響應面法優化低聚木糖誘導大豆抗毒素合成條件

王凱強，楊雪，李常風，段曉，彭晴，喬宇，石波*

（1.長治醫學院藥學系，山西長治 046000；2.中國農業科學院飼料研究所，北京 100081）

植物抗毒素是植物受到外源誘導子刺激產生的低分子有機化合物，屬于次生代謝產物，表現出多種生物活性[1]。大豆抗毒素（glyceollins，GLYs）是豆科植物受到外源誘導子誘導合成的防御性異戊二烯化黃酮類化合物，具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗雌激素等活性，后來發現其有調節葡萄糖與脂質代謝、促進藥物遞送、誘導成骨及保護神經與心血管的潛在作用[2-3]，因此在醫藥、保健品、化妝品等領域具有巨大的應用價值，引起廣泛關注。

自然狀態下的健康豆科植物或種子中沒有大豆抗毒素累積或含量極低。相關研究主要采用細菌、真菌及其細胞壁提取物或代謝產物、重金屬、酸等誘導子誘導大豆合成GLYs[4-6]，而這些誘導子存在微量有機混合物或者有毒化合物，潛在威脅甚至危害人體健康，影響大豆功能產品的品質[7]。典型的功能性寡糖作為益生元顯示出調節腸道菌群、降低血脂血壓和血清膽固醇、促進營養消化吸收和抗氧化等生理功能[8]。功能性寡糖誘導子誘導GLYs 合成的報道相對較少。低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）也稱木寡糖，是由2～7個D-木糖分子以β-1,4 糖苷鍵連接而形成的功能性寡糖，其中木二糖與木三糖較常見[9]。研究顯示，XOS能促進人體腸道內有益菌顯著生長，并抑制有害菌繁殖，維持腸道菌群平衡[10]。有益菌如雙歧桿菌能利用XOS 維持自身生長和增殖，其通過產生短鏈脂肪酸如乙酸、丙酸、丁酸來抑制有害菌繁殖[11]。XOS 也具有增強免疫力的活性[12]。此外，酸奶添加3.5%（質量體積分數）XOS 能促進大鼠對鈣、鎂和鐵等礦物元素的吸收。輕度慢性肝病患者以3.0 g·d-1服用XOS 14 d 后，血氨含量低于服用前，表明XOS有護肝功效[10]。

近年來，隨著我國人口結構調整、生活節奏加快、工作壓力增加和飲食習慣改變，亞健康和慢性疾病趨于常態化，已成為影響人體健康的主要因素。功能性食品具有特殊的營養功能，為改善人體健康和慢性病營養干預的重要方式，具有廣闊的市場需求和發展前景[13]。大豆富含多種功能性成分，如異黃酮、多肽、低聚糖和卵磷脂，且易于獲取，因此功能性大豆食品的開發成為熱點[14]。值得關注的是，大豆抗毒素的外源誘導合成進一步拓寬了功能性大豆食品的應用思路。同時，GLYs活性評價的研究也要求保證一定的供試量。然而市場上缺乏商品化的GLYs 及其化學對照品，GLYs的化學合成方法尚未成熟，外源誘導的生物合成就成為GLYs 合成的重要方法。本課題組采用褐藻酸寡糖、纖維寡糖、低聚木糖、卡拉膠寡糖、果膠寡糖和殼聚糖誘導大豆合成GLYs。黑豆與大豆同屬豆類，但相關研究報道較少。響應面法（response surface methodology，RSM）是20 世紀中后期興起的用于優化工藝參數的數學統計方法，可建立模型預測各因素和水平下的目標響應值和確定最佳條件，并且結合方差分析能夠評價各因素和水平及其交互效應對響應值的影響[15-16]，已廣泛用于豆類活性物質提取條件的優化[17-18]。因此，本研究以低聚木糖誘導黑豆合成GLYs 的含量為考察目標，以誘導時間、誘導質量濃度、培養溫度為考察單因素，在此基礎上利用中心組合設計（central composite design，CCD）-RSM 優化GLYs合成的誘導條件，為大豆抗毒素制備及功能產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黑豆 選取臨沂產魯黑豆2號品種的大粒黑豆（Linyi Large，LL）、濟寧產神農架品種的大粒黑豆（Jining Large，JL）和黑龍江產哈爾濱小黑豆品種的小粒黑豆（Heilongjiang Parvule，HP）為試驗材料。其中，臨沂產大粒黑豆購自臨沂市沂河路糧油市場，百粒重為39.18 g；濟寧產大粒黑豆購自濟寧良源坊食品有限公司，百粒重為38.43 g；黑龍江產小粒黑豆購自佳木斯市三江農場，百粒重為18.96 g。

1.1.2 試劑 低聚木糖購自山東龍力生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，購自美國Fisher Scientific 公司；乙醇、甲酸為分析純，購自北京化工廠；大豆抗毒素對照品由課題組制備得到。

1.1.3 儀器 2695 型HPLC 儀（配備2996 型PDA檢測器）與Xevo TQ-S 型UPLC-MS∕MS 儀，美國Waters公司；Sykam S1125型半制備HPLC儀（配備S3245 型UV∕Vis 檢測器），德 國Sykam公司；SORVALL?RC-6 Plus 型高速冷凍離心機，美國Thermo Scientific公司；ETS-D4型加熱磁力攪拌器，德國IKA 公司；3K15型醫用離心機，德國Sigma公司；SF-3120 型自動分部收集器，日本Advantec 公司；LGJ-18型真空冷凍干燥機，北京松源華興公司；DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備公司；ZWY-2102 型恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆抗毒素誘導與合成確認 ①XOS 誘導。黑豆誘導方法參照文獻[19]，無霉斑、粒徑一致且顆粒飽滿的黑豆用75%乙醇處理3 min，滅菌蒸餾水清洗若干次，置于25 ℃左右的滅菌水中浸泡5 h；然后用無菌刀片將膨脹的種子分為2 片子葉，在子葉表面劃出約9～12 mm2的傷口，且背面不發生破裂；將子葉置于培養皿內潤濕的無菌濾紙上，向傷口內加入60μL無菌過濾XOS溶液并用封口膜密封，在相對濕度（relative humidity，RH）65%、24～26℃條件下暗培養若干天。對照黑豆子葉處理方法如上，傷口加入60μL滅菌水。樣品的提取參照文獻[19]方法，步驟如下：子葉經凍干研磨后，稱取0.3 g 粉末于離心管中，以料液比（g·mL-1）為1∶6的比例加入1.8 mL 80%乙醇，蓋嚴并浸在50 ℃水浴中，磁力攪拌提取1 h，以15 000 r·min-1離心15 min，取上清液過0.22μm 有機濾膜，即得粗提液。

②大豆抗毒素合成確認。粗提液經半制備HPLC 儀-收集器分離餾分、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析及超高效液相色譜-串聯質譜法（ultra performance liquid chromatography mass spectrometry，UPLC-MS∕MS）確認[19]。半制備HPLC 方法采用Waters 600E（配備Waters PAD 檢測器）；YMC-Pack ODS-AQ C18（20 mm×250 mm，5μm）制備色譜柱（美國YMC 公司）；流動相A、B為90%乙腈水與5%乙腈水，流速3.0 mL·min-1，進樣體積2 mL，波長285 nm，檢測時間90 min。梯度洗脫：0～10 min，100%B；10～70 min，100%B→0%B；70～90 min，0%B。大豆抗毒素含量測定采用Waters 2695 HPLC-2996 PDA 檢測器及色譜工作站；SunChrom 反相C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）（北京金歐亞科技發展有限公司），柱溫40 ℃；流動相A、B 為pH 3.0 乙酸水與乙腈，流速1.0 mL·min-1，洗脫方法如表1所示；進樣體積10μL，波長285 nm，檢測時間65 min。含量計算依據課題組建立的大豆抗毒素積分值（Y）對質量濃度（X）的回歸方程[20]：Y=1.0 × 107X+754.32，R2=0.999 9。

表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution procedure

1.2.2 3 個產地黑豆中大豆抗毒素誘導合成量的比較 不同產地黑豆在XOS 誘導含量4.0%，誘導時間3 d，培養溫度25 ℃時，比較大豆抗毒素的合成累積量。

1.2.3 單因素試驗 分別研究誘導時間、XOS 質量濃度、培養溫度對大豆抗毒素合成量的影響。其中，誘導時間單因素試驗：XOS 質量濃度4.0 g·100 mL-1，培養溫度25 ℃，設置誘導時間分別為1、2、3、4、5、6和7 d；XOS質量濃度單因素試驗：誘導時間4 d，培養溫度25 ℃，設置XOS 質量濃度分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和8.0 g·100 mL-1；培養溫度單因素試驗：誘導時間4 d，XOS質量濃度4.0 g·100 mL-1，設置培養溫度分別為17、21、25、29和33 ℃，進行XOS 誘導大豆抗毒素合成條件的優化。

1.2.4 響應面試驗 利用CCD-RSM 對大豆抗毒素合成條件進行綜合優化。自變量誘導時間（X1）、XOS 誘導質量濃度（X2）及培養溫度（X3）編碼為五水平，即-1.682、-1、0、+1、+1.682，各因素水平為誘導時間2～6 d、XOS誘導質量濃度3.0～7.0 g·100 mL-1、培養溫度17～33 ℃（表2）。試驗設計含20個試驗點（14個析因點和6個零點）（表3）。在響應面試驗中，應用Design-Expert 8.0.6 軟件進行三因素五水平的CCD-RSM試驗，獲得XOS誘導黑豆子葉中大豆抗毒素累積量的優化條件及其下的預測值。此外，對模型的顯著性與適用性進行方差分析。

表2 中心組合設計因素與水平Table 2 Factors and levels for central composite design

1.2.5 優化條件驗證 對獲得最高誘導量的大豆抗毒素優化條件進行驗證，檢驗結果與軟件獲得的預測值是否一致。

1.3 數據分析

采用SPSS 24.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 大豆抗毒素合成確認

在XOS 誘導子葉組織而獲得提取物的HPLC譜圖中，新產生化合物的色譜峰保留時間約在22.5 min（圖1A），相較與對照譜圖（圖1B）沒有出現。通過半制備HPLC 儀分離獲得受刺激子葉組織中合成的新化合物，HPLC分析確認及純化濃縮餾分中的化合物，且利用HPLC與UPLC-MS∕MS對濃縮液進行檢測分析。結果顯示，分離純化得到的新化合物的HPLC譜圖如圖1C所示。采用電噴霧離子源正離子（ESI+）模式下的UPLC-MS∕MS 對新化合物分析，由于3種最常見GLY異構體Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ的分子式與分子量分別為C20H18O5與338，得出質譜圖中質荷比（mass charge ratio,m∕z）339 是大豆抗毒素質子化得到的準分子離子[M+H]+，同時m∕z 321為[M+H]+丟失1個水分子產生的碎片離子[M+H-H2O]+，m∕z 229為[M+H-H2O]+丟失1個苯氧基團產生的碎片離子[M+H-H2O-C6H4O]+（圖1D）。由獲得的質譜數據得到，在受到外源刺激的子葉組織提取物的色譜圖中，保留時間約22.5 min的新合成化合物確認為GLY Ⅰ、GLY Ⅱ與GLY Ⅲ。由上可知，XOS對黑豆子葉組織的外源誘導刺激作用能夠導致子葉組織合成和積累次生代謝產物GLYs，同時GLYs 的誘導合成也是子葉組織細胞對XOS 刺激作出的防御性反應中的一部分。

圖1 低聚木糖誘導子葉組織中大豆抗毒素的合成確認Fig.1 Confirmation of the glyceollins synthesis from XOS-induced soybean cotyledon tissue

2.2 不同產地黑豆子葉中GLYs含量的分析

在XOS誘導質量濃度4.0 g·100 mL-1與誘導時間3 d條件下，比較3個產地黑豆中GLYs誘導合成量，結果（圖2）顯示，臨沂產大粒黑豆、濟寧產大粒黑豆與黑龍江產小粒黑豆中GLYs 累積量分別為1.425 2、0.973 2、0.899 0 mg·g-1DW。其中，濟寧產大粒與黑龍江產小粒黑豆子葉中GLYs累積量顯著低于臨沂產大粒黑豆，而濟寧產大粒與黑龍江產小粒黑豆間無顯著差異。由上可得，臨沂產大粒黑豆更適用于后續GLYs 誘導合成條件優化的響應面試驗。

圖2 3個產地黑豆子葉中GLYs的誘導合成量Fig.2 Synthesized GLYs content from three origins of black soybean under induction

2.3 GLYs合成條件的優化

分別考察誘導時間、XOS誘導質量濃度及培養溫度對GLYs 誘導合成量的影響，篩選誘導時間、XOS誘導質量濃度及培養溫度單因素的水平范圍。由圖3 可知，當誘導時間為2 d 時，GLYs 累積量達到較高水平，此后隨著時間的延長累積量增加不明顯；當XOS質量濃度為4.0 g·100 mL-1，培養溫度為25 ℃，在誘導時間2～6 d下的GLYs累積量差異不顯著（P＞0.05），故誘導時間選擇2～6 d；當XOS 誘導質量濃度在2.0～8.0 g·100 mL-1時，GLYs累積量發生明顯變化，而當誘導時間與培養溫度一定時，誘導質量濃度為4.0 g·100 mL-1時合成GLYs 量顯著高于8.0%時的累積量（P＜0.05），與7.0%時的累積量差異不顯著（P＞0.05），考慮到GLYs積累量及XOS 誘導質量用量，故誘導質量濃度選擇在2.0～6.0 g·100 mL-1；當誘導時間與誘導質量濃度一定時，培養溫度25 ℃下的GLYs累積量顯著高于其他培養溫度（P＜0.05），17～33 ℃范圍的GLYs含量發生明顯變化，故選擇此培養溫度范圍。綜合單因素試驗結果，誘導時間2～6 d、誘導質量濃度2.0～6.0 g·100 mL-1及培養溫度17～33 ℃為中心組合設計響應面試驗進行的單因素水平范圍。

圖3 不同因素下臨沂大粒黑豆中大豆抗毒素的誘導合成量Fig.3 Synthesized GLYs contents from LL under induction of different factors

2.4 中心組合設計-響應面試驗的分析

以單因素試驗結果為基礎，采用三因素五水平的CCD-RSM 試驗優化GLYs 合成的誘導條件。表3 為CCD-RSM 試驗設計及GLYs 含量結果。應用Design-Expert 軟件對數據進行多元回歸擬合，獲得二次多項回歸方程如下。

表3 誘導時間、誘導濃度和培養溫度的中心組合設計及GLYs含量Table 3 CCD of induction time，XOS concentration and temperature and the GLYs content

式中，Y為GLYs 累積量（mg·g-1DW），X1為誘導時間（d），X2為誘導質量濃度（g·100 mL-1），X3為培養溫度（℃），回歸系數R2=0.925 4，表明模型擬合較好。

GLYs 合成的優化條件為誘導時間4.03 d、誘導質量濃度4.08 g·100 mL-1、培養溫度23.83 ℃，此時GLYs累積量為1.411 8 mg·g-1DW。對建立的模型進行方差分析（表4），F值為13.78（P=0.000 2），表明模型適合度達到顯著水平；響應面試驗的誤差較?。ㄊM項F=0.67，P=0.665 0）；培養溫度對GLYs合成累積量影響極顯著，誘導時間和誘導濃度對GLYs合成累積量影響不顯著；各因素間交互作用不顯著；各因素對GLYs累積量的影響呈現二次曲線關系（P＜0.001）；且培養溫度對GLYs合成累積量的影響較大，其次為誘導質量濃度和誘導時間。綜上所述，此模型可用于預測GLYs的合成累積量。

表4 誘導時間、誘導質量濃度和培養溫度的中心組合設計試驗模型的可信度Table 4 Credibility for CCD model of induction time，XOS concentration and temperature

模型誤差統計分析可用于評價其精密度、精確度及可信度。本研究預測相關系數（predictedR-squares，PredR2）和調整相關系數（adjustedRsquares，AdjR2）分別為0.706 9 與0.858 3，二者接近，顯示GLYs 的擬合過程有效；變異系數（coefficient of variation，CV）為11.02%，顯示建立的模型具有較高的精確度與可信度；模型的信噪比（Adeq precision）為11.427（＞4）,顯示建立的模型有較高的精密度。由此表明，回歸模型有良好的預測性。Design-Expert軟件分析（圖4）表明，殘差的正態概率分布和預測值與實際值分布均處于一條直線，殘差與預測值分布較為分散，顯示擬合模型具有較好的適應性。

圖4 擬合模型的適應性分析Fig.4 Adaptability analysis of the fitting model

圖5 是以誘導時間、XOS 誘導質量濃度、培養溫度三因素交互效應的3D 曲面圖和等高線圖。當以培養溫度為中心點時，GLYs累積量隨著誘導時間從2～4 d 先增加后降低；誘導質量濃度在2.0～4.0 g·100 mL-1時明顯增加，之后隨著質量濃度的增加逐漸減少；曲線走勢顯示誘導質量濃度的3D 曲面上升幅度比誘導時間的曲面上升稍明顯（圖5A），表明在研究誘導時間和誘導質量濃度交互效應時，誘導質量濃度對GLYs 累積量影響更為明顯；誘導質量濃度的等高線變化比誘導時間明顯（圖5B）。當以誘導時間為中心點時，培養溫度的響應面3D 曲面的升高幅度比誘導質量濃度的曲面上升幅度大（圖5C）；培養溫度的等高線變化比誘導質量濃度明顯（圖5D）。當以誘導質量濃度為中心點時，培養溫度的響應面3D曲面的升高幅度比誘導質量時間的曲面上升幅度大（圖5E）；培養溫度的等高線變化比誘導時間明顯（圖5F）。綜上，培養溫度對GLYs 累積量影響顯著。

圖5 誘導時間、XOS誘導質量濃度、培養溫度交互效應對GLYs累積量的等高線圖和曲面圖Fig.5 Contour and response surface plots for the interactive effects of induction time，XOS mass concentration

2.5 驗證試驗

在XOS 誘導質量濃度4.0 g·100 mL-1與誘導時間3 d 條件下，臨沂產大粒黑豆誘導獲得的GLYs 累積量顯著高于濟寧產大粒與黑龍江產小粒黑豆（P＜0.05）。為了驗證大豆抗毒素預測值的優化條件，在獲得的優化條件（誘導時間4.03 d、誘導質量濃度4.08 g·100 mL-1、培養溫度23.83 ℃）下，選擇臨沂大粒黑豆材料開展驗證工作。為滿足驗證試驗的可操作性，驗證條件設為誘導時間4 d、低聚木糖誘導質量濃度4 g·100 mL-1、培養溫度24 ℃。在3次重復試驗中，GLYs誘導合成量達到 1.376 5 mg·g-1DW，與理論 預測值1.411 8 mg·g-1DW 的相對誤差為2.5%，表明響應面模型與實際合成量擬合良好，中心組合設計-響應面試驗獲得的模型有較好的預測性。

3 討論

大豆抗毒素具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗雌激素、代謝調節、藥物遞送、成骨、神經和心血管保護等多種功效，在醫藥、保健品、化妝品等領域顯示出巨大的潛在應用前景，因此，其獲取途徑受到極大關注。由于化學合成方法尚未成熟[21-22]，自然狀態下健康豆科植物中GLYs 含量又極低或不存在，因此，采用誘導子外源誘導合成成為大豆抗毒素的主要來源。

目前，細菌、真菌及其細胞壁提取物或代謝產物、重金屬離子等被用作誘導子誘導豆類獲取GLYs，但這些誘導子存在安全隱患，因此，以功能性寡糖作為誘導子誘導合成被認為是安全健康的獲得方式。董向艷等[23]發現β-葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶2 種酶單一水解甘薯渣制備的纖維寡糖、果膠寡糖誘導大豆生成的GLYs 量分別為0.80、0.46 mg·g-1DW，而這2種酶聯合水解甘薯渣產生的復合寡糖誘導生成的GLYs 量最高可達1.21 mg·g-1DW。胡佳等[19]通過探究褐藻酸寡糖誘導大豆產生GLYs的最優條件和累積變化，以外在因素對GLYs 合成的影響展開，得出大豆中GLYs 合成量最高為0.525 mg·g-1FW。張迷敏等[24]探究褐藻酸寡糖誘導大豆合成累積GLYs 過程中的大豆營養成分變化時發現，與未處理時的0.01 mg·g-1GLYs相比，誘導第5天時GLYs累積量最高為1.72 mg·g-1DW。Peng 等[25]考察了不同分子量及不同古洛糖醛酸（G）∕甘露糖醛酸（M）值的褐藻酸寡糖的GLYs 誘導活性，得到4種褐藻酸寡糖片段△G、△MG、△GMG 及△MGGG 為誘導子誘導的GLYs 累積量為1.233 9、0.347 2、0.649 4、1.061 1 mg·g-1DW。由此表明，不同來源的功能性寡糖在一定程度上均能誘導大豆生成GLYs，但存在差異，表明篩選功能性寡糖來源具有重要研究意義。

為了快速提高大豆抗毒素合成量或開發功能豆類產品，本研究以大豆抗毒素誘導合成條件進行單因素試驗，初步得到誘導累積量的最優條件：XOS 誘導質量濃度4.0 g·100 mL-1、培養溫度25 ℃下誘導4 d。外在因素對低聚木糖誘導大豆抗毒素生成有一定影響，隨著誘導時間、XOS誘導質量濃度與培養溫度超過最佳條件GLYs累積量均出現下降，這可能是由于誘導時間延長會滋生微生物，而增加誘導質量濃度會損傷細胞生命活力，過高的培養溫度會抑制酶的催化活性[26]，從而導致GLYs 合成逐漸受阻至累積量下降。以單因素試驗得到的最優條件作為中心組合設計-響應面試驗的中心點，采用Design-Expert軟件對有限次數的試驗進行擬合，建立預測大豆抗毒素響應值的模型且獲得優化條件：XOS 誘導質量濃度4.08 g·100 mL-1、誘導時間4.03 d、培養溫度23.83 ℃；且驗證試驗表明采用優化條件時，大豆抗毒素實際誘導累積量符合響應面模型的預測。由此表明，該方法合理可行，為大豆抗毒素制備及功能產品開發提供了理論依據。