鐵皮石斛葉多糖對秀麗隱桿線蟲體內抗衰老作用

黃少杰，陳宏著，鐘淳菲，朱思陽，黎 攀，杜 冰,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.花安堂生物科技集團有限公司，廣東 廣州 511434）

衰老是人體正常、不可逆的生理現象，伴隨機體衰老，各種功能普遍衰退，抵抗外界環境傷害和恢復體內平衡能力減弱，從而導致疾病和死亡率的增高[1]。現代醫學表明，隨著年齡的增長，人體的代謝速度會變緩慢，體內會產生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[2]。而當機體內的ROS過量時，則會誘導機體發生氧化應激，從而對細胞結構和生物分子功能造成重大損傷，繼而直接或間接導致多種疾病的產生[3]。因此，天然抗氧化產物的研發是目前抗氧化衰老研究的熱點之一，已有大量文獻報道植物多糖具有一定的抗氧化性[4]，邱現創[5]的研究表明鐵皮石斛多糖具有抗氧化活性，是一種天然的優質抗氧化劑；劉冰冰[6]以鐵皮石斛為原材料提取得到鐵皮石斛多糖，并以秀麗隱桿線蟲（以下簡稱線蟲）為模式生物，探討了鐵皮石斛多糖延長線蟲壽命可能的作用機制，結果表明一定劑量的鐵皮石斛多糖可以延長線蟲壽命，其作用機制可能是通過胰島素信號通路調控下游DAF-16基因完成對線蟲的耐受能力的提高實現的。

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬草本植物，主產于安徽、浙江、福建、廣西、四川、云南等地，鐵皮石斛作為石斛中的珍貴品種，其功能性成分主要包括多糖類、黃酮類以及酚酸類等，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等藥理活性[7]，是我國著名的藥食兩用中藥材。《中國藥典》規定其藥用部位為莖，葉為非藥用部位[8]，在鐵皮石斛鮮條生產時，非藥用部位——鐵皮石斛葉往往作為副產品被直接丟棄，造成一定的資源浪費。鐵皮石斛葉中含有豐富的鐵皮石斛多糖，雖然其含量低于莖部，但在某些生物活性上具有一定優勢[9]，有研究發現鐵皮石斛葉中多糖對羥自由基的清除率比莖部的更高[10]，此外，鐵皮石斛葉生物量占鐵皮石斛總生物量比例較大，達到50%[11]。因此，對鐵皮石斛葉進行研究開發，不僅能更充分地利用中藥珍惜資源，踐行綠色可持續發展理念，而且能進一步擴大鐵皮石斛的使用部位及提高其附加值。然而，目前關于鐵皮石斛葉多糖在抗衰老方面的研究甚少，且具體作用機制還不清楚。

線蟲作為一種模式生物，其結構簡單、生命周期短、基因組與人類基因保守性較高，因此在抗氧化和延緩衰老研究領域具有明顯優勢[12-13]，廣泛應用于抗衰老、藥物篩選和神經系統疾病等各方面的研究[14]。而目前以線蟲為模型研究鐵皮石斛葉多糖抗衰老效果的報道較少，因此本實驗選用鐵皮石斛葉多糖飼喂N2野生型線蟲，通過對其壽命、生殖能力、運動能力、應激實驗、體內ROS及抗氧化酶活力等方面進行研究，探究鐵皮石斛葉多糖在其體內的抗衰老作用及機理，以期為鐵皮石斛葉進一步研究與開發利用提供參考，并為開發抗衰老、抗氧化的功能性食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

N2野生型線蟲（Caenorhabditis elegans）購于美國秀麗隱桿線蟲遺傳中心。

鐵皮石斛葉 紅河群鑫石斛種植有限公司；大腸埃希氏菌OP50（以下簡稱OP50） 上海南方模式生物科技股份有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均購于廣州齊湘生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2204萬分之一天平 上海舍巖儀器有限公司；SN-HWS250B恒溫生化培養箱 甘易儀器設備（上海）有限公司；LD-SY96S多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；MF53-N熒光顯微鏡 上海蔡康光學儀器有限公司；LC-LX-HR185C冷凍離心機 日本久保田儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛葉多糖的制備及含量測定

鐵皮石斛葉切段粉碎后，參考文獻[15]的方法，采用水溶醇提法提取鐵皮石斛葉多糖，經Sevag法除去蛋白后，將溶液倒入透析袋透析，透析結束后采用DEAE陰離子交換柱進行分級層析，用去離子水洗脫。收集洗脫液采用Sephadex G-100進行葡聚糖凝膠柱層析，用去離子水洗脫，層析結束后進行透析、真空濃縮、冷凍干燥，得到純化的鐵皮石斛葉多糖樣品。采用苯酚硫酸法[16]測定純化后的樣品多糖質量分數為（90.13±4.73）%。

1.3.2 線蟲培養和同期化處理

采用涂布有100 μL OP50菌液（濃度為1×109CFU/mL，下同）的線蟲生長培養基（nematode growth medium，NGM）于20 ℃下培養線蟲。

采用高氯酸鈉漂白法對線蟲進行同期化處理：用1 mL M9緩沖溶液將產卵期的線蟲成蟲洗至無菌EP管中，加1 mL裂解液（含有0.5 mol/L NaOH、0.5%（質量分數）NaClO的M9緩沖液）裂解線蟲，反復振蕩5 min，然后3 000 r/min離心1 min，棄去上清液，再用M9緩沖液沖洗線蟲2 次，3 000 r/min離心1 min，棄去上清液后用移液槍吸取線蟲，滴于NGM的無菌區，在20 ℃培養箱中恒溫培養約48 h后，裂解的線蟲體內受精卵基本發育成L4期幼蟲，完成同期化操作。

1.3.3 實驗分組

實驗分為5 組：將線蟲分別轉移至涂布100 μL含低（0.5 mg/mL）、中（1.0 mg/mL）、高（2.0 mg/mL）質量濃度鐵皮石斛葉多糖OP50菌液的NGM，每天飼喂等體積相應OP50菌液，記為低（LD）、中（MD）、高（HD）質量濃度鐵皮石斛葉多糖組；空白對照組（CD）初期涂布或每天飼喂等體積OP50菌液；蝦青素（astaxanthin，AST）陽性對照組（YD）初期涂布或每天飼喂等體積含64 μmol/L AST的OP50菌液（準確稱取0.001 91 g蝦青素，用1 mL二甲基亞砜溶解后制成3.2 mmol/L AST母液，取0.1 mL AST母液與4.9 mL OP50菌液混勻）。

1.3.4 線蟲壽命及運動能力測定

線蟲壽命測定參考王晉等[17]的方法并稍作修改，分別挑取30 條1.3.3節L4期線蟲幼蟲轉移至5 組涂布有100 μL不同OP50菌液的新鮮NGM，在20 ℃培養箱中恒溫培養，此后每隔24 h轉移1 次，每天觀察線蟲的存活情況，計算各組線蟲存活率（觀察時存活線蟲數量占初始線蟲總數的比例，下同）、壽命中位數、平均壽命、最長壽命。

參考文獻[18]并略作修改測定線蟲運動能力。每組選取線蟲數量大于30 條，實驗重復3 次，在培養第1、5、10、15天觀察線蟲的運動能力，記錄3 個等級（A、B、C）運動能力的線蟲數量并計算不同等級運動能力線蟲的比例。運動能力判斷標準：線蟲自主活動自如定義為A等級，僅在挑針觸碰頭部或尾部后開始爬行定義為C等級，介于兩者之間定義為B等級。

1.3.5 線蟲生殖實驗

隨機挑取L4期線蟲置于各組培養皿上，每組5 個培養皿，每個培養皿上放置1 條線蟲，在產卵高峰期（L4期的前3 d）需每日轉板，培養蟲卵發育至成蟲后記錄各組每個培養皿上的線蟲數量即為線蟲的產卵量。后期每隔24 h將線蟲轉移至新的平板中，轉移4～5 次，至線蟲不再產卵時結束，計算線蟲總產卵量。

1.3.6 線蟲應激實驗

1.3.6.1 熱應激實驗

熱應激實驗操作參考文獻[19]并略作修改，將同期化后的線蟲培養至L4期后，各組分別20 ℃干預5 d，隨即挑取線蟲轉移到空白的新鮮NGM培養基中，并放置在35 ℃下培養，每2 h統計1 次存活情況，直至所有線蟲全部死亡，計算線蟲存活率并繪制線蟲生存曲線。

1.3.6.2 急性氧化應激實驗

在急性氧化應激實驗中，同期化后的線蟲生長到L4期后，各組分別干預2 d，之后將線蟲暴露于含30 mmol/L雙氧水的NGM培養基中，每板20 條，每30 min統計1 次存活情況，計算存活率直到線蟲全部死亡為止，實驗重復3 次。

1.3.7 線蟲體內ROS相對水平測定

隨機挑取L4期線蟲在各組條件下分別干預4 d后，用M9緩沖溶液沖洗培養基3 次，轉移到離心管中，3 000 r/min離心取上清液；吸取50 μL上清液和50 μL顯色劑于96 孔板中避光混勻后，以顯色劑為對照。將96 孔板放置于酶標儀中，在反應溫度為25 ℃，激發波長485 nm、發射波長530 nm的熒光顯微鏡下每20 min進行一次熒光強度測定，連續測定120 min。ROS相對水平按下式計算。

1.3.8 線蟲體內抗氧化酶活力和丙二醛含量的測定

參考文獻[20]的方法并略作改動，同期化后的線蟲生長到L4期后，將各組線蟲轉移到NGM上分別干預4 d后，用M9緩沖溶液沖洗培養皿并收集各平板上的成蟲。冷凍研磨后離心，取上清液，使用相關試劑盒測定SOD、CAT活力和MDA含量，并以上清液蛋白濃度進行標準化。

1.4 數據統計與分析

實驗均重復進行3 次，采用Excel 2016軟件進行數據處理，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，采用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 9.1軟件和GraphPad軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛葉多糖對線蟲壽命的影響

自然壽命是進行抗衰老研究分析的首選指標[21]。本實驗以蝦青素為陽性對照，測定了不同質量濃度條件下鐵皮石斛葉多糖對線蟲壽命的影響，線蟲壽命中位數、平均壽命、最長壽命如圖1、表1所示。多糖處理組線蟲的平均壽命、最長壽命以及壽命中位數均高于CD組。MD與HD組線蟲的平均壽命均極顯著高于CD組（P＜0.01），LD組線蟲的平均壽命顯著高于CD組（P＜0.05），各實驗組線蟲的最長壽命均有一定程度的延長，其中MD組線蟲最長壽命與CD組差異極顯著（P＜0.01），且高于YD組，表明其效果優于蝦青素。以上結果說明鐵皮石斛葉多糖對線蟲存活率有一定影響，能夠有效延長線蟲的壽命。

圖1 鐵皮石斛葉多糖對線蟲壽命的影響Fig. 1 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on lifespan of C. elegans

表1 鐵皮石斛葉多糖對線蟲平均壽命和最長壽命的影響Table 1 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on average and maximum lifespan of C. elegans

2.2 鐵皮石斛葉多糖對線蟲行動能力的影響

運動行為是反映線蟲神經系統基本功能的指標，線蟲運動能力與線蟲壽命有直接關系，能夠作為評價機體的衰老速度的重要指標[22]。

如圖2所示，隨著機體的衰老，線蟲的運動能力逐漸下降。在培養前10 d，鐵皮石斛葉多糖對線蟲的運動狀態影響并不顯著（P＞0.05）；在培養15 d后，與CD組相比，不同質量濃度的鐵皮石斛葉多糖均能提高線蟲的蠕動能力，在培養到20 d時，CD組中線蟲運動狀態均為C等級，鐵皮石斛葉多糖干預組部分線蟲運動狀態為B等級，表明鐵皮石斛葉多糖可以顯著提高線蟲的運動能力（P＜0.05），且MD、HD組線蟲的運動能力略優于YD組，進一步說明鐵皮石斛葉多糖還可以提高線蟲運動行為能力。

圖2 不同質量濃度鐵皮石斛葉多糖對線蟲運動能力的影響Fig. 2 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on motility of C. elegans

2.3 鐵皮石斛葉多糖對線蟲產卵量的影響

有報道指出許多生物壽命的延長與生殖能力呈負相關[23]，但也有報道指出白藜蘆醇可以延長線蟲壽命的同時不影響生殖能力[24]。如圖3所示，本研究中各組總產卵量沒有顯著差異（P＞0.05），表明鐵皮石斛葉多糖可以延長線蟲壽命的同時不影響其生殖能力。

圖3 鐵皮石斛葉多糖對線蟲總產卵量的影響Fig. 3 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on oviposition quantity of C. elegans

2.4 鐵皮石斛葉多糖對線蟲應激效應的影響

機體在壓力環境下的抵抗能力被稱作壓力應激能力，壽命的延長與壓力應激能力的提高具很強的關聯性[25-26]，高溫會導致機體內部代謝紊亂、酶失活等，使機體內產生大量的ROS，引起氧化應激[27]，因此通過熱應激實驗考察線蟲對急性氧化損傷的抵抗能力。本研究探討了35 ℃條件下不同質量濃度鐵皮石斛葉多糖干預線蟲抵抗熱應激的能力。由圖4A可知，與CD組相比，低、中、高劑量的鐵皮石斛葉多糖對線蟲的抗熱應激能力均無明顯的增強作用。

本實驗選擇過氧化氫作為強氧化劑，構建氧化損傷環境，將鐵皮石斛葉多糖處理后的線蟲轉移至氧化應激環境中，通過測定線蟲存活率來檢測鐵皮石斛葉多糖是否有助于機體抵御氧化損傷。由圖4B可知，在培養前中期時，HD組中的線蟲存活率明顯高于CD組，說明當鐵皮石斛葉多糖的質量濃度達到一定水平時，鐵皮石斛葉多糖能增強線蟲的抵抗氧化應激的能力；同時，與CD組相比，實驗組線蟲生存曲線右移，表明實驗組中線蟲抵御氧化應激的能力普遍提高。

圖4 鐵皮石斛葉多糖對線蟲應激能力的影響Fig. 4 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on stress resistance in C. elegans

2.5 鐵皮石斛葉多糖對線蟲活性氧相對水平的影響

自由基是衰老的重要引發因素之一，隨著機體的衰老，其自由基調節能力下降，導致機體中的ROS的過量堆積，過量的ROS會引起機體氧化應激反應，導致細胞損傷或凋亡，從而引發動脈粥樣硬化、癌癥、心腦血管病癥等多種疾病[28-29]。由圖5可知，線蟲體內的ROS相對水平隨反應時間的延長而增加，處理120 min時，與CD組相比，鐵皮石斛葉多糖干預后的線蟲體內ROS相對水平都明顯降低，LD、MD、HD組ROS相對水平分別降低了40.0、79.1、85.0 個百分點，具有劑量-效應關系。以上結果表明，鐵皮石斛葉多糖能有效清除線蟲體內的ROS，且HD組對ROS清除效果最為明顯。

圖5 鐵皮石斛葉多糖對線蟲ROS相對水平的影響Fig. 5 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on ROS levels in C. elegans

2.6 鐵皮石斛葉多糖對線蟲體內抗氧化酶活力和丙二醛含量的影響

CAT、SOD是線蟲體內主要的抗氧化酶，提高抗氧化酶活力可以清除線蟲體內多余的自由基，從而促進體內氧化平衡[30]，相似研究指出提高線蟲體內抗氧化酶活力（SOD、CAT）是延長線蟲壽命的作用機制之一[31]；MDA是生物體內脂質氧化的產物，被廣泛用于脂質氧化水平評價[32]。SOD-1、SOD-3是SOD家族的組成成員，有研究發現SOD-1、SOD-3表達水平升高能減少線蟲體內ROS的含量，從而延長線蟲壽命[33-34]，因此推測鐵皮石斛葉多糖抗氧化衰老的作用機制與其提高機體內抗氧化酶活力、降低ROS相對水平有關。

由圖6A、B可知，在本實驗考察質量濃度范圍內，與CD組相比，鐵皮石斛葉多糖均可以提高線蟲體內SOD和CAT活力，其中，SOD活力由（53.92±1.24）U/mg極顯著提高到HD組的（90.02±3.35）U/mg（P＜0.01），且存在劑量-效應關系；同時，與CD組相比，不同質量濃度的鐵皮石斛葉多糖均能提高CAT活力，且HD組的提升效果顯著（P＜0.05）；由圖6C可知，鐵皮石斛葉多糖干預組具有更低的MDA含量，與CD組相比，LD、MD、HD組中的MDA含量分別降低了25.24%、26.42%、31.86%，呈現劑量-效應關系。以上結果表明鐵皮石斛葉多糖可在一定程度上能夠提高線蟲體內抗氧化能力，緩解氧化損傷及線蟲衰老，具有激活線蟲體內抗氧化防御系統的潛力。

圖6 鐵皮石斛葉多糖對線蟲體內抗氧化酶活力和MDA含量的影響Fig. 6 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on antioxidant enzyme activities and MDA levels in C. elegans

3 結 論

本實驗引入模式生物線蟲，評價了鐵皮石斛葉多糖延緩線蟲衰老的作用，并對其可能的作用機制進行了初步的探索。結果表明，與空白對照組線蟲相比，鐵皮石斛葉多糖能提高線蟲的平均壽命和最大壽命，并且不以損害生殖能力為代價，能有效清除自由基和提高機體抗氧化應激能力，同時降低ROS相對水平。與空白對照組線蟲相比，鐵皮石斛葉多糖能有效提高線蟲體內SOD和CAT活力，顯著降低MDA含量（P＜0.05），且應激條件下線蟲的生存率增加。本實驗結果表明鐵皮石斛葉多糖具有抗氧化活性，可為以后鐵皮石斛葉多糖的進一步研究提供參考，但其產生抗氧化作用的具體作用機制仍需進一步研究。