脫水淫羊藿素維持人尿源性干細胞干性的作用研究

張憶雪，周 明，譙英固，王呈諭，孫震曉

(北京中醫藥大學生命科學學院，北京 102488)

人尿源性干細胞(human urine-derived stem cells，hUSCs)是從人尿液中分離培養出的一種具有良好增殖活性和多向分化能力的細胞亞群[1]。研究表明，hUSCs具有間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的多種生物學特征，且取材方便、無創、成本較低，在組織修復、疾病治療等領域均有重要的研究價值[2-5]。然而，hUSCs與其他干細胞一樣，也存在隨著繼代培養次數的增加，細胞干性逐漸減弱的問題，一定程度上影響了hUSCs的有效應用[6]。

Bharadwaj等[7]研究發現，來自不同個體所培養的hUSCs均高表達腎臟及腎小球足細胞的特異基因和蛋白標志物，揭示hUSCs可能來源于腎臟。淫羊藿作為補腎中藥的代表，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效[8]。淫羊藿苷(icariin，ICA)是淫羊藿的主要活性成分，口服后經腸道細菌分解能夠產生脫水淫羊藿素(dehydrated icaritin，DICT)等多種代謝產物[9-10]。研究發現，DICT能夠有效促進骨髓間充質干細胞成骨分化，修復裸鼠臨界性顱骨缺損[11-12]。此外，基于課題組前期利用中藥系統藥理學(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)數據庫和分子對接技術對維持hUSCs干性的小分子化合物進行篩選所得到的結果來看，DICT可能具有潛在的維持hUSCs干性的作用(數據未發表)。因此，本研究以hUSCs為研究對象，探討DICT對其干性的影響，為后續開展hUSCs相關研究與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品

脫水淫羊藿素，純度≥99%，購自上海源葉生物科技有限公司(批號YA0903SA13)。

1.2 主要試劑與儀器

角質細胞無血清培養基(keratinocyte serum free medium，KSFM)培養基、高糖-DMEM培養基、胰島素-轉鐵蛋白-硒(ITS)細胞培養添加物購自Gibco公司；Ham’s F12培養基購自Corning公司；青霉素-鏈霉素購自Amresco公司；胎牛血清購自Biological Industries公司；人表皮生長因子EGF購自美國Peprotech公司；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa)購自北京拜爾迪生物科技有限公司；四甲基噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)購自北京蘭博利德生物技術有限公司；PE-Cy7鼠抗人CD31、PE鼠抗人CD34、FITC鼠抗人CD44、APC鼠抗人CD90抗體均購自BD Pharmingenn公司；大容量多管離心機(LXJ-IIB)購自安徽安科生物工程(集團)股份有限公司；MCO-18AIC(UV)細胞培養箱購自Sanyo公司；ECLIPSE TE2000-S倒置相差顯微鏡購自Nikon公司；酶標儀購自Bio-Tek公司；流式細胞儀(Beckman CytoFLEXS)購自美國Beckman公司；實時熒光定量PCR儀(QuantStudioTM6 Flex)購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 hUSCs的分離與培養無菌條件下收集健康志愿者新鮮尿液樣本200～300 mL至無菌燒杯中。參照文獻[13]，室溫下以1 000 r/min離心10 min，棄上清，用1 mL PBS緩沖液洗滌沉淀，室溫下再以1 000 r/min離心5 min，棄上清，用1 mL hUSCs培養基輕柔重懸細胞后將其均勻接種在24孔板中，置于CO2體積分數為5%、37℃條件培養箱內培養，記為P0代。培養后第3天補500μL培養基，第5、6天分別半換液，之后每48 h進行一次半換液，待細胞長至匯合度為90%～100%時用胰酶消化傳代。通過倒置相差顯微鏡觀察hUSCs的細胞形態，并拍照記錄。

1.3.2 MTT法檢測hUSCs生長曲線及DICT對hUSCs活力的影響取生長狀況良好的P2代細胞，經0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，細胞以1 000個/孔的密度接種在96孔板中，每孔200μL培養基，設6個復孔，培養7 d。每天在鋪板同一時間點前4 h更換為100μL MTT工作液，繼續在CO2體積分數為5%、37℃條件下孵育4 h，棄去MTT培養基，每孔加入150μL DMSO，震蕩10～15 min至MTT代謝產物藍紫色甲瓚結晶完全溶解，用酶標儀在570 nm波長處檢測吸光值，并繪制hUSCs的時間-吸光度生長曲線。DICT處理組細胞接種培養方法同上，培養24 h后顯微鏡下觀察細胞貼壁并且生長良好時，去除培養基，分別加入含有0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μmol/L脫水淫羊藿素的培養基200μL，在細胞培養箱中培養，作用時間為1～7 d。后續處理同上。按下列公式計算細胞活力。

細胞活力=D(570)DICT藥物組/D(570)對照組×100%

1.3.3 流式細胞術檢測hUSCs表面標志物取生長狀況良好的hUSCs的P2代細胞，經0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，PBS緩沖液洗滌重懸細胞，將細胞濃度調整為6×105個/mL，分別取200μL細胞懸液于兩個5 mL EP管中，并加入小鼠抗人抗體CD34-PE、CD31-PE-Cy7及CD44-FITC、CD90-APC，4℃、避光條件下孵育30 min，再加500μL PBS緩沖液重懸細胞，室溫下以300 g離心5 min，棄上清，加入200 μL PBS緩沖液重懸細胞，過濾后上流式細胞儀檢測[14]。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測干性相關基因OCT-4、C-MYC的表達經文獻挖掘，與間充質干細胞干性相關的基因包括OCT-4、C-MYC、SOX2、NANOG、REX1等。Sato等[15]發現BIO能通過激活Wnt信號通路促進胚胎干細胞干性相關轉錄因子OCT-4、REX1和NANOG的表達，從而維持胚胎干細胞干性和自我更新能力。李佳瑋等[16]發現人參皂苷Rg1能夠促進骨髓間充質干細胞中OCT-4、SOX2、NANOG、C-MYC等轉錄因子的表達，提高細胞的干性水平。課題組前期研究表明，作為成體干細胞，hUSCs中的OCT-4、C-MYC基因表達較穩定，與其干性相關性強。因此，本研究首先選擇OCT-4、C-MYC兩種基因作為判斷hUSCs干性強弱的檢測指標。OCT-4、C-MYC與干細胞的干性維持密切相關，一般隨著干細胞繼代次數增加表達下降[17-19]。取生長狀況較好的P4代細胞，經0.25%胰酶消化制備成單細胞懸液，細胞以1×104個/孔的密度接種于6孔板中，每組平行設置2個復孔，每孔加入1.5 mL培養基，在CO2體積分數為5%、37℃培養箱中培養24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁并且生長良好時，去除培養基，加入含有2.0 μmol/L脫水淫羊藿素的培養基2.5 mL，置于培養箱中培養3 d，倒置顯微鏡下觀察細胞生物學形態，并拍照記錄。先按照RNA pure Total RNA Kit說明書提取各組細胞的總RNA，再按照Evo M-MLV反轉錄試劑盒說明書方法將總RNA反轉錄為cDNA，最后進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)對基因表達水平進行分析。β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內參基因。實驗中所用引物的序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.4 統計學方法

數據應用SPSS Statistics 20.0和Graphpad Prism 8軟件進行統計學分析，采用t檢驗對兩樣本均數進行比較，采用單因素方差分析對多樣本均數進行比較，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 原代培養及繼代培養hUSCs的形態學觀察

見圖1。從健康志愿者新鮮尿液中分離培養的hUSCs于接種后24～72 h后開始貼壁(圖1A)，大約6～8 d后細胞逐漸形成集落(圖1B)，8～12 d后細胞開始呈克隆狀生長(圖1C)，大約16 d后細胞擴增達到約90%～100%的匯合度(圖1D)開始進行第1次傳代培養，23 d后P2代細胞仍保持活力，形態呈飽滿的梭形(圖1E)，35 d后P4代細胞形態仍保持良好(圖1F)。

圖1 hUSCs原代及繼代培養細胞形態學觀察

2.2 hUSCs細胞生長曲線

MTT法檢測hUSCs細胞體外生長曲線，結果如圖2所示，基本呈S型曲線，1～4 d hUSCs增殖較快，細胞生長進入對數生長期，5～7 d細胞生長進入平臺期。

圖2 hUSCs生長曲線

2.3 hUSCs的表面標志物鑒定

流式細胞術測定hUSCs表面標志物結果如圖3所示，實驗所用P2代hUSCs細胞表面標志物CD44陽性率為74.10%，CD90陽性率為99.94%，CD34陽性率為2.12%，CD31陽性率為0.10%，表明hUSCs表達間充質干細胞表面標志物CD90和CD44，幾乎不表達造血干細胞表面標志物CD34和內皮細胞表面標志物CD31。

圖3 hUSCs表面標志物抗原表達

2.4 DICT對hUSCs活力的影響

MTT檢測0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μmol/L DICT對hUSCs細胞活力的影響，結果如圖4所示，6個濃度的DICT作用于hUSCs 3～6 d后，均有維持其細胞活力的作用。與對照組比較，DICT給藥濃度為2.0 μmol/L時，第3～6天細胞活力均明顯升高，差異均有統計學意義(P＜0.01)；給藥濃度為1.5和2.5μmol/L時，第3～5天細胞活力均明顯升高(P＜0.01)，第6天差異仍具有統計學意義(P＜0.05)。第7天時細胞活力均處于較低水平。綜合考慮，實驗選用2.0μmol/L的DICT進行后續干性基因表達實驗。

圖4 DICT對hUSCs細胞活力的影響

2.5 DICT作用后hUSCs細胞形態學觀察

對2.0μmol/L DICT分別作用3 d和7 d后的P4代hUSCs進行形態學觀察，結果如圖5所示，與對照組相比，2.0μmol/L DICT作用hUSCs 3 d后的生物學形態和細胞數量基本無明顯變化；作用7 d后，hUSCs雖形態上變化不大，但細胞數量有所增加。

圖5 DICT作用于hUSCs的形態學觀察

2.6 DICT對hUSCs干性基因OCT-4、C-MYC mRNA表達的影響

qPCR結果如圖6所示，與對照組對比，2.0μmol/L DICT組hUSCs干性基因OCT-4和C-MYC的mRNA表達量均顯著升高(P＜0.01)，表明2.0μmol/L DICT可使hUSCs干性基因OCT-4和C-MYC的表達上調。

圖6 DICT對hUSCs干性基因OCT-4、C-MYC mRNA表達的影響

3 討論

人尿源性干細胞作為一種來源廣泛、可在體外大量增殖的成體干細胞，現已在心血管、皮膚、骨骼修復以及疾病細胞造模等方面得到廣泛應用[20-22]，但也存在著傳代過程中隨代數增加細胞出現衰老、分化等問題[23]。本研究基于課題組前期篩選結果、實驗研究及相關文獻調研[24-26]，推測DICT可能具有維持hUSCs干性的作用，并選擇OCT-4、C-MYC兩種基因作為判斷hUSCs干性強弱的檢測指標，在細胞及分子層面上分別探究DICT對hUSCs干性的影響。通過常溫離心法成功培養出形態良好、具有間充質干細胞生物學特征的hUSCs，離心這一過程可將尿液中脫落的上皮細胞及雜質去除，隨著繼代培養過程，尿液中其他存活的細胞不再增殖，僅hUSCs仍保持旺盛的增殖能力。此外，通過MTT實驗結合形態學觀察確定DICT增強hUSCs活性的最適濃度，通過qPCR進一步探究了DICT對hUSCs干性基因OCT-4和C-MYCmRNA表達的影響，結果表明，DICT在一定濃度下具有維持hUSCs干性的作用。

研究表明，影響間充質干細胞干性的相關基因除OCT-4、C-MYC外還有NANOG、SOX2、REX1等，我們之前對這些基因在hUSCs中的表達及其與干細胞干性的相關性做過一些探索，發現SOX2和NANOG基因在hUSCs中低表達且表達不穩定，REX1表達變化較小指示性較弱，而OCT4和C-MYC基因表達較穩定且指示性強(結果未列出)，因此在本文研究DICT對hUSCs干性基因的影響中首先選擇這兩種基因作為研究對象。后續我們需要進一步擴大標志性基因的檢測，如對一些干細胞分化相關基因如ALP、SOX9、PPAR-γ2等表達的檢測，并借助生物信息學、網絡藥理學及分子生物學等技術手段深入闡明其相關作用機制，以進一步確認促進hUSCs干性的小分子化合物，為hUSCs的研究與臨床應用提供支持[27]。

中醫經典著作內經《素問·六節藏象論》中有記載“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也”。中醫學認為“精”是生命的起源，主要儲存在腎中，因此被稱為腎精[28]。干細胞作為形成機體和各器官組織的原始細胞，在生命起源及生理功能上與“腎精”有較多共性，是腎精的重要細胞生物學基礎[29]。如前所述，淫羊藿是中醫臨床重要的補腎中藥之一[30]，據文獻報道，淫羊藿苷及其他淫羊藿成分也具有一定的促間充質干細胞增殖分化作用[31-33]。此外，有關淫羊藿主要成分與其他藥物聯用對間充質干細胞的影響也逐漸被關注：有實驗表明，淫羊藿苷與雌激素聯用較單用顯著促進骨髓間充質干細胞增殖，且能夠規避雌激素替代療法的副作用[34]；淫羊藿苷與白藜蘆醇聯合應用比單用促進誘導性多能干細胞向心肌細胞分化的效果更好[35]。今后有關DICT及其他淫羊藿成分對干細胞增殖、分化及干性維持的研究還可以在多藥聯用、3D模型構建等領域繼續探索，這對解析淫羊藿的補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效作用具有重要意義。