生食三文魚源活的非可培養狀態副溶血弧菌誘導C57BL/6J小鼠腸道炎性損傷

王潤東，鄧義佳，張宇昊，李學鵬，孟玉瓊，馬 睿，勵建榮,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；3.青海大學生態環境工程學院，青海 西寧 810016）

生食三文魚因具有營養物質豐富、無需煮熟、風味獨特等特點而深受消費者的青睞。市場流通的三文魚原料大多為冷鏈進口，其在生長水域、長途運輸和存儲加工等環節極易受到副溶血弧菌的污染[1-3]。為了消減副溶血弧菌等致病菌的威脅，生食三文魚加工中會使用次氯酸鈉對食品原料和生產環境進行消毒[4]，但現有研究發現次氯酸鈉能夠誘導大腸桿菌[5]、沙門氏菌[6]、單核細胞增生李斯特菌[7]和副溶血弧菌[8]等應激轉化為活的非可培養（viable but non-culturable，VBNC）狀態，處于VBNC狀態的微生物仍保持一定的新陳代謝活性，且保留毒力基因，常規方法無法培養，易造成漏檢產品流入市場，一旦環境適宜生長，VBNC狀態菌株會迅速復蘇，成為生食三文魚的新安全隱患[9-11]。

目前針對VBNC狀態副溶血弧菌的研究主要集中在檢測方法、誘導條件和復蘇過程[12-14]方面，對VBNC狀態菌株致病性的研究較少。Zhong Huamin等[15]采用疊氮溴化丙錠聯合環介導等溫核酸擴增法證明VBNC狀態副溶血弧菌仍具有表達耐熱相關溶血素（thermostable related hemolysin，trh）和腸毒素能力；Mougin等[16]也證實副溶血弧菌在VBNC狀態下能夠表達生物被膜相關基因，增加其黏附在食品及其器皿表面的機率；Wong等[17]研究指出，雖然VBNC狀態副溶血弧菌產生毒性蛋白和黏附素的能力減弱，但仍能造成腸上皮細胞模型的組織擦拭性損傷。然而，以上研究都是通過毒力因子和體外實驗評估副溶血弧菌VBNC狀態的致病性，對于VBNC狀態菌株在體內的真實危害尚不清楚。機體感染副溶血弧菌毒力株的典型癥狀是急性胃腸炎，病原菌進入宿主腸道后依靠菌體和毒力因子發揮致病力，菌體黏附在腸壁上具有侵襲力，破壞腸組織結構完整性，代謝產生的溶血毒素、脲酶和毒力蛋白具有細胞毒性，引發溶血和炎癥反應，最終造成宿主腸道炎性損傷[18-19]。因此，VBNC狀態副溶血弧菌是否通過上述途徑感染機體尚待闡明。

本課題組前期從市售生食三文魚中復蘇分離得到一株副溶血弧菌VpRS1，該菌株耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，tdh）基因陰性，trh基因和不耐熱溶血素（thermolabile hemolysin，tlh）基因陽性，與標準毒力株ATCC17802攜帶相同的溶血毒素基因家族，具有致病性，但VBNC-VpRS1致病力尚不清楚。因此，本研究以生食三文魚源VBNC-VpRS1菌株為研究對象，Vp17802為致病陽性對照株，分別構建副溶血弧菌誘導的C57BL/6J小鼠感染模型，觀察小鼠臨床癥狀，檢測其回腸、盲腸和結腸內副溶血弧菌定植量、腸組織形態和病理變化、腸屏障功能、通透性及細胞因子等指標，探究副溶血弧菌VBNC-VpRS1菌株對小鼠的致病力，識別VBNC狀態菌株侵襲的靶器官和特征性感染癥狀，旨在為精準評估生食三文魚安全風險和感染病原菌后治療提供理論參考。

1 材料與試劑

1.1 動物、材料與試劑

無特定病原菌級（SPF）7 周齡C57BL/6L小鼠30 只，體質量（18±2）g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2018-06073，動物房溫度（22±3）℃、相對濕度（40±5）%，12 h日光燈明暗交替循環，自由進食和飲水，適應性飼養7 d。

副溶血弧菌：標準毒力株ATCC17802（Vp17802，tdh-/trh＋/tlh＋）和生食三文魚分離株VpRS1（VpRS1，tdh-/trh＋/tlh＋）為渤海大學大宗水產品貯藏加工與安全控制團隊保存。

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基（thiosulfate citrate bile salts sucrous，TCBS）、腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI） 北京奧博星生物技術有限公司；萘啶酮酸 美國西格瑪公司；pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、氯化鈉（NaCl）、次氯酸鈉（NaClO）、多聚甲醛 北京索萊寶科技有限公司；病理組織染色液、脂多糖測試盒、二胺氧化酶測試盒、D-乳酸試劑盒、免疫組化試劑盒、細胞因子酶聯免疫吸附試驗試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol RNA提取劑、cDNA反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒 南京諾唯贊生物科技有限公司；化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-2N超級潔凈工作臺 北京市東聯哈爾儀器制造有限公司；SPX-25生化培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；5804R高速冷凍離心機、ABI stePone Plus聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國艾本德公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；Imark酶標儀、CFX96型熒光定量PCR儀 美國伯樂公司；生物組織自動包埋機、石蠟包埋機、KD-P組織攤片機、轉輪式切片機 湖北貝諾醫療科技有限公司；Eclipse E100光學顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及菌懸液制備

挑取-80 ℃下凍干管保存的Vp17802和VpRS1菌株分別接種于3% NaCl-BHI培養基，37 ℃活化兩次后，取對數生長期菌液3 000×g室溫離心20 min，得到菌體沉淀用等體積無菌0.1 mol/L PBS洗滌2 次并重懸，測定菌懸液OD600nm。根據實驗室已測定OD600nm與菌體濃度的相關性曲線，并用TCBS弧菌培養基平板計數驗證實際菌量，將Vp17802和VpRS1濃度分別調整至106CFU/mL和108CFU/mL，其中Vp17802菌液16 ℃貯存備用，VpRS1菌液用于誘導VBNC狀態VpRS1。

1.3.2 誘導副溶血弧菌VpRS1進入VBNC狀態

根據文獻[7]報道并結合前期研究利用NaClO誘導副溶血弧菌進入VBNC狀態，并稍加改進。取10 mL培養至對數生長期的副溶血弧菌（約108CFU/mL）菌懸液，3 000×g常溫離心20 min，棄上清液，用無菌PBS洗滌菌體2 次并重懸，隨后與5 mL NaClO溶液混合使有效氯終質量濃度達35 μg/mL，避光室溫孵育15 min，每隔5 min晃動1 次，3 000×g常溫離心20 min，棄上清液，沉淀用等體積無菌PBS洗滌2 次并重懸。采用活菌直接計數法[20]，對重懸液中VpRS1總活菌計數，利用TCBS弧菌計數平板對可培養VpRS1計數，兩者差值為VBNC-VpRS1濃度，最后使用無菌PBS調整VBNC-VpRS1濃度至106CFU/mL，儲備菌液用于動物實驗。同時采用丙酮酸鈉輔助熱激處理復蘇VBNC-VpRS1，檢驗調整后菌量是否達到預期值，取5 mL儲備菌液與5 mL含20 mmol/L丙酮酸鈉的PBS混合，45 ℃下熱激處理15 s，隨后轉至37 ℃振蕩培養箱（120 r/min）恒溫孵育12 h后，通過TCBS弧菌計數平板觀察并統計可培養菌落數，即為儲備菌液中VBNC-VpRS1實際菌量。

1.3.3 動物實驗

適應期結束后，將30 只雌雄各半小鼠隨機分為3 組：對照組、標準毒力株感染組（Vp17802組）和VBNC感染組（VBNC-VpRS1組）。實驗前12 h，各組小鼠禁食不禁水，對照組小鼠灌胃0.1 mL無菌PBS，標準毒力株感染組和VBNC感染組小鼠依據副溶血弧菌食物中毒劑量105CFU，分別灌胃0.1 mL上述保存的Vp17802和VBNC-VpRS1菌懸液，感染周期72 h。實驗結束，采用二氧化碳麻醉小鼠，摘眼球取血，1 500×g、4 ℃離心10 min分離血清，采用頸椎脫臼法迅速處死小鼠，解剖收集回腸、盲腸和結腸組織及其內容物，用于檢測腸道炎性損傷指標和病原菌定植量。所有程序遵循中國小動物保護協會的要求（CSAPA-3685）。

1.3.4 一般行為學指標檢測

感染期間，觀察并記錄各組小鼠的活動、飲食、精神狀況、糞便形態和體質量變化等指標，并在解剖后分析小鼠腹腔臟器差異。參考文獻[21]中疾病活動指數（disease activity index，DAI）評價標準，結合體質量下降百分比、糞便形態和臟器出血3 項指標進行評分。

1.3.5 腸組織中副溶血弧菌定植量檢測

分別將1 g回腸、盲腸或結腸內容物與9 mL無菌PBS混勻，采用10 倍稀釋法，取3 個連續適宜稀釋度（10-3、10-4、10-5）分別涂布于TCBS弧菌計數培養基，37 ℃恒溫培養24 h后，統計菌落數。平板菌落計數實驗重復3 次。

1.3.6 結腸組織形態學和病理學觀察

各組小鼠解剖后，取距離肛門2 cm處結腸組織，將靠近盲腸端的腸組織用大頭針固定于測量紙，結腸部分輕輕拉直，測量其長度。隨后結腸組織置于質量分數4%多聚甲醛溶液中室溫浸泡固定24 h，經酒精脫水和石蠟包埋后用轉輪式切片機進行切片，厚度5 μm。常規脫蠟復水、經蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察結腸黏膜結構完整性。參照文獻[22]采用盲法檢查結腸組織潰爛程度、水腫和炎性細胞浸潤范圍，進行組織病理學評分。

1.3.7 結腸組織屏障功能檢測

利用結腸組織緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）和閉合蛋白（Occludin）表達量，血清中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）含量作為評價結腸屏障功能和通透性的指標。

采用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法檢測緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達量，按照1.3.6節方法制備結腸石蠟切片。根據IHC試劑盒說明書操作，結腸石蠟切片經雙氧水封閉、熱原修復、質量分數5%胎牛血清封閉，滴加ZO-1和Occludin一抗（ZO-1稀釋比例1∶500；Occuldin稀釋比例1∶400），4 ℃過夜。次日PBS洗滌3 次，加入超敏兔鼠通用二抗，室溫孵育50 min，PBS液洗滌，滴加新鮮配制DAB顯色液，顯微鏡下觀察，ZO-1和Occludin蛋白陽性表達為棕黃色，陰性為藍色。

按照LPS、DAO和D-LA測試盒說明書操作，測定血清中各指標含量。

1.3.8 結腸組織和血清中細胞因子含量分析

采用TRIzol RNA提取法制備小鼠結腸組織總RNA，經RNA純度和質量濃度檢測后，保留高品質RNA樣本。應用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，使用10 μL反轉錄體系，反轉錄條件為37 ℃、15 min；85 ℃、5 s。利用特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增，以小鼠β-actin為內參基因，檢測先天免疫受體4（toll-like reporter 4，TLR4）、核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA相對表達量。引物由上海生物工程有限公司合成，序列見表1。各基因相對表達量按照2-ΔΔCt方法計算。

表1 實時熒光定量PCR檢測的基因引物序列Table 1 Sequences of primers used for RT-PCR

按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10質量濃度。

1.4 數據處理與分析

Microsoft Excel軟件整理原始數據，使用One-way ANOVA進行數據差異分析。根據Bartlett’s檢驗差異是否具有顯著性，進而選擇Dunnett’s或Tukey’s進行各組間的比較檢驗。結果用平均值±標準差表示，當P＜0.05時，表示組間存在顯著差異；采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，采用Image J 1.8.0軟件統計分析緊密連接蛋白陽性成像圖片的積分光密度值（integrated optical density，IOD）。

2 結果與分析

2.1 副溶血弧菌對小鼠一般行為學的影響

DAI是評價食源性致病菌誘導腸道損傷的典型指標之一[21]。C57BL/6J小鼠分別灌胃感染VBNC-VpRS1菌株和Vp17802菌株后的自發活動行為、腹腔臟器損傷情況和DAI評分如圖1所示。感染4 h，Vp17802組小鼠出現明顯的萎靡不振、震顫、被毛凌亂等臨床癥狀，VBNCVpRS1組小鼠則在感染10 h出現類似癥狀，VBNC-VpRS1組小鼠較Vp17802組延遲6 h出現感染癥狀，但程度更劇烈。感染終點72 h，Vp17802組鼠籠中有少量黃色稀便，小鼠身體虛弱，經解剖發現腸系組織有黃色積液；VBNC-VpRS1組鼠籠中有大量膿便和一定量的血便，小鼠扎堆聚集，解剖觀察腸組織有出血性積液，在此期間對照組小鼠未見任何異常。Vp17802組和VBNCVpRS1組DAI評分分別為6.78±0.43和8.99±0.35，均高度顯著高于對照組（P＜0.001），且VBNC-VpRS1組與Vp17802組組間存在顯著差異（P＜0.05）。傳統觀點認為，VBNC狀態微生物的細胞受損，生理活性低，宿主的胃酸和缺氧環境會限制其生長，VBNC狀態菌株只能在體外復蘇，體內無致病力[23]。然而，本研究發現，雖然VBNC-VpRS1菌株在小鼠體內需要更長時間復蘇并產生臨床感染癥狀，但其造成的腹腔臟器損傷遠比標準毒力菌株嚴重。Cappelie等[24]指出初代VBNC狀態單核細胞增生李斯特菌無明顯致病力，經卵黃培養后感染小鼠比標準菌致病性強，這與卵黃中卵磷脂營養素促進VBNC狀態菌復蘇產生更多溶血毒素密切相關。因此，VBNCVpRS1菌株在小鼠體內攝取足夠營養和復蘇后，可能代謝產生更多溶血毒素，進而造成比Vp17802菌株更劇烈的感染損傷。

圖1 副溶血弧菌對C57BL/6J小鼠活動、腹腔感染和疾病活動指數評分的影響Fig. 1 Effect of Vibrio parahemolyticus on behavior, abdominal infection and DAI score of C57BL/6J mice

2.2 副溶血弧菌對小鼠回腸、盲腸和結腸定植量的影響

胃腸道是副溶血弧菌侵染的主要部位，腸道中病原菌載量決定損傷的嚴重程度[25]。兩株副溶血弧菌在C57BL/6J小鼠回腸、盲腸和結腸定植量如圖2所示，對照組小鼠腸道內溶物未檢出副溶血弧菌，Vp17802組和VBNCVpRS1組小鼠回腸和盲腸中副溶血弧菌檢出量較低，結腸中菌量最高，分別為（3.31±0.10）（lg（CFU/g））和（4.98±0.14）（lg（CFU/g）），均極顯著高于對照組（P＜0.01）。VBNC-VpRS1菌株在小鼠結腸中定植量顯著高于Vp17802菌株（P＜0.05）。研究表明，VBNCVpRS1菌株和Vp17802菌株在小鼠回腸和盲腸的定植力弱，主要聚集在結腸內，VBNC狀態菌株的結腸定植力強于標準毒力菌株。Gu Dan等[26]研究表明結腸內酸堿度近中性且含有少量氧氣，適宜副溶血弧菌定植并發揮致病力。全局應答因子RNA聚合酶σ因子是細菌逆環境生存的關鍵蛋白，在微生物VBNC狀態形成和復蘇過程中發揮重要作用，VBNC狀態菌株普遍存在RpoS因子過表達情況，且RpoS表達量與菌體黏附作用呈正相關[27]。因此，VBNC-VpRS1菌株比Vp17802菌株具有更強的結腸定植力，可能與其細胞內RpoS因子含量密切相關，未來需要對VBNC-VpRS1菌株的RpoS蛋白開展深入研究。

圖2 副溶血弧菌在C57BL/6J小鼠回腸、盲腸和結腸定植量Fig. 2 Vibrio parahemolyticus loads in the ileum, cecum and colon of C57BL/6J mice

2.3 副溶血弧菌對小鼠結腸組織的影響

食源性致病菌具有破壞腸組織結構完整性，引發宿主全身感染的風險[28]。小鼠結腸組織形態學觀察結果顯示，Vp17802組和VBNC-VpRS1組小鼠結腸充血腫脹（圖3A），結腸長度較對照組極顯著或高度顯著縮短（P＜0.01、P＜0.001）（圖3B）。對結腸損傷情況定量分析，與對照組比較，Vp17802組和VBNC-VpRS1組小鼠結腸病理損傷評分高度顯著升高（P＜0.001）（圖3C），其中VBNC-VpRS1組病理評分顯著高于Vp17802組（P＜0.05）。結腸組織病理學觀察結果表明，對照組小鼠結腸黏膜結構完整、光滑，腺體清晰，未見糜爛和炎性細胞浸潤，Vp17802組和VBNC-VpRS1組小鼠結腸黏膜上皮糜爛，腺體隱窩結構破壞，杯狀細胞減少或消失，伴有大量中性粒細胞浸潤，VBNCVpRS1組小鼠結腸組織結構缺損和中性粒細胞浸潤區域多于Vp17802組（圖3D）。結果表明，VBNC-VpRS1菌株與Vp17802菌株均可造成小鼠結腸組織形態損傷和病理評分增加，VBNC狀態菌株比標準毒力菌株具有更強的結腸組織破壞力和誘導炎性細胞浸潤。Yoon等[29]指出，小鼠腸道內復雜的微環境會促進VBNC狀態弧菌感染，特別是腸內液體能夠滋養VBNC狀態弧菌，有利于其破壞腸系黏膜細胞。由此推測VBNC-VpRS1菌株借助腸積液增加對結腸黏膜層的侵襲，從而表現出比Vp17802菌株更強的結腸損傷效應。這一推論在小鼠腹腔臟器觀察（圖1）中得到證實，VBNC-VpRS1組小鼠結腸內出現大量血樣積液，而Vp17802組小鼠結腸內積液量較少。

圖3 副溶血弧菌誘導C57BL/6J小鼠結腸組織損傷Fig. 3 Morphological and histological changes in the colon of C57BL/6J mice induced by Vibrio parahemolyticus

2.4 副溶血弧菌對小鼠結腸屏障功能的影響

腸黏膜機械屏障是腸系屏障中最重要的部分，由黏膜上皮細胞和細胞間緊密連接構成，發揮調節腸壁通透性、阻止食源性致病菌感染擴張和內毒素外溢的作用[30]。如圖4A所示，對照組中ZO-1和Occludin的陽性免疫反應產物位于細胞膜和/或細胞質中（紅色箭頭所示區域），呈棕黃色，而在Vp17802組和VBNC-VpRS1組中很少有陽性產物，呈藍色。由圖4B可知，對照組ZO-1和Occludin的IOD最高，表明小鼠處于健康水平；與對照組比較，Vp17802組和VBNC-VpRS1組ZO-1和Occludin的IOD均極顯著或高度顯著減少（P＜0.01、P＜0.001），且Vp17802組兩種緊密連接蛋白IOD顯著低于VBNCVpRS1組（P＜0.05），說明兩株副溶血弧菌感染均抑制小鼠結腸ZO-1和Occludin蛋白表達量，導致小鼠結腸組織緊密連接結構異常。血清檢測結果顯示，兩組副溶血弧菌感染的小鼠血清LPS、DAO質量濃度和D-LA濃度顯著高于對照組（P＜0.001、P＜0.05、P＜0.01），Vp17802組的LPS、DAO質量濃度和D-LA濃度分別為對照組的1.7、1.2、1.4 倍，VBNC-VpRS1組分別是對照組的1.8、1.1、1.3 倍，Vp17802組和VBNC-VpRS1組組間無顯著差異（P＞0.05）（圖4C）。綜上說明，VBNCVpRS1菌株和Vp17802菌株破壞小鼠腸屏障功能異常，造成了腸通透性增加誘發內毒素移位，這也解釋了感染組小鼠胃部、脾臟和肝臟有出血性損傷（圖1）可能與副溶血弧菌菌體和LPS等有害物的擴散有關。Li Yan等[31]研究指出腸屏障功能發生障礙時，病原菌及其代謝物等可以侵入深層組織和血液，誘導腎臟和脾臟等腹腔臟器多位點損傷。雖然，VBNC-VpRS1菌株對結腸屏障功能破壞力弱于Vp17802菌株，但也會造成結腸通透性異常，增加全身感染的風險，其致病力不容忽視，提示食品安全監管部門應該把VBNC狀態副溶血弧菌納為常規檢測項目，尤其在即食食品安全監控中。

圖4 副溶血弧菌誘導C57BL/6J小鼠結腸屏障功能異常Fig. 4 Colonic barrier dysfunction in C57BL/6J mice induced by Vibrio parahemolyticus

2.5 副溶血弧菌對小鼠結腸和血清細胞因子水平的影響

細胞因子包括促炎和抗炎因子，二者相互制約，在機體炎癥反應平衡中發揮關鍵作用[32]。如圖5A所示，與對照組相比，Vp17802組和VBNC-VpRS1組小鼠結腸組織TLR4和NF-κB的mRNA表達量高度顯著升高（P＜0.001），促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA相對表達量也高度顯著增加（P＜0.001）；IL-10是典型的Th2型細胞因子，具有較強的抗炎作用，Vp17802組和VBNC-VpRS1組的轉錄表達量相較于對照組被高度顯著抑制（P＜0.001），分別為對照組的0.45 倍和0.66 倍（圖5B）。小鼠血清細胞因子結果表明，Vp17802組和VBNC-VpRS1組血清IL-1β、IL-6、TNF-α質量濃度分別為（410.12±28.74）、（243.65±10.33）、（318.59±17.31）pg/mL和（341.45±18.35）、（210.02±8.89）、（269.12±12.99）pg/mL，均極顯著高于對照組（IL-1β質量濃度（210.14±19.40）pg/mL、IL-6質量濃度（138.45±10.12）pg/mL、TNF-α質量濃度（110.23±7.62）pg/mL）（P＜0.01）（圖5C）；Vp17802組和VBNC-VpRS1組血清IL-10質量濃度分別為（68.73±5.91）pg/mL和（73.21±9.28）pg/mL，均顯著低于對照組（（102.07±11.41）pg/mL）（P＜0.05）（圖5C）。Vp17802組促炎因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平均顯著高于VBNC-VpRS1組（P＜0.05），而抑炎因子（IL-10）水平無明顯差異（P＞0.05）。腸道炎癥反應受TLR4介導的信號轉導通路調控，NF-κB作為TLR4信號通路下游重要的多功能核轉錄因子，激活后調控機體炎癥水平、免疫反應和細胞凋亡[33]。活化的NF-κB可促進IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子表達，進而反饋激活NF-κB表達，加劇炎癥反應，炎性因子通常對病原菌無害，反而可以增加腸組織血液供應進而為致病菌提供額外的營養，有助于其競爭腸系生存空間[34]。因此，VBNC-VpRS1菌株和Vp17802菌株是通過激活結腸組織TLR4/NF-κB途徑介導炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α轉錄表達，同時抑制抗炎因子IL-10活性，誘導結腸過度炎癥反應，值得注意的是VBNC-VpRS1菌株致結腸炎癥能力弱于Vp17802菌株，且在血清細胞因子中具有相同規律。綜上，兩株副溶血弧菌均能誘導小鼠結腸和系統性炎癥反應，VBNC狀態菌株的致炎性弱于標準毒力菌株。此外，VBNC狀態弧菌胞內全局應答因子（RpoS）、重組組蛋白樣類核結構蛋白和LuxR家族調控蛋白等參與致病菌的毒力形成[35]。在進一步研究中，挖掘具有調控VBNC狀態副溶血弧菌致病力的關鍵因子是亟待解決的問題。

圖5 副溶血弧菌誘導C57BL/6J小鼠結腸和血清炎癥反應Fig. 5 Colonic and serum inflammatory responses in C57BL/6J mice induced by Vibrio parahemolyticus

3 結 論

生食三文魚源VBNC-VpRS1菌株通過定植在C57BL/6J小鼠結腸，破壞腸黏膜組織結構完整性，抑制緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達，造成腸屏障功能障礙，LPS、DAO和D-LA等有害物趁機移位，激活TLR4/NF-κB途徑及其調控的促炎因子過度釋放，誘導小鼠腸道炎性損傷。雖然VBNC狀態菌株引起臨床感染癥狀較標準毒力株滯后，但其具有更強的結腸定植力和腸組織破壞性，且影響腸功能和促進炎癥，威脅機體健康。食品中VBNC狀態副溶血弧菌的致病力應當引起足夠重視。由于VBNC狀態菌株誘導的腸道損傷特征與標準毒力株不同，未來應該深入探究二者的致病力差異。