF膜置于一抗溶液（稀釋比例均為1∶1 000）中孵育，4 ℃振蕩12 h，用TBST洗滌3 次，每次10 min，然后置于二抗溶液（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3 次，每次10 min。

顯色：加入1 mL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液，避光孵育4 min，置于化學(xué)發(fā)光成像儀曝光。采用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組

將小鼠適應(yīng)性飼喂7 d后隨機(jī)分為10 組，每組10 只。各組小鼠按照100 μL/d分別灌胃1.3.1節(jié)不同葉黃素膠束，灌胃7 d后，最后1 次灌胃4 h后眼球取血并用抗凝管收集，然后立即處死小鼠并取肝臟組織[20]，將盛有小鼠血液的抗凝管于冰上靜置4 h，然后1 500 r/min離心15 min，取上清液得到血漿樣品。取80 mg肝臟組織于離心管，加入0.8 mL生理鹽水勻漿。向勻漿后的混合物中加入2 mL三氯甲烷-甲醇溶液（體積比2∶1），混勻后再加入1 mL正己烷溶液，渦旋混勻后3 000 r/min離心5 min，移取上層清液。取下層混合物重復(fù)上述提取步驟，合并兩次上層清液，用N2吹干后加入150 μL無水甲醇復(fù)溶，待HPLC分析葉黃素水平。在裝有200 μL血漿樣品的離心管中加入1 mL的正己烷溶液，渦旋混勻后3 000 r/min離心5 min，移取上層清液。取下層混合物重復(fù)上述步驟，合并兩次上層清液，N2吹干后加入150 μL無水甲醇復(fù)溶，待HPLC分析葉黃素質(zhì)量濃度。

1.3.7 HPLC分析葉黃素水平

參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[21]測定葉黃素水平。色譜柱為YMC-C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；DAD檢測器；檢測波長450 nm；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 ℃。流動(dòng)相A：水-甲基叔丁基醚-甲醇（體積比5∶25∶70）；流動(dòng)相B：水-甲基叔丁基醚-甲醇（體積比5∶85∶10）；梯度洗脫程序：0～4.5 min（95%～80% A）；4.5～12.5 min（80%～50% A）；12.5～18 min（50%～25% A）；18～24 min（25%～5% A）；24～30 min（5% A）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin軟件作圖。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚對葉黃素生物可及性的影響

類胡蘿卜素生物可及性是指類胡蘿卜素?cái)z入混合膠束中可被小腸吸收的類胡蘿卜素比例[22]。本實(shí)驗(yàn)以亞油酸為陽性對照，首先研究了多酚對葉黃素生物可及性的影響。如圖1所示，多酚處理對葉黃素生物可及性起到顯著的提高作用，與單獨(dú)葉黃素（CK）組相比，葉黃素生物可及性提高了3.3～7.0 倍（P＜0.05），其中EGCG處理組效果最為顯著，葉黃素生物可及性高達(dá)24.3%，較單獨(dú)葉黃素組提高了7.0 倍（P＜0.05），較亞油酸組提高了2.0 倍。

圖1 多酚對葉黃素生物可及性的影響Fig. 1 Effects of polyphenols on the bioaccessibility of lutein

2.2 多酚對葉黃素膠束性能的影響

為了進(jìn)一步研究上述體外消化形成的膠束性能，對形成的膠束的平均粒徑、ζ-電位進(jìn)行測定。平均粒徑反映膠束顆粒尺寸，ζ-電位反映粒子表面電荷。本實(shí)驗(yàn)探究了多酚對葉黃素膠束性能的影響，結(jié)果如表1所示。與單一的葉黃素膠束相比，多酚的加入可使葉黃素膠束的平均粒徑顯著降低。此外，多酚的加入可使葉黃素膠束溶液ζ-電位絕對值增加。ζ-電位絕對值越高，表明液滴中同種電荷含量較高，可防止液滴中大分子物質(zhì)聚集。因此，多酚處理組葉黃素膠束溶液較其他組穩(wěn)定。

表1 多酚對葉黃素膠束性能的影響Table 1 Effects of polyphenols on properties of lutein micelles

2.3 多酚對細(xì)胞吸收葉黃素的影響

不同多酚對細(xì)胞吸收葉黃素的影響如表2所示，結(jié)果表明多酚可使細(xì)胞吸收的葉黃素水平提高3.2%～30.4%，其中EGC和EGCG等提高效果較為明顯。細(xì)胞膜蛋白NPC1L1、SR-BI、CD36是參與類胡蘿卜素細(xì)胞吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[23]，本實(shí)驗(yàn)研究了NPC1L1、SR-BI、CD36蛋白抑制劑對細(xì)胞吸收葉黃素水平的影響，結(jié)果表明，加入NPC1L1、SR-BI、CD36蛋白抑制劑降低了細(xì)胞吸收葉黃素水平。與對照組相比，加入BLT-1可使細(xì)胞吸收葉黃素水平降低3.4%～24.6%；加入EZT使細(xì)胞吸收葉黃素水平降低2.7%～28.5%；加入SSO使細(xì)胞吸收葉黃素水平降低2.8%～23.7%。這表明3 種蛋白均參與多酚促進(jìn)細(xì)胞吸收葉黃素過程，3 種蛋白的抑制劑使相應(yīng)蛋白表達(dá)水平降低，進(jìn)而使葉黃素轉(zhuǎn)運(yùn)通路受到影響。

表2 多酚對細(xì)胞吸收葉黃素水平的影響Table 2 Effects of polyphenols on the cellular absorption of lutein μg/L

2.4 多酚對葉黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響

進(jìn)一步研究了多酚對細(xì)胞膜蛋白NPC1L1、SR-BI、CD36蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖2所示。SR-BI是細(xì)胞吸收葉黃素的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。與對照組相比，多酚處理組顯著提高了NPC1L1、SR-BI、CD36 3 種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，這進(jìn)一步表明3 種蛋白均參與多酚促進(jìn)細(xì)胞吸收葉黃素過程，與2.3節(jié)3 種蛋白抑制劑作用下細(xì)胞吸收葉黃素的結(jié)果相互印證。其中CD36蛋白表達(dá)水平增加最多，較對照組提高4.12～7.64 倍（P＜0.05），SR-BI蛋白次之，較對照組提高10.4%～139.6%，NPC1L1蛋白最次，較對照組提高1.2%～79.6%。不同種類多酚對于3 種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)影響不同，姜黃素最利于促進(jìn)NPC1L1蛋白、SR-BI蛋白的表達(dá)。

圖2 多酚對葉黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of polyphenols on the expression of lutein transporter proteins

2.5 多酚對葉黃素小鼠體內(nèi)代謝的影響

利用體外消化獲得的葉黃素膠束溶液灌胃小鼠，研究不同多酚對葉黃素體內(nèi)吸收的影響。如圖3所示，加入不同種類多酚均可使小鼠肝臟、血漿中葉黃素水平顯著增加（P＜0.05）。與對照組相比，多酚處理組對葉黃素肝臟吸收的作用效果顯著，與對照組相比提高2.36～7.27 倍，黃腐酚促進(jìn)作用最為顯著。與對照組相比，多酚處理組對血漿中葉黃素質(zhì)量濃度的影響顯著，與對照組相比提高11.1%～66.7%，其中黃腐酚的作用效果最明顯，與亞油酸組相比提高54.5%（P＜0.05）。

圖3 多酚對葉黃素小鼠體內(nèi)吸收的影響Fig. 3 Effect of polyphenols on the absorption of lutein in mice

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)多酚可以提高葉黃素的生物可及性，這與前期研究中柑橘黃烷酮可通過促進(jìn)β-胡蘿卜素樣品脂滴水解來提高β-胡蘿卜素生物可及性的結(jié)果[22]相一致。葉黃素生物可及性的提高可能與多酚促進(jìn)脂滴水解有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)多酚可以作為液體中穩(wěn)定脂滴的密集層，防止液滴收縮和合并[24]，尺寸較小的脂滴比表面積大，使胰脂肪酶更容易附著，促進(jìn)脂滴水解[12]。本研究中多酚通過吸附在脂滴表面，降低脂滴粒徑，促進(jìn)脂滴水解，進(jìn)而有利于葉黃素?fù)饺牖旌夏z束。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)多酚可以減小葉黃素膠束的粒徑和電位，使其更加穩(wěn)定，避免其在胃腸環(huán)境中發(fā)生氧化降解，從而增加其在體外的生物可及性[25]。除此之外，消化液中的蛋白質(zhì)可以和多酚形成共價(jià)復(fù)合物，這種共價(jià)復(fù)合物可以作為β-胡蘿卜素的乳化劑來提高β-胡蘿卜素乳化效果[26]，促進(jìn)膠束的形成。因此，含有酚羥基較多的EGC、EGCG、黃腐酚和HES在胃腸消化環(huán)境中更易與蛋白發(fā)生共價(jià)復(fù)合作用，進(jìn)而增強(qiáng)了葉黃素的乳化效果，提高了葉黃素的生物可及性[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)多酚可以顯著提高細(xì)胞吸收葉黃素水平（表2），其中EGCG的作用效果較為明顯，此結(jié)果與多酚誘導(dǎo)的葉黃素生物可及性的變化結(jié)果相一致（圖1），這可能是由于多酚可以降低葉黃素膠束平均粒徑（表1），這樣也有利于葉黃素透過細(xì)胞。此外，多酚與細(xì)胞膜上的蛋白及脂質(zhì)相互作用，激活靶蛋白調(diào)控細(xì)胞膜蛋白參與的信號(hào)通路[28]。通過本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，多酚可以促進(jìn)NPC1L1、SR-BI、CD36葉黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，不同種類多酚對蛋白表達(dá)的影響不同，這可能是多酚結(jié)構(gòu)的差異所導(dǎo)致。前期研究發(fā)現(xiàn)糖苷結(jié)構(gòu)利于活化SR-BI蛋白[23]。本研究中EGCG、HES-G中具有糖苷鍵，這兩種多酚對SR-BI的表達(dá)促進(jìn)作用顯著，與前期研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)黃腐酚和HES對SR-BI表達(dá)促進(jìn)作用顯著，可能是因?yàn)檫@兩種多酚具有獨(dú)特的甲氧基基團(tuán)，有利于活化SR-BI蛋白。另外，多酚促進(jìn)細(xì)胞吸收葉黃素還可能與多酚的抗氧化性有關(guān)，抗氧化性強(qiáng)可以抑制葉黃素的氧化變性，從而有利于細(xì)胞吸收葉黃素，而多酚的抗氧化性與酚羥基的數(shù)量呈正相關(guān)[29]，本研究中EGCG的酚羥基數(shù)量最多，加入EGCG后葉黃素在細(xì)胞吸收過程氧化降解最少（圖1），所以EGCG對葉黃素生物可及性影響最大。

最后，通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明多酚可以顯著提高葉黃素體內(nèi)吸收，黃腐酚對葉黃素體內(nèi)吸收的作用效果提升最為顯著。這可能是由于黃腐酚屬于查耳酮類，在血漿中會(huì)被快速吸收，2 h左右達(dá)到最大血漿濃度，可以更快的發(fā)揮生理功能[30-31]，促進(jìn)小鼠吸收代謝葉黃素。本研究發(fā)現(xiàn)多酚促進(jìn)葉黃素在小鼠體內(nèi)吸收的結(jié)果與多酚促進(jìn)葉黃素膠束化、細(xì)胞吸收的結(jié)果相一致，說明在多酚存在下，葉黃素乳化和腸道吸收都是調(diào)控葉黃素體內(nèi)累積的重要環(huán)節(jié)，但是不同種類多酚之間的作用有所差異。

4 結(jié) 論

多酚可在消化的不同階段促進(jìn)葉黃素的吸收。在形成膠束階段，多酚可以降低葉黃素溶液的平均粒徑并提高ζ-電位絕對值，從而提高葉黃素的乳化效果和生物可及性；在腸道細(xì)胞吸收階段，多酚可以提高SR-BI、NPC1L1和CD36蛋白的相對表達(dá)量，并促進(jìn)Caco-2細(xì)胞對葉黃素的吸收；小鼠體內(nèi)吸收代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多酚的加入可以使小鼠肝臟和血漿中葉黃素含量顯著增加。本研究結(jié)果可為科學(xué)補(bǔ)充葉黃素提供一種新思路，亦可為開發(fā)葉黃素復(fù)配營養(yǎng)劑提供理論參考。