沉默乙酰肝素酶聯合那屈肝素對肺癌細胞的抑制作用及其機制

莊喜兵，袁素娟，張 琪，呂名鶴，程韻楓，喬田奎

(復旦大學附屬金山醫院腫瘤診斷與治療中心，上海 201508)

肺癌是目前世界范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，是癌癥相關死亡的主要原因[1]。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一種β-D-葡萄糖醛酸苷酶，能夠識別和切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)鏈，從而參與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的降解和重構[2]。HPA還能促進幾種與HS相關分子的釋放和擴散，如生長因子、趨化因子、形態因子和酶，這些分子對腫瘤的發展至關重要[2]。此外，HPA的表達在幾乎所有類型癌癥中均高表達，提示HPA可能成為肺癌治療的分子靶點。

上皮-間質轉 化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是一個正常的生理過程，上皮細胞發生形態分化，其特征是去極化、細胞-細胞間接觸消失和纖維母細胞樣形態延長，在癌癥的侵襲和轉移中起關鍵作用[3]。EMT的生物學特性已經明確為上皮標記物的丟失，如E-cadherin和細胞角蛋白，以及間充質標記物的獲得，如波形蛋白和纖維連接蛋白[4]。EMT是由多種信號通路中轉錄因子表達和激活介導的，包括轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生長因子、Wnt、Sonic Hedgehog、Notch和整合素等[5-6]。已有研究[7-8]表明，肺癌轉移和放化療耐藥與EMT密切相關。此外，非小細胞肺癌細胞可以通過EMT獲得腫瘤干細胞樣表型[9]。低分子量肝素是預防和治療血栓形成的有效抗凝劑，其結構與HS蛋白多糖的側鏈相似，可以競爭性抑制HPA活性，通過抑制HPA影響選擇素生成，抑制細胞黏附和腫瘤血管生成發揮抗癌作用，并與細胞周期和凋亡有關[10]。為探討HPA與EMT之間的關系，本研究旨在探索慢病毒介導內源性HPA的沉默與外源性那屈肝素(nadroparin)抑制HPA活性，兩者聯合對抑制A549細胞生長的作用及其潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1 細胞系人肺腺癌A549細胞，購自中國科學院上海細胞所，用含10%胎牛血清、RPMI-1640培養液，置于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養，將細胞傳代至指數生長期使用。

1.1.2 主要試劑靶向HPA的3種不同序列及陰性對照短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)的慢病毒載體由南京凱基生物有限公司設計合成，序列分別為：陰性對照shRNA，5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTCT-3′；shRNA1，5′-GCTCTGTAGATGTGCTATACA-3′；shRNA2，5′-GCAATGAACCTAACAGTTTCC-3′；shRNA3，5′-GCAAGCGTGCAAGGTTCAAAG-3′。慢病毒轉染增強劑凝聚胺(polybrene)購于南京凱基生物有限公司。嘌呤霉素購自EMD Millipore公司。那屈肝素由葛蘭素史克生產，商品名為速碧林。CCK-8試劑盒購于東仁化學科技(上海)有限公司，用于檢測細胞增殖。ELISA試劑購于R&D Systems，用于檢測培養上清中TGF-β1的濃度。基質膠Matrigel和transwell室購自BD公司。RNA快速提取試劑盒購于上海奕杉生物科技有限公司。Prime ScriptRTMaster mix和SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa生物科技有限公司。兔抗HPA、TGF-β1、磷酸化Smad2/3、鋅指E盒結合同源框1(ZEB-1)、鋅指轉錄因子SNAIL、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、N鈣黏蛋白(N-cadherin)和基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)購于瑞昊生物科技有限公司。兔抗TWIST多克隆抗體購自Cell Signaling Technology(CST)公司。山羊抗兔HRP二抗和小鼠抗GAPDH單抗購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 慢病毒轉染建立HPA沉默的A549細胞株及驗證

轉染試驗設5組，分別為空白對照組（A549細胞）、陰性對照組（轉染陰性對照shRNA序列）、轉染HPA shRNA1/2/3共3個沉默組。將指數生長期A549細胞按2×105個/孔的密度接種于6孔板中。置于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養24 h后，用PBS洗滌細胞，加入慢病毒感染細胞(感染復數=10)，同時加入2.5μg聚凝胺以增強感染效率。感染48 h后，用嘌呤霉素篩選出穩定沉默HPA的A549細胞株，流式細胞術檢測帶GFP熒光的細胞比例以觀察病毒感染效率。收集各組細胞，RNA快速提取試劑盒提取細胞總RNA，使用PrimeScriptTMRT Master反轉錄試劑盒進行反轉錄，得到cDNA樣品。引物序列由上海生工生物有限公司合成，HPA引物序列：上游5′-TCCTGCGTACCTGAGGTTTG-3′；下游5′-CCATT CCAACCGTAACTTCTCCT-3′。β-actin引物序列：上游5′-GTCTGCCTTGGTAGTGGATAATG-3′；下 游：5′-TCGAGGACGCCCTATCATGG-3′。采用常規實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測細胞HPA mRNA表達量。同時用Western blot檢測HPA蛋白表達水平。主要步驟如下：8%SDS-PAGE分離各組細胞總蛋白并轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)。用含5%脫脂牛奶的TBST在室溫下封閉1 h，用抗HPA一抗(1∶1 000稀釋)，4°C下孵育過夜，GAPDH抗體作為內參，TBST洗膜3次，滴加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)。PVDF膜用TBST再次洗滌，蛋白條帶用超敏發光液(ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate，EMD Millipore)顯影，Tanon-4500凝膠成像系統和GIS ID分析軟件v4.1.5(Tanon科技有限公司)進行半定量分析。以驗證慢病毒感染效果，篩選出最佳慢病毒序列進行后續實驗。

1.3 抑制實驗分組

抑制實驗按處理方式不同，共設6個組：空白對照組(A549細胞)、陰性對照組(轉染陰性對照HPA shRNA序列的A549細胞)、沉默HPA(轉染shRNA3的A549細胞)組、空白對照+那屈肝素組、陰性對照+那屈肝素組、shRNA+那屈肝素聯合組，那屈肝素濃度為100 U/mL，培養體系2 mL，總劑量200 U，處理48 h后進行相關檢測。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細胞活力

將各組細胞以5×103個/孔的密度接種到96孔板中，培養24 h。按1.3分組處理后加入CCK-8試劑(10μL/孔)，37℃下孵育1 h，在450 nm波長下檢測細胞吸光度，按下式計算細胞活力。

細胞活力=D(450)處理組/D(450)空白對照組×100%

1.5 細胞培養液中TGF-β1濃度測定

細胞接種于6孔板，密度約為2×105個/孔，按1.3分組處理后收集細胞培養液，使用ELISA試劑盒(R&D Systems，Inc.)說明書操作測定TGF-β1濃度。

1.6 細胞遷移和侵襲實驗

細胞處理同1.3，取2×104個處理后的細胞接種于transwell上室，加入200μL無血清RPMI-1640培養基，并將上室置于500μL含15%FBS RPMI-1640培養基的下室中培養48 h，然后加0.1%結晶紫在室溫下染色30 min，200倍光學顯微鏡下觀察穿過上室的細胞。細胞侵襲實驗中，transwell上室預涂基質膠，其余操作同遷移實驗。細胞分析使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics公司)。

1.7 Western blot檢測相關蛋白

細胞處理方法同1.3，收集細胞后用8%～10%SDS-PAGE分離各組細胞總蛋白并轉至PVDF膜。所用抗TGF-β1、磷酸化-Smad2/3、ZEB-1、SNAIL、TWIST、E-cadherin、N-cadherin和MMP-2，一抗和二抗稀釋比例均為1∶1 000，具體操作步驟同1.2。

1.8 統計學處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。實驗均重復3次，數據以±s表示。Student-t檢驗用于比較兩組之間的差異。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPA沉默A549細胞株的建立

慢病毒轉染A549細胞后，經嘌呤霉素篩選，在熒光顯微鏡下可以看到感染細胞呈現不同強度的綠色熒光，流式細胞術檢測不同shRNA的效率在80%～99%之間(圖1)。qPCR分析顯示，與空白對照組相比，3種不同的shRNA均不同程度地沉默HPA的表達，差異均具有統計學意義，并且shRNA3組HPA mRNA表達下調至21%(t=359.594，P＜0.01，圖2A)；Western blot結果顯示，shRNA3組HPA蛋白表達顯著降低(t=90.780，P＜0.01，圖2B)。可以看到，shRNA3沉默HPA的效果最強，因此選擇shRNA3轉染構建的A549細胞株進行后續實驗。

圖1 熒光顯微鏡及流式細胞術觀察慢病毒轉染效果

圖2 HPA沉默效果驗證(n=3)

2.2 HPA沉默聯合那屈肝素抑制A549細胞活力

CCK-8法檢測HPA沉默加或不加那屈肝素處理后A549細胞的活力。結果如圖3所示，與空白對照組比較，陰性對照組未抑制細胞活力，單獨那屈肝素處理或HPA沉默可使細胞活力下降(P＜0.05)，而兩者聯合抑制A549細胞增殖的作用更為顯著(P＜0.05)。具體從細胞活力值來看，聯合組細胞活力只有空白對照組的48.92%，空白+那屈肝素組為83.45%，陰性對照+那屈肝素組為83.08%，聯合組與后兩者比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

圖3 沉默HPA和/或那屈肝素對A549細胞活力的影響

2.3 HPA沉默聯合那屈肝素抑制A549細胞TGF-β1表達

TGF-β通路是EMT過程中的核心信號通路之一[11]。與空白對照和陰性對照組相比，ELISA檢測結果顯示在A549細胞中沉默HPA或經那屈肝素處理后TGF-β1水平明顯降低(圖4A，P＜0.05)。Western blot檢測發現HPA沉默和那屈肝素均可下調細胞TGF-β1蛋白的表達，聯合處理抑制效果更明顯(圖4B，P＜0.05)。

圖4 細胞培養液TGF-β1濃度及A549細胞中TGF-β1蛋白表達檢測結果

2.4 HPA沉默聯合那屈肝素抑制A549細胞遷移與侵襲能力

細胞的遷移和侵襲對體內惡性腫瘤的發生發展至關重要。與空白對照組和陰性對照組相比，單獨HPA沉默或那屈肝素均抑制了細胞的遷移能力(P＜0.05)。與其他組相比，聯合組抑制細胞遷移效果最顯著(P＜0.05)。在細胞侵襲實驗中也觀察到了類似的結果。綜合上述結果表明，HPA沉默抑制A549細胞的遷移和侵襲能力，而聯合那屈肝素處理則增強了這種抑制作用，具有協同作用，見圖5。

圖5 細胞遷移與侵襲實驗檢測結果

2.5 HPA沉默聯合那屈肝素抑制TGF-β1信號通路相關蛋白的表達

見圖6。與空白對照組比較，那屈肝素單獨處理可抑制A549細胞中SNAIL、TWIST和N-cadherin的表達水平，而E-cadherin的表達則增加(P＜0.05)。p-Smad2/3、ZEB-1和MMP-2表達水平未見明顯變化(P＞0.05)。此外，與空白對照組比較，單獨HPA沉默A549細胞中p-Smad2/3、ZEB-1、SNAIL、TWIST、N-cadherin和MMP-2的表達水平降低(P＜0.05)，同時E-cadherin的表達水平升高(P＜0.05)，兩者聯合作用差異更顯著(P＜0.05)。見圖7。

圖6 Western blot檢測TGF-β1信號通路相關蛋白的表達

圖7 TGF-β1信號通路相關蛋白表達

3 討論

乙酰肝素酶(HPA)在腫瘤進展、促凝活性、子癇前期和炎癥等多個病理過程中發揮著重要作用，并對硫酸乙酰肝素的降解有影響[12]。硫酸乙酰肝素降解過程中肝素結合生長因子的釋放會影響腫瘤微環境，從而影響基因表達，并通過與跨膜蛋白相互作用增強自噬、轉移以及血管生成[13]。多項臨床研究表明，HPA活性升高與腫瘤進展、轉移增強和預后不良相關[14-15]。相反，抑制HPA則與抑制腫瘤有關。Lou等[16]研究表明，從牛蒡子中提取的HPA抑制劑arctigenin可下調HPA的表達，抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力。

上皮間質轉化(EMT)起源于胚胎學，以改變細胞表型為特征，影響腫瘤的致瘤性過程，尤其是在腫瘤進展和轉移過程中起重要作用[17-18]。文獻[19]報道，EMT可導致腫瘤干細胞的發展，并與腫瘤侵襲、轉移、復發和放化療耐藥性相關。腫瘤微環境中癌細胞之間的相互作用可以通過自身和/或旁分泌介質，如生長因子、細胞因子和ECM蛋白，誘導EMT[20]。Shah等[21]報道HPA表達與EMT相關分子基因表達在胃印戒細胞腺癌組織中是一致的。因此，我們推測HPA活性與EMT密切相關。然而，HPA和EMT之間的確切聯系仍不清楚。

那屈肝素與HS蛋白多糖的HS側鏈結構相似，可以競爭性抑制HPA活性。本課題組前期研究發現，那屈肝素在抑制細胞活力、侵襲和轉移方面具有較強的抗腫瘤作用[22]，這也是本研究給藥的依據。本研究通過干擾HPA合成，并用那屈肝素處理抑制HPA的活性，證明聯合處理在體外具有協同抗腫瘤作用，顯著抑制了細胞活力、遷移和侵襲能力。

為了進一步探索那屈肝素抗腫瘤作用的分子機制，本文觀察A549細胞處理后EMT過程相關分子的變化。EMT誘導轉錄因子的表達和激活與多種信號通路相關，TGF-β信號是與EMT相關的特征性信號通路[23]。TGF-β配體與相應的受體(TGFβR2和TGFβR3)結合，導致I型受體(TGFβR1)磷酸化，這需要轉錄因子Smad2和Smad3參與，Smads被磷酸化，從而激活轉錄因子，誘導編碼EMT轉錄因子的表達，包括SNAIL、TWIST和ZEB-1[24]。這些轉錄因子導致上皮標記物(如E-cadherin和occludens 1)的表達或功能喪失，以及間充質標記物(如N-cadherin、vimentin、纖維連接蛋白和a-平滑肌肌動蛋白)和蛋白酶(如MMP-2/9)的增加[25]。有關低分子肝素與EMT之間的關系研究較少，Ponert等[26]發現低分子肝素減少胰腺和前列腺癌細胞中血小板誘導的上皮-間充質轉化，但具體機制未深入研究；Zhong等[27]報道了Fraxiparine可以通過抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路調控CXCL12-CXCR4軸抑制肺癌細胞活性。本研究為探索那屈肝素與EMT之間的關系及其可能的調控機制，檢測了HPA沉默和/或那屈肝素處理后A549細胞中TGF-β1的分泌和表達，結果表明兩者均抑制了TGF-β1的分泌和表達，尤其是在聯合處理組這種作用更顯著。值得注意的是，TGF-β1表達下調，磷酸化Smad2/3水平降低，相應下游EMT相關轉錄因子ZEB-1、SNAIL和TWIST的表達也出現不同程度的下調，E-cadherin上調，N-cadherin和MMP-2表達的下調。而且，那屈肝素單獨處理抑制了SNAIL和TWIST的表達水平，而ZEB-1的表達并無明顯變化。此外，HPA沉默抑制了SNAIL、TWIST和ZEB-1的表達水平，而聯合處理組卻未表現出增強的抑制，這表明可能有其他因素參與了這些重要轉錄因子的調控。HPA沉默和那屈肝素誘導的這些分子表達水平的變化導致了協同抗腫瘤作用，表現為抑制細胞活力、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究結果揭示了HPA在A549細胞惡性行為中的重要性，并表明沉默HPA與聯合那屈肝素處理對肺腺癌A549細胞具有協同抗腫瘤作用。其分子機制可能與TGF-β1表達的下調有關，TGF-β1下調磷酸化的Smad2/3以及參與調控EMT的3個重要轉錄因子ZEB-1、SNAIL和TWIST的表達水平降低，導致抑制間充質標記物(N-cadherin和MMP-2)的表達，同時上調了上皮標記物(E-cadherin)的表達。因此，通過HPA沉默聯合那屈肝素抑制EMT過程可能為肺癌治療提供一種新的策略。然而，還需要包括體內動物模型和其他潛在的信號通路的進一步研究，以驗證HPA聯合那屈肝素的抗腫瘤作用及其分子機制。