大細胞肺癌移植瘤組織中HIF-1α、VEGF、Ki67、血清蛋白的表達及其與功能性血管數目的關系

吳 寶，白玉勤，李丹丹，楊占民，孔凡龍

(1．赤峰學院基礎醫學院組織胚胎學教研室，內蒙古 赤峰 024000；2．赤峰市腫瘤醫院/赤峰學院第二附屬醫院病理科，內蒙古 赤峰 024000；3．錦州醫科大學，遼寧 錦州 121000)

大細胞肺癌(large cell lung cancer，LCLC)是肺癌的一種罕見的病理類型，占非小細胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)的2%～3%[1]。與其他NSCLC相比，LCLC生長更快，轉移更早，惡性程度較高[2]，5年存活率約為15%～25%[3]。血管生成因子如缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible-factor-1α，HIF-1α)在NSCLC中的表達和作用已有較多研究報道[4]，但是在LCLC中尚未見相關研究。動物切除組織制作病理學標本過程中，因血流中斷、化學固定、酒精脫水步驟，通常會導致組織收縮、分子易位和抗原封閉等形成人工假象(artifacts)[5]。由日本山梨大學大野伸一教授研制開發的活體冷凍技術(in vivocryotechnique，IVCT)是在活體狀態下冷凍固定動物靶器官，可揭示血液流動狀態下的組織細胞結構，克服了傳統標本制作方法因血流中斷帶來的缺血缺氧等弊端[6]。2008年，我們利用IVCT技術在異種移植人NSCLC模型上首次清晰觀察到血清蛋白分布，提出了腫瘤間質及細胞外基質的血清蛋白分布與其相對分子質量密切相關，揭示了功能性血管與IgM和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白表達的關系[7-9]，提出了“功能性血管”概念，但尚未研究NSCLC組織中的功能性血管數目。HIF-1α蛋白作為血管生成因子，與腫瘤組織血管生成密切相關。在IVCT技術制備的標本上進行各種蛋白免疫組織化學染色(immunohistochemistry，IHC)，染色結果尤為清晰、準確定位。為了研究LCLC中功能性血管與HIF-1α蛋白表達關系，本研究取大細胞肺癌Lu65和Lu99細胞移植瘤石蠟包埋組織，采用IHC法分析HIF-1α、VEGF、Ki67及血清蛋白Albumin、IgG、IgM的表達，旨在探討Lu65和Lu99移植瘤組織中上述蛋白與功能性血管的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其移植瘤模型建立

1.1.1 實驗動物本動物實驗經日本山梨大學動物保護與使用委員會批準[8]。雄性BALB/c品系裸鼠(BALB/c-nu/nu)40只，購于日本SLC株式會社，鼠齡為7～8周，動物模型的建立和飼養均在日本山梨大學SPF級實驗動物房中進行[7-9]。

1.1.2 肺癌細胞株大細胞肺癌Lu65和Lu99細胞株由日本東北大學生物醫學研究所提供，在日本山梨大學醫學部解剖分子教研室的細胞培養室常規傳代培養[10]，兩種細胞株均培養于含20%小牛血清的RPMI-1640培養液中。

1.1.3 腫瘤細胞移植采用細胞培養移植法，先進行Lu65和Lu99細胞培養并傳代，收集約5×106個細胞接種到裸鼠背部皮下，方便觀察腫瘤。接種后每周兩次使用電子天平稱量裸鼠體質量，觀察裸鼠進食、飲水及腫瘤的生長情況，應用游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑。計算腫瘤體積方法[8]：腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2。待腫瘤體積達到1 000 mm3時進行病理形態學觀察[8]。Lu65細胞移植后約15 d，Lu99細胞株移植后約30 d腫瘤體積達到了1 000 mm3。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器設備牙科電鉆，磁力攪拌器，低溫冰箱，轉輪切片機(萊卡，RM2235)，白色透明濕盒，五片直立瓶，羅紋口玻璃瓶，防脫片，顯微鏡(奧林巴斯，BX53)。

1.2.2 主要試劑魚明膠購于Sigma公司；羊抗鼠血清蛋白和免疫球蛋白G1和M(IgG1、IgM)購自美國Bethyl Laboratories公司；兔抗人HIF-1α購自北京中杉金橋生物技術有限公司；VEGF和Ki67單克隆抗體購自邁新生物技術開發公司；與一抗種屬匹配的二抗兔抗羊IgG購自美國Vector Laboratories公司；顯色劑二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)試劑盒購自邁新生物技術開發公司。

1.3 標本的制備

活體冷凍固定移植瘤的步驟見圖1。帶有移植瘤的裸鼠用乙醚麻醉，剪開背部皮膚暴露移植瘤，用-196℃液氮致冷的異戊烷-丙烷冷凍液(-193℃)固定移植瘤制備標本[8]。在液氮中用牙科電鉆取下移植瘤組織后，移到-80℃干冰預冷的2%多聚甲醛-丙酮液中進行冷凍置換[6]。冷凍置換是固定在2%多聚甲醛-丙酮液的冷凍標本從-80℃逐漸升溫到室溫的過程。移植瘤冷凍置換后用聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物或石蠟包埋劑包埋，進行冰凍或石蠟切片，顯微鏡下觀察。本項目主要觀察移植瘤組織，轉移瘤不在本次研究范圍內。

圖1 活體冷凍固定移植瘤模式圖

1.4 免疫組織化學染色

石蠟標本3μm連續切片后貼附于含MAS的防脫載玻片。一部分切片進行蘇木精-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色；另一部分切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，最后蒸餾水水化后用PBS沖洗，用于IHC染色。IHC采用親和素-生物素-過氧化物酶(ABC)法。首先用1%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶活性，2%魚明膠溶液封閉。PBS漂洗3次，分別滴加一抗羊抗鼠血清蛋白Albumin、IgG1、IgM，兔抗人VEGF、HIF-1α和Ki67單克隆抗體，4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗后滴加二抗兔抗羊IgG或羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。DAB顯色，采用蘇木精進行細胞核淡染，梯度酒精脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每次染色均設空白對照(PBS)和自身陽性對照，自身陽性對照是在同一切片上與檢測的目的物對照比較。如Albumin在血管腔內應為陽性，IgG1和IgM在某些免疫細胞漿或血管腔內應為陽性，HIF-1α在腫瘤細胞核內為陽性，EGFR在紅細胞膜或某些梭形細胞漿應為陽性，Ki67在腫瘤細胞核應為陽性。

1.5 判斷標準

在連續切片上對Lu65和Lu99細胞移植瘤組織(包括血管、癌間質、癌細胞外基質)的Albumin、IgG1和IgM蛋白免疫組化染色強弱程度進行統計，若觀察到IgM蛋白免疫組化染色在血管腔內和其周圍細胞外基質呈棕黃色著色，則判定為非功能性血管；IgM蛋白免疫組化染色只是在血管腔內，其周圍細胞外基質無棕黃色著色，判定為功能性血管，計數功能性血管和非功能性血管數量。VEGF蛋白免疫組化染色在胞膜或細胞漿呈棕色判斷為陽性，無著色為陰性。HIF-1α在細胞核或漿呈棕色判斷為陽性，無著色為陰性。Ki67在胞核呈棕色判斷為陽性，無著色為陰性。光鏡(200倍)下選擇至少5個視野，按染色強度計分：無表達，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；黃褐色，3分。再按陽性率計分：陽性率=陽性表達細胞數/視野總細胞數×100%。陽性率=0，為0分；0＜陽性率＜25%，為1分；25%≤陽性率＜50%，為2分；陽性率≥50%，為3分。評估標準：將染色強度評分和陽性率評分相加，按1～3分記為低表達；4～6分記為高表達。

1.6 統計學分析

采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析。移植瘤組織中的功能性血管和非功能性血管數目以±s表示，組間差異比較采用兩樣本獨立t檢驗；HIF-1α蛋白免疫組化染色陽性細胞數以例數及其比例表示，組間比較采用χ2檢驗(Fisher確切概率法)；HIF-1α、VEGF及Ki67蛋白表達評分的相關性分析用Spearman秩相關進行分析；P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Lu65和Lu99移植瘤組織形態學觀察及HIF-1α蛋白的表達

Lu65和Lu99移植瘤組織連續石蠟切片的HE染色、HIF-1α蛋白免疫組織化學染色結果見圖2。HE染色見Lu65移植瘤組織中部分區域細胞核碎裂、胞漿呈紅染的壞死細胞形態。HIF-1α蛋白在Lu99移植瘤細胞核未見表達，呈陰性；在Lu65移植瘤組織少許腫瘤細胞核呈淺黃色著色，為低表達。統計分析結果顯示，HIF-1α蛋白在Lu65移植瘤組織中表達陽性率為100%，在Lu99移植瘤組織中表達陽性率為0，兩者差異有統計學意義(P＜0.05)。可見HIF-1α蛋白表達與Lu99和Lu65移植瘤腫瘤細胞異質性有關。

圖2 Lu65和Lu99移植瘤組織HE染色和HIF-1α蛋白免疫組織化學染色后的病理組織學觀察

2.2 VEGF和Ki67蛋白在Lu65和Lu99移植瘤組織中的表達及其與HIF-1α蛋白的相關性

Lu65和Lu99移植瘤組織VEGF、Ki67蛋白免疫組織化學染色結果見圖3。VEGF免疫組化染色在移植瘤組織周圍纖維結締組織和間質內某梭形細胞膜陽性表達，血管內皮細胞和紅細胞呈陽性表達，Lu65和Lu99移植瘤細胞漿呈陽性高表達。Ki67免疫組化染色在Lu65和Lu99移植瘤核呈陽性高表達。隨機取20個Lu65和Lu99移植瘤組織石蠟標本HIF-1α與VEGF、Ki67蛋白表達的評分采用Spearman秩相關進行分析，得到HIF-1α蛋白表達與VEGF蛋白表達評分相關系數rs=0.042，P=0.86；HIF-1α蛋白表達與Ki67蛋白表達評分相關系數rs=0.216，P=0.361。可見Lu65和Lu99移植瘤組織HIF-1α蛋白表達與VEGF和Ki67蛋白無明顯相關關系。

圖3 組織病理學觀察LU65和LU99移植瘤組織中VEGF和Ki67蛋白的表達

2.3 Albumin、IgG1和IgM蛋白在移植瘤組織中的表達及功能性血管數目的統計分析

Lu65和Lu99移植瘤組織HE染色和Albumin、IgG1、IgM蛋白免疫組織化學染色結果見圖4。在HE染色的移植瘤組織中觀察到擴張的血管及血管內紅細胞，并且在Lu65移植瘤組織中見部分區域細胞核碎裂、胞漿呈紅染的壞死細胞形態。Albumin免疫組化染色在血管、細胞外基質呈強-中度陽性。IgG1免疫組化染色在血管和癌周圍結締組織呈中度陽性，在細胞外基質呈弱陽性。IgM免疫組化染色在血管和癌周圍纖維結締組織呈中度陽性，但是在大部分細胞外基質呈陰性，少部分細胞外基質呈陽性。Albumin、IgG1和IgM蛋白在Lu65移植瘤組織的片狀壞死區呈非特異性著色(細胞核、細胞漿、細胞膜不清晰)。每張切片在200倍下隨機選取5個視野觀察血清蛋白(Albumin、IgG1、IgM)免疫組化染色表達部位，按方法中所述判斷標準，統計功能性血管和非功能性血管數目，結果見圖5。Lu65移植瘤組織的功能性血管數目為(7.80±1.03)條，非功能性血管數目為(1.20±0.92)條；Lu99移植瘤組織的功能性血管數目為(6.90±0.99)條，非功能性血管數目為(0.80±0.63)條。Lu65和Lu99移植瘤組織中功能性血管數目均高于非功能性血管(均為P＜0.05)。

圖4 Lu65和Lu99移植瘤組織HE染色和albumin、IgG1、IgM蛋白免疫組織化學染色結果

圖5 Lu65和Lu99移植瘤組織中功能性血管和非功能性血管數目的比較

3 討論

LCLC已被世界衛生組織列為重要肺癌亞型[11]，其發病率較其他類型的肺癌為低，誤診率高，且預后較差。LCLC預后差的主要原因是腫瘤細胞的快速生長、侵襲和轉移。腫瘤微血管形成在LCLC細胞生長和轉移過程中起到重要作用[12]。腫瘤血管生成與血管生成因子(VEGF和HIF-1α等)密切相關。我們研究證明了Lu99和Lu65移植瘤組織VEGF強陽性區域的血管壁不能透過大分子IgM，發現了NSCLC(包括LCLC)組織的功能性血管，并且功能性血管通透能力與血清蛋白相對分子質量密切相關[8]。HIF-1α是HIF-1的一個活性亞基，是含有堿性的螺旋-環-螺旋(bHLH)構型和Per/Amt/Sim(PAS)結構的異源性二聚體(bHLH-PAS)，是第1個被證實參與VEGF轉錄調控的轉錄因子，與腫瘤血管生成等密切相關[13]。在非小細胞肺癌中，HIF-1α蛋白表達與肺鱗狀細胞癌和腺癌組織的血管形成密切相關[4]。在前列腺癌組織中HIF-1α蛋白表達與腫瘤惡性程度和預后密切相關，分化差(高級別)的前列腺癌組織中高表達HIF-1α蛋白，并且VEGF和HIF-1α蛋白表達呈正相關[14-15]。另外，HIF-1α還與乳腺癌患者的預后密切相關，HIF-1α陰性患者的病理完全緩解率顯著高于HIF-1α陽性患者[16]。在這些腫瘤中，HIF-1α的過度表達可能與腫瘤缺氧性質、HIF-1α異常激活、腫瘤高度侵襲性有關[17]。本研究顯示Lu65移植瘤組織的HIF-1α低表達，Lu99移植瘤組織細胞不表達。另外，移植瘤組織間質的淋巴細胞和某些巨噬細胞HIF-1α蛋白陽性表達，這與文獻報道結果相同[18]。在Lu99和Lu65移植瘤組織中HIF-1α蛋白不表達或低表達與VEGF和Ki67蛋白是否表達及腫瘤細胞壞死形態無明顯相關。統計分析HIF-1α蛋白在Lu99和Lu65移植瘤組織的表達量，不僅在不同細胞株(Lu65和Lu99)移植瘤組織之間有差異，而且在相同細胞株(Lu65)移植瘤組織之間有差異，故我們推測在Lu99和Lu65移植瘤組織中HIF-1α蛋白表達有可能與腫瘤細胞異質性有關。

本課題組此前研究報道了A549移植瘤侵襲組織與不同分子質量血清蛋白(Albumin、IgG1、IgM)表達有關[19]，還與Ki67蛋白表達有關，但是與VEGF和EGFR表達無明顯相關[20]。已有研究發現NSCLC組織的功能性血管通透性與血清蛋白的分子質量密切相關[7-9]，包括LCLC(Lu65和Lu99)組織。大多數研究報道認為腫瘤血管生成與HIF-1α蛋白密切相關[14，21]。本研究采用報道[19，22]的半定量統計分析方法，對Lu65和Lu99細胞株移植瘤血清蛋白免疫組化染色強度進行了半定量分析，發現功能性血管與非功能性血管的周圍移植瘤間質、細胞外基質中的血清蛋白(IgG、IgM)呈不同強度表達，說明了Lu65和Lu99細胞株移植瘤組織的血管通透性與血清蛋白相對分子質量和血管結構有關，也可能與VEGF蛋白表達強弱有關[8]，但是與HIF-1α蛋白表達無明顯相關。另外，本研究首次發現了Lu65和Lu99細胞株移植瘤組織的功能性血管數目高于非功能性血管的研究成果，這一結果可能對腫瘤基礎研究和臨床腫瘤治療有重大意義。

綜上所述，IVCT技術制備的Lu65和Lu99細胞株移植瘤石蠟標本采用免疫組化染色分析HIF-1α、VEGF、Ki67和血清蛋白Albumin、IgG1、IgM的表達，發現HIF-1α蛋白表達與VEGF、Ki67蛋白表達和腫瘤組織壞死形態無明顯關，與Lu65和Lu99移植瘤細胞異質性有關。根據血清蛋白Albumin、IgG1、IgM的免疫組化染色表達強弱程度，提出功能性血管和非功能性血管的觀點，并且Lu65和Lu99移植瘤組織中功能血管數目高于非功能血管。移植瘤組織的血管通透性與血清蛋白Albumin、IgG、IgM的相對分子質量和血管結構有關。

(感謝日本山梨大學醫學部解剖分子組織學教研室大野教授大力支持)