基于網絡藥理學探究三子養親湯治療慢性阻塞性肺疾病的作用機制

王 英， 陳 秋

[1.浙江大學醫學院附屬第二醫院長興院區(長興縣人民醫院)，浙江 湖州 313100；2.長興縣中醫院，浙江 湖州 313100]

慢性阻塞性肺疾病是可防可控的常見病，以持續呼吸道癥狀和氣流受限為特征，呼吸困難、咳嗽和(或)咳痰是其常見癥狀，我國該病患病率約為8.6%[1]，防治形勢嚴峻。本病屬中醫“咳嗽”“喘病”“肺脹”等范疇，主要病機是正虛積損，急性加重期以痰熱、痰濁、痰瘀為主兼氣虛、氣陰兩虛，穩定期以氣虛、氣陰兩虛為主兼有痰瘀[2]。

三子養親湯出自《韓氏醫通》，以紫蘇子主氣喘咳嗽，白芥子主痰，蘿卜子主食痞兼痰，特為年老咳嗽，氣喘、痰多而設，恰好契合慢性阻塞性肺疾病的呼吸困難，咳嗽、咳痰。Meta分析證明，三子養親湯加減能改善慢阻肺患者的肺功能、血氣分析結果和中醫證候積分[3]，其加味能改善急性加重期癥狀[4]。然而，三子養親湯治療慢性阻塞性肺疾病的作用機制尚不明確，故本研究基于網絡藥理學方法[5]，構建三子養親湯活性成分潛在靶點網絡，并對活性成分與慢性阻塞性肺疾病發病機制相關蛋白進行計算機虛擬預測，以期為進一步研究和臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分的篩選 檢索藥物的活性成分。在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索紫蘇子、白芥子、蘿卜子的活性成分，并根據ADME特征篩選活性成分，設定口服生物采用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18。

1.2 藥物及疾病靶點的篩選 在TCMSP平臺中逐一檢索活性成分的靶點蛋白，并采用Uniprot數據庫轉換成靶基因。TCMSP未檢索到數據的活性成分，在PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中獲取其2D分子結構，然后采用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)進行預測[6]，篩選可能性>0.11的條目，作為該藥物活性成分可能的靶基因，以保證靶點的合理性和完整性。以“chronic obstructivepulmonary disease”為檢索詞，分別檢索Genecards、OMIM數據庫。Genecards僅納入相關性得分>20的靶基因，OMIM納入全部檢索到的靶點基因。在R軟件(version 4.0.3)中采用VennDiagram包(version 1.6.20)繪制疾病靶基因和藥物靶點韋恩圖，得到的三子養親湯和慢性阻塞性肺疾病共有的網絡靶點。

1.3 “藥物-活性成分-靶點”網絡構建 對共有網絡靶點進行注釋，標注對應的藥物及其活性成分，形成藥物-活性成分-靶點的映射關系。然后采用Cytoscape 3.8.2軟件構建“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，同時獲得網絡節點表，根據degree值挑選出活性成分相關度高的網絡靶點。根據以上數據，分析三子養親湯治療疾病的可能靶點。

1.4 靶點蛋白互作網絡構建 通過STRING數據庫(version 11.0,https://string-db.org/)構建靶點蛋白互作網絡(PPI)。設定minimum required interaction score>0.9，獲得蛋白互作關系圖，分析功能蛋白質相互作用。將結果TSV格式導出，用R軟件統計靶點之間相互作用，分析關鍵網絡靶點。

1.5 GO、KEGG富集分析 在R軟件中采用clusterProfiler包(version 3.18.0)和Bioconductor數據庫(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)用于相關分析包，對篩選出的靶點進行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析，設定篩選閾值P-value<0.05，Q-value<0.05。對GO富集結果按照P值排序，各選取P值前10的條目進行可視化。分析網絡靶點的生物過程、分子功能、細胞組成和作用的信號通路。

2 結果

2.1 活性成分及靶點 在TCMSP平臺中檢索得到潛在活性成分共22種，包括紫蘇子16種，萊菔子3種，白芥子3種，見表1。在SwissTargetPrediction數據庫中選取匹配度最高的10個靶點進行整合，刪去重復(314個)后共得到藥物靶點192個，包括紫蘇子163個，芥子18個，萊菔子3個。

表1 三子養親湯潛在活性成分

2.2 疾病靶點篩選與“藥物-活性成分-靶點”網絡圖構建 從GeneCards數據庫中獲得疾病靶基因1 150個，從OMIM數據庫中獲得疾病靶基因1 231個，進行整合，刪去重復的疾病靶點，共獲得2 209個疾病靶點。藥物靶點與疾病靶基因取交集后，得到共有靶點85個，見圖1，提示三子養親湯有可能通過這些靶點治療慢性阻塞性肺疾病。將三子養親湯潛在活性成分22種與上述85個共有靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件中，得到“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，見圖2。由于連接度為1的基因表示在三子養親湯組分藥物治療疾病的過程中，僅有1種活性成分作用于該基因，為了清晰展示各個節點的關系，故在網絡圖中隱去。其中檸檬甾二烯醇、花生四烯酸、木犀草素連接的靶點基因較多；NCOA2、PGR、PTGS1、PTGS2、NR3C2、PPARG基因連接的藥物較多。紅色圓點表示靶點基因，紫色方塊表示紫蘇子的活性成分，藍色方塊表示白芥子活性成分，綠色方塊表示萊菔子活性成分。越靠近圓心字體越大，連接度越大，表示該成分連接的靶點(或該靶點承接的活性成分)越多。

2.3 蛋白互作網絡關系圖(PPI) 將85個靶點輸入String數據庫，得到蛋白互作網絡關系圖(圖3A)。圓點代表不同的靶點，不同顏色的連線表示不同的證據類型。用R軟件構建各靶點連接數直方圖，由圖3B可知，連接度最高的靶點依次為Akt1、MAPK1、JUN、RELA、IL6、MAPK14、EGFR、ESR1、MYC、VEGFA、IL2、IL4等，提示這些基因可能是關鍵作用靶點。

2.4 GO富集分析 三子養親湯參與1 844個生物過程、110個分子功能、43個細胞組分，根據P值分別列出了GO富集分析中排名前10的結果，見圖4。

主要涉及的生物過程有肌細胞、平滑肌細胞增殖、增殖及其調控，其相關靶點有HMGCR、PPARG、TERT、PTGS2、MAPK1、Akt1、GJA1、JUN、EGFR、CDKN1A、MMP2、MMP9、IL10、IL6、MDM2、HMOX1、IFNG、GSTP1、MAPK14、RBP4；上皮細胞的增殖及調控，凋亡相關的過程，其相關靶點有AR、ESR1、PPARG、VDR、SCN5A、CCND1、MAPK1、ALOX5、Akt1、VEGFA、MYC、F3、GJA1、BAX、JUN、EGFR、IL10、RB1、IL6、TP63、ERBB2、HMOX1、PSEN1、AGTR1；炎癥反應的調節，其相關靶點有CYP19A1、ESR1、PPARG、NOS2、PTGS2、RELA、TNFRSF1A、ALOX5、TNFRSF1B、EGFR、MMP9、IL10、RB1、IL6、NFKBIA、IL2、IFNG、IL4、GSTP1、MAPK14、AGTR1、PLA2G2A；氧化應激反應，其相關靶點有G6PD、PTGS2、PTGS1、RELA、MAPK1、CASP3、ALOX5、Akt1、BCL2、JUN、EGFR、MMP2、MMP9、IL10、IL6、MDM2、APP、HMOX1、GSTP1、MET、PSEN1。

主要涉及的分子功能有磷酸酶結合和蛋白磷酸酶結結合，其相關靶點有PTPN1、HMGCR、PPARG、SLC6A3、MAPK1、Akt1、BCL2、EGFR、ERBB2、MET、MAPK14；核受體活性，配體激活的轉錄因子的活性，類固醇結合、生長因子受體結合，其相關靶點有AR、ESR1、ESR2、PPARG、VDR、NR3C2、RARB、SERPINA6、VDR、NR3C2、ABCA1、CETP等。

細胞組分結果提示藥物的作用靶點主要位于脂筏、膜微區、膜區、細胞外器膜等處。

2.5 KEGG富集分析 三子養親湯的交集基因共涉及56條通路，根據P值分別列出了排名前20的通路，見圖5，涉及的通路主要集中于癌癥相關通路，其中與慢性阻塞性肺疾病聯系密切有小細胞肺癌和非小細胞肺癌。其他相關通路還有T細胞受體信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、細胞凋亡、Jak-STAT信號通路等。選擇主要信號通路Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路繪制通路圖，見圖6～7。

3 討論

既往研究發現，三子養親湯中的活性成分有對羥基苯乙腈、異香草酸、對羥基苯甲醛、胡蘿卜苷[7]、反式芥子酸、對羥基苯甲酸、β-谷甾醇[8]等。本研究發現，檸檬甾二烯醇、花生四烯酸、木犀草素可能是其重要活性成分。

活性成分連接個數最多的靶基因與激素受體和炎癥相關，如NCOA2、PGS、PPARG等。既往研究表明，慢性阻塞性肺疾病患者的核受體共激活受體(NCOA2)基因表達升高[9]，PPAR-γ激動劑(吡格列酮)對于慢性阻塞性肺模型巨噬細胞和嗜中性粒細胞具有清除效應[10]。蛋白互作分析得到的關鍵基因[11]與免疫調控、炎癥反應、血管和肺上皮細胞凋亡等相關，如Akt1、MARK1、VEGFA等。蛋白激酶B1(Akt1)的抑制劑和激活劑均對慢性阻塞性肺疾病表現出治療效果[12],阻斷MAPK通路可以控制慢性阻塞性肺疾病進展[13]。研究發現，三子養親湯能降低支氣管哮喘模型大鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、TNF-α水平[14]。血管內皮生長因子A(VEGFA)參與血管生成和內皮細胞生長，肺氣腫中VEGF活性下降，導致肺葉上皮細胞凋亡，提高了肺泡壁對氧化應激和蛋白酶的敏感性[15]。此外，雌激素受體(ESR)也值得關注，肺部存在所有ESR亞型，慢性阻塞性肺疾病患者肺部雌激素代謝酶mRNA表達存在變化，表明雌激素與疾病有關[16]。

GO功能分析顯示，三子養親湯可能調控了氣道平滑肌功能、上皮細胞增殖和凋亡等生物過程，磷酸酶結合、蛋白磷酸酶結合、激素核受體活化等分子功能。研究發現，氣道平滑肌障礙會影響氣道對刺激、重塑和纖維化的反應以及肺的順應性[17]；上皮細胞增殖和凋亡異常則導致氣道病變[18]；蛋白磷酸酶2A(PP2A)是調節慢性阻塞性肺疾病炎癥的關鍵因素[19]。KEGG通路分析顯示，三子養親湯涉及的通路與癌癥相關，有實驗證實慢性阻塞性肺疾病是肺癌發病的危險因素之一，且在炎癥、氧化應激、基因損傷修復以及免疫中存在相同機制[20]，提示三子養親湯或可改善其遠期結局。同時，KEGG分析所涉及的NOD受體通路參與固有免疫，T細胞受體通路參與特異性免疫，研究表明三子養親湯能夠通過調節Th17/Treg平衡失調抑制哮喘大鼠的氣道炎癥[21]，提示三子養親湯可能對免疫應答具有調控作用。Jak-STAT信號通路參與細胞增殖，既往研究表明三子養親湯聯合西醫治療哮喘可改善氣道重塑[22-23]，提示三子養親湯對氣道重塑的調控。

綜上所述，三子養親湯治療慢性阻塞性肺疾病，可能通過靶向基因NCOA2、Akt1、PTGS1/2、MAPK1/14、RELA等，調控磷酸化和核受體活性，調控T細胞受體通路、NOD樣受體通路、Jak-STAT通路等，調節上呼吸道平滑肌細胞、上皮細胞的增殖與凋亡，炎癥反應，氧化應激反應，進而發揮治療作用。