谷子單籽粒醇溶蛋白提取方法的建立及其在雜交種純度鑒定中的應用

崔燕嬌， 劉 丹， 趙子龍， 李素英， 張 靜， 劉正理

(1.唐山師范學院生命科學系，河北 唐山 063000； 2.天津市農業科學院農作物研究所，天津市農作物遺傳育種重點實驗室，天津 300384)

谷子[Setariaitalica(L.) P. Beauv]是起源于中國的一種古老作物，營養價值高，富含人體所需的多種維生素、氨基酸和礦物質，具有抗旱、耐瘠薄、抗逆性強的特點，尤其適合在北方干旱和半干旱地區種植。雜種優勢利用已經成為提高作物產量的有效途徑，在谷子雜交種應用方面已經獲得了一定突破[1-2]。谷子雜交種是由不育系母本和恢復系父本配組育成的兩系雜交種，且母本具有5%左右的自交結實率，因此在制種過程中不可避免地會導致雜交種中混雜一定的不育系自交種。此外，由于授粉時雜株花粉的污染、收獲時的機械混雜以及收獲后的處理程序等原因，也會導致雜交種中混有恢復系和其他假雜交種，從而嚴重影響谷子雜交種的純度[3-4]。這些假雜種或者幾乎沒有產量，或者產量明顯低于真雜交種，它們的存在必然導致雜交種增產潛力得不到充分發揮。因此，如何有效地鑒定谷子雜交種的純度，成為保證雜交種增產效果的重要一環。

目前，雜交種純度的鑒定方法仍以田間小區種植鑒定為主，該方法主要是基于雜交種和親本的形態特征和生理特性，如幼苗顏色和除草劑抗性等。20世紀90年代以前，通常以苗色較深的谷子恢復系做父本，苗色較淺的不育系做母本，以此來區別混雜在雜交種中的母本。20世紀90年代末，隨著抗烯禾啶除草劑恢復系的培育和應用，通過對谷子苗進行除草劑噴施處理，可以鑒別和去除混雜在雜交種中的不抗烯禾啶的不育系。然而，這2種方法均不能辨別出雜交種中混入的恢復系和其他假雜種，并且這些形態和生理指標易受環境條件影響，雜交種純度難以準確鑒定。

近年來，隨著功能基因組學的不斷發展，分子標記在種子純度鑒定方面的應用日益廣泛。這一方法不受環境影響、結果準確可靠，但是要求引物應達到一定數量、且多態性好，成本較高、操作也比較復雜，因而不適于進行大規模的雜交種純度鑒定，難以適應商業化開發[5]。所以，建立一種更簡便、快速、準確的雜交種純度鑒定方法，已成為當務之急。

自20世紀80年代末以來，醇溶蛋白電泳技術成為作物品種鑒定、遺傳多樣性分析和雜交種純度鑒定的有效手段，在小麥、玉米、水稻和高粱等作物中得到廣泛應用。醇溶蛋白是禾本科作物種子胚乳中的一種主要貯藏蛋白，其蛋白質譜帶完全受基因型控制，不受環境條件和栽培措施的影響，在品種間的多態性穩定豐富，并且在進化中更為保守，可以作為品種的“生化指紋”[6-7]。在谷子中，醇溶蛋白約占種子總蛋白的40%～60%，相對分子質量大小在1.3×104～5.5×104[8-11]。過去10年中，研究人員曾嘗試利用在小麥中廣泛應用的方法從谷子籽粒中分離醇溶蛋白并檢測其電泳圖譜[11-13]。然而，由于谷子粒小、蛋白質含量低、醇溶蛋白相對分子質量小且存在一定差別，小麥醇溶蛋白的提取方法很難直接應用于分離谷子醇溶蛋白，更不能從單粒谷子籽粒中提取醇溶蛋白用于雜交種純度鑒定。酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acidic polyacrylamide-gel electrophoresis，A-PAGE)是國際種子檢驗協會推薦的用于小麥品種鑒定和純度檢測的標準方法[14]，但是將其凝膠濃度和強度應用于谷子很難獲得理想的醇溶蛋白電泳圖譜[11]。因此，本研究對現有的醇溶蛋白提取方法和A-PAGE電泳技術進行改良，建立一種快速、易操作、成本低、準確性高的谷子單籽粒醇溶蛋白提取和電泳檢測方法，為谷子雜交種的純度檢測和種子管理提供一條簡便、可行的技術途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雜交谷子品種唐雜谷56229，其母本和父本分別為谷56A和HK229。2個常規谷子品種，冀谷31和冀谷32。

1.2 試驗方法

1.2.1 醇溶蛋白提取 谷子醇溶蛋白提取液中含有20%N,N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF)、20%蔗糖、50%異丙醇和去離子水。選取飽滿的單粒谷子籽粒，置于2 ml離心管中，利用組織研磨儀將籽粒研磨成粉末狀。向離心管中加入50 μl提取液，渦旋振蕩混勻后置于65 ℃烘箱中過夜。取出離心管，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至一新的1.5 ml離心管中，在4 ℃冰箱中保存用于A-PAGE電泳。

1.2.2 制膠 用于A-PAGE電泳的酸性聚丙烯酰胺凝膠溶液中含有15.000 0%丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺(Acr/Bis=29)、6.000 0%尿素、0.004 0%硫酸亞鐵、0.150 0%抗壞血酸、0.062 5%甘氨酸、1.250 0%冰醋酸、0.006 0%過氧化氫。

1.2.3 電泳 取30 μl谷子籽粒醇溶蛋白提取液，加入含有30 μl上樣緩沖液(80.00%甘油、0.02%甲基綠染料和去離子水)的1.5 ml離心管中，12 000 r/min離心1 min，振蕩混勻，重復離心1 min，4 ℃冰箱保存過夜后取10 μl加入點樣孔，以0.04%甘氨酸+0.40%冰醋酸溶液為電極液，在500 V電壓下電泳90 min。

1.2.4 染色與脫色 電泳后將凝膠置于含有0.1%考馬斯亮藍R-250、25.0%異丙醇、10.0%冰醋酸的溶液中染色10～20 min，漂洗后照相。

1.2.5 烯禾啶除草劑處理 唐雜谷56229雜交種和其父本HK229對烯禾啶除草劑具有抗性，而母本谷56A不抗烯禾啶除草劑，因此可以利用苗期除草劑噴施處理去除雜交種中混雜的母本，鑒定雜交種純度。取200粒唐雜谷56229的種子播種于土壤中，在4葉期噴施烯禾啶除草劑，在處理前和處理后7 d分別觀察谷子苗的生長和存活情況，并拍照記錄表型。為確保結果的準確性和可靠性，進行3次生物學重復試驗。

2 結果與分析

2.1 適于谷子單籽粒醇溶蛋白提取方法的建立

與玉米、小麥、高粱、水稻等作物相比，谷子的籽粒更小，其醇溶蛋白含量低，且相對分子質量小[11]，而進行雜交種純度鑒定必須以單粒種子為樣品。因此，對于利用谷子醇溶蛋白的多態性進行雜交種純度鑒定來說，提高醇溶蛋白的溶解性和提取效率至關重要，而這又與蛋白質提取所用的有機溶劑種類密切相關。在前人的研究中，異丙醇、DMF、乙醇、叔丁醇等溶劑曾用于谷子[12,15]、大麥[16-17]、小麥[6,18-22]、玉米[23]、珍珠稷[24]、黍[25]等作物籽粒醇溶蛋白的提取。在本研究中，為了建立適于谷子單籽粒醇溶蛋白提取的方法，我們在前人以異丙醇為有機溶劑提取谷子醇溶蛋白的基礎上，嘗試在提取液中加入DMF，利用含有不同種類和不同濃度溶劑的提取液進行醇溶蛋白提取，并通過A-PAGE進行電泳分離。結果表明，當提取液中只含有DMF或異丙醇一種溶劑時，醇溶蛋白溶解度較低，提取效率不高。相比之下，同時含有DMF和異丙醇的提取液能夠從單粒谷子籽粒中提取出更多的、相對分子質量分布范圍廣的醇溶蛋白，并且DMF和異丙醇的最適濃度分別為20%和50%。此外，為了增加提取液和谷子籽粒的接觸面積、促進醇溶蛋白的溶解，我們將谷子籽粒與提取液加入離心管后首先通過渦旋振蕩的方法使二者充分接觸、混合均勻，然后置于65 ℃烘箱中過夜，在高溫下促進醇溶蛋白與提取液的反應。結果表明，這些操作均有助于從單粒谷子籽粒中提取出醇溶蛋白。

2.2 醇溶蛋白多態性分析

除了醇溶蛋白的提取效率之外，A-PAGE電泳的條件，如上樣量、凝膠濃度、催化劑的用量等，也影響著最終的電泳效果。在本研究中，為了確保提取的籽粒醇溶蛋白盡可能多地沉積到點樣孔中，我們在A-PAGE電泳前向醇溶蛋白樣品中首先加入適宜劑量(30 μl)的含有80.00%甘油和0.02%甲基綠的上樣緩沖液。其次，將凝膠濃度由前人應用的12.5%[12,15]提高至15.0%，以獲得盡可能多的不同相對分子質量大小的醇溶蛋白清晰譜帶，充分反映供試樣品醇溶蛋白的多態性。有研究結果表明，抗壞血酸、硫酸亞鐵和過氧化氫等凝膠催化劑的用量是影響凝膠強度、聚合時間、形成網眼的孔徑大小等的關鍵因素，而這些因素進一步又影響著醇溶蛋白電泳譜帶的分辨率[26]。因此，在本研究中，我們以0.004%的硫酸亞鐵和0.006%的過氧化氫作為催化劑，通過提高催化劑的用量來增強凝膠強度，以獲得更高的醇溶蛋白譜帶分辨率和更明顯的電泳分離效果。此外，凝膠強度的提高也使凝膠與玻璃板更易分離，從而降低起板時的凝膠損傷率，維持凝膠的完整性。

在本研究中，我們利用同時含有20% DMF和50%異丙醇的提取液，從唐雜谷56229雜交種和其母本谷56A、父本HK229單粒籽粒中提取醇溶蛋白，以上述經過改良的A-PAGE條件進行電泳檢測。結果顯示，獲得的醇溶蛋白譜帶豐富，帶型清晰、明顯，且雜交種和親本間帶型表現出明顯的差異，具有較高的醇溶蛋白多態性和譜帶分辨率，表明通過單籽粒醇溶蛋白提取和A-PAGE電泳的方法可以對谷子品種進行有效的鑒定。

2.3 基于醇溶蛋白多態性的谷子雜交種純度鑒定

為了將建立的新方法應用于谷子雜交種純度鑒定，分別選取297粒和298粒來自于河北省邢臺市柏鄉縣上京村和白樓村的唐雜谷56229籽粒作為供試樣本，以來自于唐山師范學院遷西谷子科研實驗站的母本谷56A和父本HK229籽粒作為對照，提取單粒醇溶蛋白，通過A-PAGE電泳進行雜交種純度鑒定。通過將供試雜交種材料的醇溶蛋白譜帶與對照進行比較，發現來自于上京村和白樓村的供試樣本中分別有18.52%和32.55%的籽粒醇溶蛋白具有唐雜谷56229的特異譜帶，表明其為真雜交種；供試樣本中分別有70.71%和54.7%的籽粒醇溶蛋白譜帶與母本谷56A對照一致，表明其為樣本中混雜的母本；供試樣本中分別有10.77%和12.75%的籽粒醇溶蛋白譜帶與父本HK229相同，表明其為樣本中混雜的父本。從總體看，在所有供試雜交種材料中，平均真雜交種純度為25.55%，假雜種百分率為74.45%，包括混雜的母本(平均62.69%)和父本(平均11.76%)種子。

2.4 基于除草劑處理的谷子雜交種純度鑒定

為了對上述雜交種鑒定結果進行驗證，對相同來源的唐雜谷56229雜交種材料進行除草劑噴施處理，通過田間鑒定方法進行雜交種純度檢測。結果表明，噴施烯禾啶除草劑7 d后，來自于上京村和白樓村的雜交種供試材料中，分別有77.36%和55.63%的幼苗生長明顯受到了抑制，平均為66.50%，表明這些材料對烯禾啶除草劑沒有抗性，是混入雜交種中的母本，這一結果與基于籽粒醇溶蛋白多態性的鑒定結果(62.69%)基本一致，證明我們建立的醇溶蛋白提取和A-PAGE電泳方法用于谷子雜交種純度鑒定是可行且可靠的。在2份供試雜交種材料中，分別有22.64%(上京村)和44.37%(白樓村)的幼苗在噴施烯禾啶除草劑后仍然能夠正常生長，平均為33.51%。這一結果與基于籽粒醇溶蛋白多態性的鑒定結果(25.55%)存在一定偏差，主要原因在于該方法不能區分雜交種和恢復系等抗烯禾啶除草劑的假雜種，由此也證明通過籽粒醇溶蛋白的多態性進行谷子雜交種純度鑒定的結果更為準確。

3 討 論

張雜谷5號和唐雜谷5695的高產紀錄表明雜種優勢是提高谷子產量的有效途徑[1-2]，但是，雜交種中不育系、恢復系以及其他假雜種的混雜嚴重限制了雜交種的增產潛力及其推廣應用[3-4]。因此，要保證雜交種的增產效果，就必須鑒定雜交種純度，從而準確計算雜交種的適宜播種量。醇溶蛋白的A-PAGE電泳技術已經在小麥等作物的雜交種純度鑒定中得到應用，但是由于谷子粒小、蛋白含量低、醇溶蛋白相對分子質量小等特點，現有方法很難適用于谷子籽粒醇溶蛋白的提取和電泳分離。盡管一些研究人員曾嘗試將小麥醇溶蛋白電泳技術應用于谷子品種鑒定和遺傳多樣性分析，但是均需要10粒以上的種子才能夠提取到足夠的醇溶蛋白[12,15]，顯然這無法滿足雜交種純度鑒定必須以單粒種子為樣本的要求。本研究建立了一種適用于谷子的單籽粒醇溶蛋白提取方法和相應的A-PAGE電泳技術，并利用醇溶蛋白多態性鑒定谷子雜交種純度。在2019年和2020年，利用這一方法對河北豐苑種業有限公司生產的唐谷雜56229雜交種進行純度鑒定，結果分別為22.83%和25.55%。2020年，對河北衡研種業有限公司生產的唐雜谷5695雜交種進行純度鑒定，結果為22.93%。據此設計兩雜交種的播種量為7.5 kg/hm2，預計真雜交種出苗數約為1 hm24.6×105～5.1×105株，通過田間噴施間苗劑去除假雜種后，均可以達到1 hm24.5×105～5.2×105株的大田留苗密度。利用這一方法可以準確鑒定種子純度，從而維持谷子雜交種的增產效果，促進谷子雜種優勢利用。

醇溶蛋白因其溶于醇類而得名[27]，乙醇、異丙醇、叔丁醇等醇類曾用于多種作物籽粒醇溶蛋白的提取[6,16-17,21-25]。有研究結果表明，對谷子醇溶蛋白提取來說，異丙醇是比2-氯乙醇更適合的溶劑[15]，但仍很難從單粒籽粒中提取高濃度的醇溶蛋白用于多態性檢測。DMF可以增加蛋白質溶解度，也曾在一些研究中用于小麥醇溶蛋白的提取。因此，本研究以含有20% DMF和50%異丙醇2種溶劑的提取液進行谷子醇溶蛋白提取，發現獲得的醇溶蛋白濃度更高、譜帶更豐富。此外，醇類物質通常會吸收凝膠中的水分而導致膠孔彎曲、電泳條帶不整齊，而本研究建立的方法可以很好地解決這一問題，使醇溶蛋白譜帶更易觀察、多態性更易分析。

醇溶蛋白圖譜由遺傳因子決定，不受外界環境的影響，且在品種間存在差異，因而是遺傳多樣性分析和品種鑒定的理想“指紋”和遺傳標記[6]。本研究發現谷子雜交種的醇溶蛋白圖譜中呈現出不同于親本的特異譜帶，表明利用醇溶蛋白多態性可以區別混雜于雜交種中的親本，從而鑒定種子純度。在本研究中，利用醇溶蛋白多態性鑒定雜交種中混入的母本百分率與通過特定除草劑處理檢測的雜交種中混入的母本百分率相似，證明我們建立的谷子雜交種純度鑒定方法是可靠、有效的。根據谷子苗對除草劑處理的耐受性只能鑒別出雜交種中混雜的母本，而無法去除同樣具有除草劑抗性的父本材料，根據醇溶蛋白多態性則可以同時將雜交種中混雜的父本和母本材料鑒別出來，因此鑒定結果更為精確。此外，除草劑處理等田間鑒定方法往往周期較長，需要經歷育苗過程，且結果易受出苗率的影響。而基于醇溶蛋白多態性的鑒定方法只需以種子為樣本，在短短幾天內即可完成檢測，且結果不受溫度、土壤水分等環境和栽培條件的影響。因此，本研究建立的谷子單籽粒醇溶蛋白提取方法和A-PAGE電泳分離技術為谷子和其他作物的雜交種純度鑒定提供了一種更為簡便易行、快速精確的有力工具，有助于提高雜交種的增產潛力，促進雜交種的推廣應用。