高F值玉米肽通過改善大鼠骨骼肌線粒體功能提高運動能力

劉金美，付翠元，馬 坤，李 哲，賈紹輝,4,*

（1.武漢體育學院健康科學學院，湖北 武漢 430079；2.濟南大學體育學院，山東 濟南 250024；3.湖北開放大學經濟貿易學院，湖北 武漢 430074；4. 武漢體育學院 運動訓練監控湖北省重點實驗室，湖北省運動與健康促進協同創新中心，湖北 武漢 430079）

眾所周知，運動能力下降的主要原因是運動疲勞的產生，運動疲勞是指“機體的生理過程不能維持其機能在某一特定水平或不能維持預定的運動強度”的一種生理現象[1]。運動疲勞容易誘發運動損傷，直接影響人體的正常運動，降低運動員的運動能力和表現。線粒體是機體內三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）產生的重要場所，已有研究顯示運動疲勞的發生與骨骼肌線粒體呼吸鏈的損傷有直接關系，會引起骨骼肌線粒體鈣代謝、膜流動性和膜脂質過氧化的改變。脂質過氧化水平增高會導致線粒體內膜分子動力學改變和內膜組分活性的變化，并且劇烈運動會引起ATP酶活性降低，導致能量供應不足，引發運動疲勞產生[2]。報道顯示，通過補劑的方式保持線粒體功能的完整性可能對運動疲勞的消除和運動能力提高具有顯著效果，例如，Liu Lixia等[3]發現吡咯喹啉醌可通過改善小鼠線粒體功能預防運動性疲勞和氧化損傷的產生，提高小鼠運動能力。Zhu Hongkang等[4]也發現馬蹄蓮可通過減少氧化應激的產生保護線粒體功能的完整性，從而降低骨骼肌疲勞，提高骨骼肌運動能力。

玉米肽是玉米蛋白經定向酶切及特定小肽分離技術獲得的小分子多肽，其營養豐富，并且具有穩定性高、溶解性好、易吸收等優點[5]。近年來，玉米肽的應用范圍越來越廣泛，包括降血壓、醒酒、護肝、增強免疫及運動能力、抗氧化應激等。

F值是指支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的物質的量比值，正常人體血液中F值為3.0～3.5，高F值活性肽的F值應大于20[6]。高F值活性肽中支鏈氨基酸含量高，具有為機體提供能量、促進胰島素分泌、促進蛋白合成等重要生理功能[7]。比較普通玉米肽與高F值玉米肽的抗氧化能力發現，高F值玉米肽具有更強的清除細胞內活性氧的能力，說明高F值玉米肽相比普通玉米肽具有更強的抗氧化能力[8]。

鑒于高F值玉米肽具有更強的抗氧化能力，而體內氧自由基產生過多導致的線粒體損傷是運動疲勞產生、運動能力下降的重要原因，因此推測高F值玉米肽具有潛在的抗運動疲勞、提高運動能力的功效。本研究選取SD大鼠，在長期給予高F值玉米肽并進行游泳訓練后，進行一次性力竭運動，分析高F值玉米肽對大鼠骨骼肌氧自由基清除能力及線粒體功能的影響，考察高F值玉米肽對實驗大鼠運動能力的影響，以期為明確高F值玉米肽的抗運動疲勞、提高運動能力功效提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

80 只SPF級雄性SD大鼠，體質量約250 g，購于湖北省預防醫學中心，生產許可證號：SCXK（鄂）2016-0018，使用許可證號：SYXK（鄂）2021-0087。

高F值玉米肽（F值為27.8）由山東中食都慶生物科技有限公司提供。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；ATP合成酶與水解酶檢測試劑盒美國Abcam生物技術公司；BCA蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；核因子2相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）、Kelch樣ECH關聯蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）抗體 美國Santa Cruz Biotechnology公司；線粒體融合蛋白（mitofusin2，Mfn2）、動力相關蛋白（dynaminrelated protein，Drp1）、GAPDH抗體 美國Cell Signaling生物公司。

1.2 儀器與設備

Lactate-scout血乳酸測定儀 德國EFK公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及游泳訓練

80 只SPF級雄性SD大鼠于SPF級動物房適應性喂養1 周后，隨機分為4 組，每組20 只，分別為對照組（A組）、高F值玉米肽低劑量組（B組）、高F值玉米肽中劑量組（C組）與高F值玉米肽高劑量組（D組）。B、C、D組每天灌胃給予0.1、0.2、0.4 g/kgmb高F值玉米肽（采用生理鹽水配制成0.1 g/mL混懸液），A組給予等體積生理鹽水。每天上午給藥，下午進行無負重游泳訓練，訓練時間為每天1 h，每周第1～5天連續運動5 d、安靜狀態休息2 d，共訓練8 周。實驗結束后次日進行一次性負重力竭運動，負重為體質量5%，參考文獻[9-10]確定力竭標準為大鼠沉入水中10 s不再浮上水面，撈出后在平面上無法完成翻正反射。記錄大鼠力竭運動時間并測定其血乳酸濃度。待安靜狀態休息3 d后，處死實驗大鼠，取外周血以及骨骼肌組織。

1.3.2 血乳酸濃度測定

分別于力竭運動前、力竭運動后5 min、力竭運動后15 min，取實驗大鼠尾靜脈血1 滴，利用血乳酸測定儀檢測并記錄其血乳酸濃度。

1.3.3 抗氧化指標測定

稱取骨骼肌組織約1 mg，加入1 mL預冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），60 Hz勻漿2 min后超聲1 min。收集超聲后組織液，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，收集上清液分別按照MDA以及SOD檢測試劑盒說明書要求檢測各組大鼠肌肉組織MDA含量以及SOD活力，結果均以蛋白質量計。

1.3.4 Western blot檢測抗氧化應激蛋白及線粒體融合與分裂蛋白的表達

取大鼠腓腸肌100 mg，冰浴上加入細胞裂解液充分裂解細胞和一定劑量蛋白酶抑制劑，60 Hz脈沖條件對組織進行勻漿（勻漿4 次，每次2 min、間隔20 s），然后用超聲裂解儀裂解釋放總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。裂解后的細胞懸液中加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5～10 min使蛋白完全變性。取制備好的40 μg蛋白利用15%聚丙烯酰胺凝膠進行分離電泳（85 V、30 min，120 V、90 min），250 mA條件下將分離后蛋白轉印到聚偏二氟乙烯膜上，轉膜時間2.5 h，轉膜結束后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌3 次，然后分別加入Nrf2、Keap1、Mfn2、Drp1以及GAPDH抗體（稀釋比均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3 次，加入二抗室溫孵育1 h。最后用增強型化學發光劑顯影，自動曝光機檢測蛋白條帶灰度，分析蛋白表達水平。

1.3.5 線粒體ATP合成酶活力測定

稱取100～200 mg新鮮腓腸肌及股四頭肌組織，PBS洗滌，洗凈血水，用定性濾紙吸干；然后將肌肉組織置于冰上的培養皿中，剪碎，加入預冷裂解液1.5 mL，冰上用手工研杵反復研磨約30 次，在顯微鏡下觀察，組織中應至少50%以上細胞保持完整。然后將組織勻漿物轉入預冷離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，收集上清液。在另一預冷離心管中加入0.5 mL預冷的A液（1 mol/L KCl、0.5 mol/L Tris，pH 7.4），將上清液小心轉移到離心管中，覆于A液上層，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清為胞漿，沉淀即為所需提取線粒體。向沉淀中加入0.2 mL漂洗液重懸線粒體，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀中加入100 μL 0.1mol/L KCl溶液重懸，按照試劑盒說明書操作，測定大鼠骨骼肌線粒體中ATP合成酶活力。

1.3.6 ATP水解酶活力測定

取新鮮腓腸肌和股四頭肌肌肉組織適量，加入100 μL細胞裂解液和1 μL苯甲基磺酰氟溶液（0.01 mol/L），采用組織勻漿機在60 Hz下勻漿（勻漿4 次，每次2 min、間隔20 s），然后用超聲裂解儀裂解釋放總蛋白。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書操作，測定大鼠骨骼肌中ATP水解酶活力。

1.4 數據處理與分析

每個實驗至少重復3 次，結果均以平均值±標準差表示。采用GraphPad Prism 6.0軟件，使用單因素方差分析對各組數據進行差異顯著性分析，P＜0.05被認為具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 高F值玉米肽對大鼠力竭運動時間的影響

如圖1所示，口服低、中、高劑量高F值玉米肽并同時進行8 周游泳訓練后，大鼠力竭運動時間由對照組的（41.56±3.97）min分別延長至（107.25±5.26）、（148.20±5.34）min以及（185.80±8.53）min。提示隨著高F值玉米肽劑量的提高，大鼠力竭運動時間呈線性遞增。

圖1 高F值玉米肽對大鼠力竭運動時間的影響Fig. 1 Effect of high F-value corn peptide on exhaustive exercise time in rats

2.2 高F值玉米肽對大鼠力竭運動后血乳酸水平的影響

血乳酸水平是評價運動疲勞的一項重要指標。如圖2所示，對照組在力竭運動后5 min，其血乳酸水平急劇上升（由運動前的（2.38±0.26）mol/L上升至（17.88±0.89）mol/L），且在力竭運動后15 min其血乳酸濃度依然維持在（14.90±0.85）mol/L，恢復較慢。在力竭運動前，灌胃3 種劑量高F值玉米肽的實驗大鼠血乳酸水平沒有明顯差異，低、中、高劑量組分別為（2.84±0.46）、（2.87±0.53）mol/L和（2.90±0.34）mol/L；而在力竭運動后5 min，低、中、高劑量組大鼠的血乳酸濃度分別為（8.94±0.54）、（7.86±0.57）mol/L和（6.98±0.91）mol/L，均顯著低于對照組（P＜0.05）；在力竭運動后15 min，灌胃高F值玉米肽實驗大鼠的血乳酸水平進一步下降，分別為低劑量組（7.52±0.47）mol/L、中劑量組（6.47±0.44）mol/L、高劑量組（5.50±0.62）mol/L。高F值玉米肽高劑量組在力竭運動后5、15 min的血乳酸水平均顯著低于低劑量組（P＜0.05）。

圖2 高F值玉米肽對大鼠力竭運動后血乳酸水平的影響Fig. 2 Effect of high F-value corn peptide on blood lactate levels in rats after exhaustive exercise

2.3 高F值玉米肽對大鼠骨骼肌線粒體ATP酶活力的影響

如圖3所示，在服用低、中、高劑量高F值玉米肽并進行長期游泳訓練后，運動疲勞模型大鼠股四頭肌線粒體ATP合成酶活力由對照組的（1.47±0.18）U/mg分別上升至（1.75±0.25）、（1.96±0.21）、（2.13±0.15）U/mg；腓腸肌線粒體ATP合成酶活力分別由對照組的（1.65±0.23）U/mg上升到（2.09±0.17）、（2.17±0.18）、（2.53±0.14）U/mg，ATP合成酶活力的提高與高F值玉米肽劑量呈線性依賴關系，其中高劑量高F值玉米肽組線粒體ATP合成酶活力與對照相比顯著提高（P＜0.05）。由此可知，高F值玉米肽可以通過提高ATP合成酶活力間接增加骨骼肌中的能量供應，從而降低運動疲勞發生幾率。

圖3 高F值玉米肽對大鼠股四頭肌（A）和腓腸肌（B）線粒體中ATP合成酶活力的影響Fig. 3 Effect of high F-value corn peptide on ATP synthase activity in mitochondria of rat Quadriceps (A) and Gastrocnemius (B) muscle

ATP水解酶是一種存在于組織細胞膜及細胞器膜上的蛋白酶，其在物質運送、能量轉換以及信息傳遞中發揮重要作用。本研究考察不同劑量高F值玉米肽對實驗大鼠腓腸肌及股四頭肌線粒體中ATP水解酶活力的影響，如圖4所示，服用低、中、高劑量高F值玉米肽實驗大鼠股四頭肌中ATP水解酶活力由對照組的（2.975±0.232）U/mg分別上升到（4.252±0.347）、（5.296±0.229）、（6.528±0.459）U/mg（P＜0.05），同時腓腸肌中ATP水解酶活力由對照組的（2.157±0.259）U/mg分別上升到（3.512±0.364）、（5.327±0.415）、（6.716±0.548）U/mg（P＜0.05）。經8 周游泳訓練后，服用高劑量高F值玉米肽的大鼠腓腸肌和股四頭肌線粒體中ATP水解酶活力均較低劑量組大鼠顯著上升（P＜0.05）。

圖4 高F值玉米肽對大鼠股四頭肌（A）和腓腸肌（B）線粒體中ATP水解酶活力的影響Fig. 4 Effect of high F-value corn peptide on ATP hydrolase activity in mitochondria of rat Quadriceps (A) and Gastrocnemius (B) muscle

2.4 高F值玉米肽對大鼠運動疲勞所致骨骼肌氧化損傷的影響

大鼠在8 周游泳訓練結合服用高F值玉米肽后進行一次性力竭運動，如圖5A所示，對照組大鼠外周血中SOD活力為（10.43±1.53）U/g，而服用低、中、高劑量高F值玉米肽的大鼠外周血中SOD活力分別提高至（12.74±0.85）、（13.58±1.31）、（15.07±1.36）U/g，與對照組相比，高劑量高F值玉米肽組大鼠外周血中SOD活力顯著提高（P＜0.05）。

如圖5B所示，8 周游泳訓練結合服用低、中、高劑量高F值玉米肽的大鼠在一次性力竭運動后骨骼肌組織中MDA含量由對照組的（213.79±21.47）nmol/mg分別降低至（192.87±18.32）、（182.68±17.25）、（160.53±12.21）nmol/mg，且與對照組相比高劑量組MDA含量顯著下降（P＜0.05）。由此可見，相對于低、中劑量組，高劑量高F值玉米肽降低實驗大鼠骨骼肌中MDA產生的作用更顯著。

Nrf2是重要的抗氧化基因轉錄因子，服用高F值玉米肽能夠使核內Nrf2和胞漿內游離Keap1的表達水平提高（圖5C），表明高F值玉米肽可能促進了Nrf2-Keap1二聚體的分解，加速Nrf2進入并定位于核內，最終促進下游抗氧化基因的表達。

圖5 高F值玉米肽對大鼠運動疲勞所致骨骼肌氧化損傷的影響Fig. 5 Effect of high F-value corn peptide on oxidative damage of skeletal muscle induced by exercise fatigue in rats

2.5 高F值玉米肽對大鼠骨骼肌中線粒體融合的影響

線粒體是合成ATP的重要場所，因此進一步考察長期服用高F值玉米肽對大鼠骨骼肌線粒體質量的影響。如圖6所示，長期服用高F值玉米肽可以提高線粒體融合蛋白Mfn2的表達，降低裂解蛋白Drp1的表達，表明長期服用高F值玉米肽可能有利于促進線粒體融合，使處于非最佳狀態的線粒體通過互相融合提高質量，從而最終提高合成ATP的能力。

圖6 高F值玉米肽對大鼠骨骼肌中線粒體融合的影響Fig. 6 Effect of high F-value corn peptide on mitochondrial fusion in rat skeletal muscle

3 討 論

乳酸的積累是運動疲勞產生、運動能力下降的重要原因，也是評估運動疲勞水平的一項重要指標[11]。從本研究結果可以看出，與對照組相比，長期給予不同劑量高F值玉米肽能夠顯著降低力竭運動大鼠體內的血乳酸濃度，促進血乳酸代謝。同樣地，昌友權[12]研究發現，玉米肽可以顯著延長小鼠的游泳時間和爬桿時間，并證實服用玉米肽后小鼠血清尿素氮水平明顯降低、肝糖原和肌糖原含量顯著提高，提示玉米肽具有延緩運動疲勞的作用[12]。本研究結果提示高F值玉米肽能夠通過降低機體血乳酸的產生對抗運動疲勞，提高運動能力。高F值玉米肽含有豐富的支鏈氨基酸，支鏈氨基酸可以直接改善骨骼肌線粒體功能，減輕疲勞[13]，其在體內產生ATP的效率也高于其他氨基酸，并能減少運動過程中大腦5-羥色胺的積累，防止中樞神經疲勞[14]。在動物實驗中，支鏈氨基酸可明顯抑制大鼠急性運動后骨骼肌線粒體膜脂質過氧化物增加和膜流動性下降，保護線粒體膜脂質雙層結構的穩定性和正常生物功能[15]。同時，補充支鏈氨基酸能降低線粒體內Ca2＋、Mg＋、K＋的變化幅度，維持胞內鈉濃度，改善骨骼肌線粒體功能，并調節血液中氨基酸平衡，降低蛋白質的分解，提高機體抗運動疲勞能力[16-17]。

本研究還發現，長期服用高F值玉米肽能夠有效增加運動疲勞產生時骨骼肌組織中SOD活力，降低MDA含量，且存在劑量-效應關系。SOD是體內唯一以氧自由基為底物，能夠清除機體自由基的重要抗過氧化酶，SOD活力是評價機體在運動過程中受氧自由基損傷程度的一項重要指標[18]。大量研究證實提高SOD活力增加氧自由基的清除在疲勞消除中發揮重要作用。李酉坤等[19]發現聯合應用茶多酚、VE以及硒可以顯著提高急性運動疲勞大鼠外周血中SOD活力，從而對抗疲勞產生。郝紅梅等[20]也發現補中益氣湯可以顯著提高運動疲勞大鼠血清SOD活力，且呈劑量依賴性。MDA是脂質發生過氧化反應的終產物。氧自由基能與生物膜中的多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，進而造成細胞膜流動性降低，膜上的酶、受體及離子通道受損，三羧酸循環的電子傳遞遭到破壞等，最終導致運動疲勞的發生。已有研究證明，降低大強度運動后MDA的產生是對抗運動性疲勞的有效手段[21]。潘華山等[22]發現服用人參皂苷Rb1和Rg1能夠顯著降低運動疲勞模型小鼠MDA含量并發揮抗運動性疲勞效應。井宏穎等[23]也發現地黃飲子可以降低疲勞模型小鼠的MDA含量，保護線粒體結構，增強清除自由基和抑制氧化應激的能力，具有緩解運動疲勞的作用。

能量的直接供給來自ATP的水解，ATP水解酶能將ATP水解為二磷酸腺苷。ATP一旦被水解便立即由磷酸肌酸（phosphocreatine，PCr）和二磷酸腺苷重新合成，因此機體工作時產生的能量供應實際就是ATP的分解與合成[24]。ATP水解酶活力降低被認為是運動能力下降的重要原因，研究顯示力竭運動小鼠肝臟組織中Na＋-K＋-ATPase、Ca2＋-Mg2＋-ATPase和總ATP酶活力均降低，這是因為ATP酶活力下降會導致神經元興奮性異常，從而出現中樞疲勞。高壓氧治療后，ATP酶活力均升高，并且有效延長了小鼠的力竭運動游泳時間[25-27]。因此，提高ATP水解酶活力對緩解運動疲勞、提高運動能力具有積極作用。王蕾等[28]發現補中益氣丸可顯著提高疲勞模型小鼠腦組織中Na＋-K＋-ATPase和Ca2＋-ATPase的活力，對運動疲勞造成的小鼠腦組織能量代謝紊亂具有保護作用。外源性PCr干預運動疲勞小鼠后，PCr提高了Ca2＋-ATPase活力，保證ATP的供應，改善微循環，增加鈣泵活力，從而發揮抗疲勞和提高運動能力作用[29]。李爽等[30]發現黃芪總苷能夠有效提高運動性疲勞模型大鼠骨骼肌中ATP水解酶活力，進而提高運動能力。本研究也發現，長期服用高F值玉米肽可以有效增強運動疲勞大鼠股四頭肌及腓腸肌線粒體中ATP水解酶活力，并且隨劑量增加，ATP水解酶活力逐步提高。

Nrf2是細胞調節抗氧化應激的關鍵轉錄因子，受Keap1調控，通過與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）相互作用促進各抗氧化酶的表達。Nrf2高表達能夠促進機體的抗氧化作用，降低機體的氧化應激反應[31]。Keap1是Nrf2的多區域抑制蛋白，是Nrf2的高度專一性受體。通常，Nrf2以非活性狀態存在于胞漿中，與抑制蛋白Keap1高度結合并處于動態平衡，維持機體的氧化應激平衡[32]。當受到氧化應激或親電子物質作用時，Keap1與Nrf2耦聯作用減弱，Keap1被釋放到胞漿，而游離的Nrf2進入細胞核，與核轉錄因子Maf結合后啟動ARE，形成NRF2-Maf-ARE復合體，從而最終啟動下游抗氧化基因的表達，增強機體的抗氧化應激能力[33]。當氧化應激產物減少時，胞漿內游離的Keap1又可以進入細胞核，重新與Nrf2結合形成非活性狀態的Keap1-Nrf2二聚體形式。在本研究中，長期服用高F值玉米肽，特別是高劑量高F值玉米肽，能夠明顯上調細胞核內Nrf2表達量，同時胞漿內游離Keap1水平也增加；同樣地，在服用高F值玉米肽后，運動疲勞模型大鼠骨骼肌中SOD活力明顯增強，MDA含量減少。綜上，認為當機體受到氧化應激信息刺激時，高F值玉米肽可以通過促進Keap1-Nrf2二聚體的解離，促進Nrf2入核結合ARE，從而在核內激活下游抗氧化基因的表達，最終發揮抗氧化功能。

線粒體是細胞內的重要細胞器，也是細胞產生ATP的場所，因此線粒體的數目與質量對于ATP的產生發揮重要作用。Mfn1/2是參與線粒體融合的線粒體外膜蛋白[34]。內質網-線粒體之間的聯系對于線粒體的融合很關鍵，而Mfn2在內質網和線粒體交界處富集，對內質網與線粒體結合形成線粒體相關內質網膜具有重要影響[35]。Drp1是哺乳動物中線粒體分裂的必需蛋白，主要存在于胞漿，當線粒體分裂時才移位到線粒體表面。Drp1移位到線粒體外膜，并且集聚于線粒體潛在的分裂位點，通過水解三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）并逐漸壓縮線粒體直至斷裂，完成線粒體分裂。Drp1還可以調節線粒體微管的分布過程，從而維持線粒體的形態。Drp1主要通過3 種形式發揮其功能：其一，與GTP結合并將其分解為二磷酸鳥苷和磷酸，參與線粒體剪切；其二，發揮水解酶的功能，可能水解線粒體外膜脂質層；其三，與核酸特異性結合，調節核基因的功能[36]。本研究結果表明，長期服用高F值玉米肽可以上調骨骼肌組織中Mfn2表達，相反降低線粒體裂解蛋白Drp1的表達[37]。因此認為，高F值玉米肽可以促進線粒體的融合，抑制其分裂，從而有利于線粒體保持良好狀態。

綜上所述，高F值玉米肽能夠加速實驗大鼠血乳酸的清除，延長力竭運動時間，提高運動能力。其機制可能在于：一方面，高F值玉米肽通過激活Nrf2/Keap1信號通路，增強抗氧化基因表達，從而減少骨骼肌中MDA的產生，增強SOD活力，降低氧自由基積累對線粒體的破壞；另一方面，高F值玉米肽可以通過促進線粒體融合并抑制其裂解，維持線粒體功能穩定；此外還發現，高F值玉米肽可以增強ATP水解酶活力加速ATP分解，同時增強ATP合成酶活力促進ATP產生。