谷胱甘肽維生素C片的安全性評價

凌 敏，施偉慶，張 薇，梁 婕

(江蘇省疾病預防控制中心毒理與風險評估研究所，江蘇 南京 210009)

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種三肽，是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及磷酸丙糖脫氫酶的輔酶[1]。還原型谷胱甘肽是人體內自身合成的一種活性成分，具有酶活性和抗氧化活性，是體內重要的自由基清除劑[2]。臨床上還原型谷胱甘肽已經廣泛用于多種疾病的治療。維生素C(vitamin C，Vit.C)系脯氨酸羥化酶等8種酶的輔助因子或組成成分，直接參與體內的氧化-還原及羥化反應[3]。Vit.C作為一種抗氧化劑，除了可以保護細胞免受有害因素所引起的氧化性損傷外，在機體的新陳代謝中包括蛋白質的修飾、基因的表達以及生物防御功能的激活等均起著重要作用[4]。

本產品谷胱甘肽Vit.C片作為一種護肝片，對化學性肝損傷有一定的保護作用。本文根據2003年版《保健食品檢驗與評價技術規范》，進行30天喂養試驗，通過觀察大鼠的一般表現、血液學及血生化指標、組織病理學改變等對其進行安全性評價。為谷胱甘肽Vit.C片的進一步開發應用提供毒理學數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡SD大鼠80只，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物生產許可證號SCXK(京)2016-0011；屏障環境實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2017-0031。實驗室溫度20～24°C，濕度40%～70%。試驗期間動物自由飲水、攝食。

1.2 樣品

谷胱甘肽Vit.C片由南京某生物有限公司提供，生產批號2016062303。成人(體質量以60 kg計)推薦劑量為每人1 000 mg/d，即16.67 mg/(kg·d)。

1.3 主要試劑和儀器

生化試劑盒(寧波美康生物科技股份有限公司)，全自動生化分析儀(日本Olympus公司)，ADVIA?2120血細胞分析儀(德國Siemens公司)，RM-2245病理切片機(德國Leica公司)。

1.4 實驗動物分組及處理

大鼠適應性喂養3 d后隨機分為低、中、高劑量組(分別為417、834、1 667 mg/kg，相當于人體推薦劑量的25、50、100倍)和對照組(滅菌基礎飼料)。按劑量組設計要求分別稱取83、167和333 g的谷胱甘肽Vit.C片加入至2 kg基礎飼料中混勻后制成顆粒飼料，再以每日約100 g/mg的攝食量給于大鼠自由食用，連續喂養30 d。期間每天觀察動物的一般表現，每周記錄大鼠體質量、進食量，并與對照組比較。

1.5 血清生化和血液學指標檢測

喂養30天后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血，進行血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)等血清生化指標檢測和血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)總數及中性粒細胞(NE)、淋巴細胞(LY)、單核細胞(MO)、嗜酸性粒細胞(EO)、嗜堿性粒細胞(BA)分類等血液學指標檢測。

1.6 組織病理學檢查

采血結束后頸椎脫臼法處死大鼠，對各主要臟器進行大體觀察，取肝、脾、腎、胃、睪丸或卵巢稱量并計算臟器系數(臟器系數=臟器質量/體質量×100%)，臟器以10%甲醛固定后進行組織病理學檢查。

1.7 統計分析

實驗結果數據以±s表示。采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(One Way ANOVA)；若方差不齊，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠體質量的影響

試驗期間，各劑量組大鼠的生長發育良好，一般表現和行為均未見異常，亦無死亡情況；各劑量組雌雄大鼠多個觀察點的體質量和總體質量增量與對照組相比，差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠體質量的影響(g，±s，n=10)

表1 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠體質量的影響(g，±s，n=10)

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)第0天74±4 73±4 74±4 74±4 78±6 77±6 78±6 77±6第7天121±8 123±4 124±8 121±6 142±8 145±11 141±10 142±10第14天164±7 164±8 170±17 160±10 207±12 214±14 209±9 209±14第21天188±8 190±7 197±18 187±13 273±12 273±14 272±15 272±19第30天223±11 229±14 237±23 220±18 364±20 353±20 353±22 355±30體質量增量148±11 156±16 163±23 145±18 286±21 276±17 275±22 278±26

2.2 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠攝食量及食物利用率的影響

由表2和表3可見，對照組相比，雌雄大鼠不同觀察點及總的進食量和食物利用率差異均無統計學意義(P＞0.05)。

表2 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠每周進食量及總進食量的影響(g，±s，n=10)

表2 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠每周進食量及總進食量的影響(g，±s，n=10)

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)第1～7天119±10 117±7 120±9 118±9 137±9 137±10 133±14 134±9第8～14天155±12 161±9 164±15 153±12 175±10 182±13 176±11 179±9第15～21天137±7 142±9 139±6 135±7 196±7 189±8 192±9 190±9第22～30天165±8 174±12 174±14 166±14 253±19 244±18 244±15 251±19總進食量576±24 594±29 597±24 572±29 761±21 753±36 745±35 754±30

表3 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠食物利用率的影響(%，±s，n=10)

表3 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠食物利用率的影響(%，±s，n=10)

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)第1～7天39.8±6.4 42.1±2.4 41.9±5.6 39.6±6.3 47.6±5.0 49.3±2.4 47.5±4.3 48.9±3.5第8～14天27.7±5.5 25.7±2.8 27.5±6.7 25.7±3.1 36.9±5.2 37.9±3.5 38.6±2.6 37.5±3.5第15～21天17.2±3.6 18.6±2.5 20.1±5.3 20.1±2.8 33.5±3.8 31.4±5.2 33.2±5.1 33.3±4.3第22～30天21.3±5.1 22.3±4.7 23.0±5.4 19.6±6.2 36.3±6.8 32.6±3.7 33.0±5.1 32.7±6.6總食物利用率25.8±2.2 26.2±1.8 27.3±3.3 25.4±2.5 37.6±2.1 36.6±1.2 36.9±2.8 36.8±3.0

2.3 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠血液學指標的影響

由表4和表5可見，對照組相比，各劑量組大鼠的血常規及白細胞分類值差異均無統計學意義(P＞0.05)。說明谷胱甘肽Vit.C片對大鼠的血液學指標未造成明顯影響。

表4 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠血常規的影響(±s，n=10)

表4 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠血常規的影響(±s，n=10)

白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(HGB).

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)WBC/(×109/L)7.7±2.4 7.7±1.4 7.1±1.5 7.9±1.9 8.5±1.7 9.1±1.5 8.8±1.8 8.7±2.0 RBC/(×1012/L)6.6±0.3 6.6±0.2 6.5±0.3 6.6±0.1 6.6±0.2 6.7±0.3 6.6±0.4 6.5±0.3 PLT/(×109/L)1 104±166 1 113±180 1 060±140 1 089±142 1 112±121 1 061±113 1 120±137 1 152±128 HGB/(g/dL)11.8±0.5 11.8±0.5 11.7±0.6 12.1±0.4 11.9±0.4 11.9±0.6 11.9±0.6 11.8±0.6

表5 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠白細胞分類的影響(%，±s，n=10)

表5 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠白細胞分類的影響(%，±s，n=10)

中性粒細胞(NE)、淋巴細胞(LY)、單核細胞(MO)、嗜酸性粒細胞(EO)、嗜堿性粒細胞(BA).

BA 0.16±0.08 0.17±0.07 0.18±0.09 0.19±0.07 0.17±0.08 0.16±0.07 0.20±0.05 0.19±0.07性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)NE 17.6±4.4 17.5±4.4 17.8±6.6 14.3±4.0 18.6±5.2 17.8±3.8 15.9±3.5 16.8±3.4 LY 76.6±5.2 77.2±5.0 75.5±8.4 79.7±4.8 76.7±5.6 77.5±4.0 78.4±3.9 78.2±3.5 MO 3.2±1.0 2.8±0.7 3.9±0.9 3.3±0.9 3.2±1.1 3.2±0.5 3.9±0.8 3.4±0.8 EO 1.6±0.7 1.3±0.4 1.8±1.5 1.7±1.3 0.6±0.2 0.9±0.3 1.0±0.3 0.8±0.3

2.4 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠血生化指標的影響

由表6可見，與對照組相比，高劑量組雄性大鼠BUN值和雌性大鼠CRE值均升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，但數值仍在本實驗室歷史正常值范圍內。其余各劑量組的多項血生化指標值與對照組相比差異均無統計學意義(P＞0.05)。

表6 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠部分血生化的影響(±s，n=10)

表6 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠部分血生化的影響(±s，n=10)

丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)。與對照組相比，*P＜0.05.

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)ALT/(U/L)41±7 40±8 37±7 42±11 53±9 47±7 46±9 45±8 AST/(U/L)151±21 149±29 150±27 164±36 160±40 137±22 172±16 169±21 GLU/(mmol/L)5.9±0.3 5.9±0.4 5.8±0.4 5.6±0.4 6.2±0.8 6.6±0.3 5.7±0.6 5.7±0.3 TG/(mmol/L)0.85±0.26 0.80±0.39 0.92±0.42 0.78±0.17 1.34±0.52 1.14±0.31 1.37±0.43 0.98±0.37 CHO/(mmol/L)2.39±0.47 2.43±0.49 2.56±0.40 2.63±0.57 2.05±0.17 2.00±0.27 2.11±0.27 2.32±0.27 TP/(g/L)68±4 68±5 67±5 69±5 58±2 57±3 58±2 58±3 ALB/(g/L)40±3 40±3 39±3 40±3 30±1 30±1 31±1 31±1 BUN/(mmol/L)5.3±0.9 5.2±0.7 5.5±0.9 5.7±0.6 4.0±0.5 4.3±0.5 4.4±0.5 4.7±0.5*CRE/(μmol/L)25±2 25±3 26±1 28±4*22±2 21±1 22±2 22±1

2.5 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠臟器系數及組織病理的影響

從表7可見，與對照組相比，各劑量組大鼠臟器系數的差異均無統計學意義(P＞0.05)。大體檢查均未發現各劑量組臟器出現明顯異常，高劑量組的各大鼠肝、脾、腎、胃、卵巢或睪丸均未出現與谷胱甘肽Vit.C片有明顯相關的組織病理學改變(見圖1)。

表7 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠臟器系數的影響(%，±s，n=10)

表7 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠臟器系數的影響(%，±s，n=10)

*：雌鼠未作卵巢系數檢測.

性別雌性睪丸系數*----0.88±0.11 0.86±0.14 0.88±0.13 0.89±0.09雄性組別對照組低劑量(417 mg/kg)中劑量(834 mg/kg)高劑量(1 667 mg/kg)對照組低劑量(417 mg/kg)中劑量(834 mg/kg)高劑量(1 667 mg/kg)肝系數3.68±0.21 3.80±0.34 3.64±0.29 3.68±0.27 3.61±0.22 3.51±0.38 3.52±0.31 3.51±0.32腎系數0.88±0.03 0.88±0.06 0.87±0.06 0.84±0.07 0.86±0.09 0.84±0.05 0.86±0.06 0.86±0.08脾系數0.23±0.04 0.24±0.04 0.26±0.09 0.23±0.03 0.24±0.03 0.24±0.04 0.25±0.03 0.25±0.02

圖1 各胱甘肽Vit.C片連續30天喂養后的大鼠組織切片圖(×200)

3 討論

氧化還原狀態的失衡在各種疾病的發生發展中均扮演著重要角色，氧化應激反應會引起組織炎癥和損傷，谷胱甘肽的主要生理作用之一就是作為體內的一種重要抗氧化劑，可以通過清除或中和人體中產生的各種有害過氧化物質和自由基，從而降低氧化應激反應，起到調節機體免疫及控制炎癥的作用[5]。Vit.C作為體內的另一種重要抗氧化劑，可以抑制細胞釋放氧、清除細胞內外氧自由基、參與體內氧化-還原及羥化反應，發揮抗氧化作用[6]。Vit.C通過減輕氧化應激反應，促進受損組織細胞的修復[7]。研究表明谷胱甘肽和Vit.C均具有抵抗自由基攻擊和脂質過氧化的能力，從而起到保護機體免受外源性有毒物質損害，減少肝臟炎癥的作用[8-10]。臨床上也常用谷胱甘肽聯合Vit.C治療肝內膽汁淤積癥、感染性疾病致肝功能損害、原發性肝癌、酒精性肝病等[11-14]。

本試驗通過給予以417、834和1 667 mg/kg劑量(相當于推薦攝入劑量的25、50和100倍)的谷胱甘肽Vit.C片摻入基礎飼料中喂養大鼠30天，并且在本實驗室試驗條件下，該樣品30天喂養試驗高劑量組雌雄大鼠實際攝入劑量分別達2 095和1 983 mg/kg，相當于推薦攝入劑量的125和118倍，結果顯示：各劑量組動物一般情況良好，體質量未發生明顯異常改變；各劑量組雌雄大鼠每周體質量、每周及總進食量、每周及總食物利用率與對照組比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)；血液學指標及生化指標結果均顯示在正常值范圍內；臟器系數及高劑量組主要臟器的組織病理學檢查也未見明顯異常。結果表明谷胱甘肽Vit.C片在本試驗條件下未出現明顯的損害效應，具有較好的安全性。