腹膜透析患者血清lncRNA MEG3、miR-223水平與腹主動脈鈣化的相關性分析

李濤，謝賽，虞典元，江志鋒，李丹

腹膜透析可治療終末期腎臟病，但其治療過程中會出現血管鈣化等并發癥[1-2]。血管鈣化會增加血管脆性及心血管疾病的發病率[3]。因此如何有效預防腹膜透析患者腹主動脈鈣化(abdominal aortic calcification，AAC)是臨床醫師需關注的重點。長鏈非編碼RNA MEG3(long non-coding RNA MEG3，lncRNA MEG3)在癌癥中較為常見，可通過調節微小RNA-1930-5p(microRNA-1930-5p，miR-1930-5p)/混合系白血病Trithorax家族1(mixed lineage leukemia Trithorax 1，Mllt1)軸，導致腦出血后腦微血管內皮細胞功能障礙[4-5]。微小RNA-223(microRNA-223，miR-223)是一種與炎性反應密切相關的miRNA，可通過調節血管平滑肌細胞軸導致嚴重的冠狀動脈病變[6]。然而lncRNA MEG3、miR-223與血管鈣化的相關性目前尚缺乏研究報道，因此，本文旨在探討腹膜透析患者lncRNA MEG3、miR-223與AAC的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年9月—2021年9月武漢科技大學附屬孝感醫院腎臟內科收治的腹膜透析患者100例為研究對象，依據腹膜透析患者是否出現AAC分為AAC組52例(52.00%)和非AAC組48例(48.00%)。2組性別、體質量指數(BMI)、透析時間、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、高血壓、疾病類型、腎病家族史、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、血紅蛋白(Hb)、白蛋白(Alb)、血鈣(Ca)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。AAC組年齡、糖尿病比例、血磷(P)、腹主動脈鈣化評分高于非AAC組(P<0.05)，25-羥維生素D3低于非AAC組(P<0.01)，見表1。本研究經醫院倫理委員會批準(202008-05)，且患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①接受腹膜透析≥3個月者；②患者一般資料齊全；③1個月內未使用激素、免疫抑制劑及其他血液制品治療者。(2)排除標準：①近期內有創傷史、手術史或急性感染史者；②有影響鈣、磷代謝的相關疾病、惡性腫瘤及肝硬化者；③有精神障礙性疾病或行動不便，無法配合完成研究者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 臨床資料收集及生化指標檢測：收集患者性別、年齡、BMI、透析時間、收縮壓、舒張壓、高血壓、糖尿病、腹主動脈鈣化評分、疾病類型等一般資料。采用Cobas 6000型全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)檢測Ca、P、HDL-C、LDL-C、TC、TG、Hb、Alb水平，采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測25-羥維生素D3水平，按試劑盒(上海遠慕生物科技有限公司)說明進行操作。

表1 非AAC組和AAC組臨床資料及生化指標比較

1.3.2 血清lncRNA MEG3、miR-223水平檢測：收集所有腹膜透析患者入組時清晨空腹肘靜脈血5 ml，室溫放置30 min，離心收集血清并置于-80℃凍存。RNA提取試劑盒(北京康瑞納生物科技有限公司)提取總RNA后，按照反轉錄試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)說明書進行反轉錄合成cDNA，將得到的cDNA樣品通過7500型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)檢測血清lncRNA MEG3、miR-223表達，其引物序列見表2。

表2 lncRNA MEG3、miR-223及內參GAPDH、U6引物序列

1.4 AAC評估及分組 所有腹膜透析患者接受腹部CT檢查，根據腹主動脈走行區出現密度大于130 Hu的斑塊為AAC[7]；腹主動脈鈣化評分及分組：依據Kauppila等[8]的半定量評分系統進行評分，依次評價 L1～4 每個節段腹主動脈前壁、后壁鈣化的嚴重程度，根據該節段鈣化累及范圍給予1分(范圍 <1/3)、2分(范圍 1/3～2/3)和3分(范圍>2/3)，總得分為0～24分，當腹主動脈鈣化評分>4分時定義為重度AAC，否則為輕度AAC。根據檢查結果將AAC組患者分為重度AAC亞組21例和輕度AAC亞組31例。

2 結 果

2.1 非AAC組和AAC組血清lncRNA MEG3、miR-223水平比較 AAC組血清lncRNA MEG3高于非AAC組，血清miR-223低于非AAC組(P<0.01)，見表3。

表3 非AAC組和AAC組血清lncRNA MEG3、miR-223水平比較

2.2 重度AAC亞組和輕度AAC亞組血清lncRNA MEG3、miR-223水平比較 重度AAC亞組血清lncRNA MEG3高于輕度AAC亞組(P<0.01)，血清miR-223低于輕度AAC亞組(P<0.01)，見表4。

表4 輕度AAC組和重度AAC組血清lncRNA MEG3、miR-223水平比較

2.3 不同亞組AAC特點比較 重度AAC亞組腹主動脈鈣化評分高于輕度AAC亞組[(11.30±1.75)分vs.(3.35±0.61)分](t=19.959，P<0.001)。

2.4 腹膜透析AAC患者血清lncRNA MEG3、miR-223與臨床資料及生化指標的相關性 Pearson法分析結果顯示，腹膜透析AAC患者血清lncRNA MEG3與miR-223呈負相關(r=-0.552，P<0.001)。Spearman法及Pearson法分析結果顯示，腹膜透析AAC患者血清lncRNA MEG3與年齡、糖尿病、磷、腹主動脈鈣化評分呈正相關，與25-羥維生素D3呈負相關(P<0.05)；血清miR-223與年齡、糖尿病、磷、腹主動脈鈣化評分呈負相關，與25-羥維生素D3呈正相關(P<0.05)。見表5。

表5 腹膜透析AAC患者血清lncRNA MEG3、miR-223與一般資料及生化指標的相關性

2.5 血清lncRNA MEG3、miR-223水平預測腹膜透析患者發生AAC的價值 以腹膜透析患者是否發生AAC為狀態變量，以血清lncRNA MEG3、miR-223及二者聯合預測概率值為檢驗變量，繪制ROC曲線結果顯示，血清lncRNA MEG3、miR-223及二者聯合預測腹膜透析患者發生AAC的AUC分別為0.898、0.823、0.942，二者聯合預測腹膜透析患者發生AAC的價值大于單項預測(Z/P=1.667/0.048、2.441/0.007)，見表6、圖1。

圖1 血清lncRNA MEG3、miR-223水平預測腹膜透析患者發生AAC的ROC曲線

表6 血清lncRNA MEG3、miR-223水平預測腹膜透析患者發生AAC的價值

2.6 Logistic回歸分析腹膜透析患者發生AAC的影響因素 以腹膜透析患者是否發生AAC為因變量，以上述分析結果中有統計學意義的變量lncRNA MEG3、miR-223、年齡、糖尿病、磷、25-羥維生素D3為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示lncRNA MEG3高表達是影響腹膜透析患者發生AAC的獨立危險因素(P<0.01)，miR-223高表達是影響腹膜透析患者發生AAC的保護因素(P<0.01)，見表7。

表7 Logistic回歸分析腹膜透析患者發生AAC的影響因素

3 討 論

既往研究顯示，年齡、高血壓、血脂水平、炎性反應、鈣磷代謝紊亂等因素影響血管鈣化[9-10]。血管內膜出現的鈣化主要集中在大動脈，此血管鈣化主要與動脈粥樣硬化斑塊形成及衰老有關[11]。CT檢查是檢出血管鈣化的常用手段，不僅清晰度好、分辨率高，還能對血管鈣化程度進行定量研究[12]。本研究通過CT檢查結果發現，100例腹膜透析患者中，52例發生AAC，其發生率為52.00%，與文獻報道的AAC發病率基本一致[8]。然而CT檢查價格昂貴且會增加腹膜透析患者輻射暴露的風險，導致其臨床應用受限。因此需進一步探索更為便捷、有效且廉價的生化指標。

miR-223可通過外泌體形式進入血管平滑肌細胞，進而抑制平滑肌細胞的異常增殖和遷移[13]。韓迎春等[14]研究顯示，miR-223可降低炎性反應，敲除miR-223后將使血管炎性反應水平升高，同時促進動脈粥樣硬化疾病進展。Zhang等[15]研究結果顯示，細胞焦亡可導致內皮功能障礙，lncRNA MEG3可抑制miR-223功能，增強血管炎性細胞焦亡，進而導致內皮功能障礙，促進動脈粥樣硬化進展。本研究結果提示，腹膜透析患者血清lncRNA MEG3升高、miR-223降低可能與AAC的發生有關，且相關性結果提示二者可能在ACC病情發展中發揮協同作用。陳珍珍等[16]研究表明，lncRNA MEG3既可以通過促進內皮細胞增殖來調節血管內皮損傷，同時也能通過增加炎性介質促進內皮細胞凋亡。結合既往研究及本研究結果推測，部分患者在長期腹膜透析的過程中體內炎性水平升高，病理狀態造成lncRNA MEG3表達出現代償性升高，lncRNA MEG3負向調控靶基因miR-223使其表達水平降低，進而抑制血管內皮細胞的增殖及遷移，阻止血管損傷修復，加速血管鈣化。

此外，根據本研究相關性及多因素結果進一步推測lncRNA MEG3、miR-223雖與年齡、糖尿病等因素相關，但仍是獨立于年齡、糖尿病等因素的2個AAC標志物，且與年齡、糖尿病等因素相比，lncRNA MEG3、miR-223與AAC發生的相關性更高。本研究ROC曲線結果進一步表明聯合檢測血清lncRNA MEG3、miR-223水平有助于預測腹膜透析患者發生AAC，當lncRNA MEG3臨界值>1.18，miR-223臨界值<0.84時，腹膜透析患者發生AAC的風險較高，可警示臨床醫師進一步明確診斷，采取相應措施。此外，血清lncRNA MEG3、miR-223在不同嚴重程度AAC患者中的表達差異性進一步表明兩指標不僅能有效預測AAC的發生，而且lncRNA MEG3升高、miR-223降低可提示鈣化程度增加，但其相關作用機制仍待基礎研究進一步證實。

綜上所述，腹膜透析患者中AAC的發生率為52.00%，發生AAC的腹膜透析患者血清lncRNA MEG3升高、miR-223降低。lncRNA MEG3、miR-223有望成為預測腹膜透析患者發生AAC的標志物，但本研究中的預測截斷值仍需進一步優化。此外，受病例數限制，本研究中未能排除其他影響鈣化的相關因素，今后將增加樣本量，排除干擾因素的影響。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李濤：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；謝賽：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；虞典元、江志鋒、李丹:實施研究過程，資料搜集整理，論文修改