基于近紅外建立凍藏鮰魚片動力學貨架期模型

周俊鵬，闕 鳳，石鋼鵬，石 柳，汪 蘭，吳文錦，李 新，丁安子，王 軍，熊光權

(1 湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068;2 湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064)

斑點叉尾鮰(IetalurusPunetaus)，屬鯰形目，鮰科，是一種原產于美洲的淡水魚，目前已在我國20多個省市養殖，成為我國重要的淡水經濟魚種之一[1]。因其高蛋白、高水分含量、多種氨基酸等特點[2]，斑點叉尾鮰魚肉在貯藏過程中易腐敗變質[3]，不僅會造成商品價值降低，而且易引發食品安全問題。因此，形成快速準確的鮰魚肉制品貨架期評價方法十分必要。目前，魚肉新鮮度常采用化學評價方法進行評價，如揮發性鹽基氮(TVB-N)、K值、硫代巴比妥酸(TBA)、三甲胺(TMA)和生物胺等化學指標[4]。李輝[5]采用pH、TVBN和K值評價了牙鲆貯藏過程中新鮮度的變化；Ocao-Higuera等[6]以TVB-N、TMA等研究了冰藏條件下射線魚的新鮮度；De Abreu等[7]通過TBA值研究大西洋比目魚在冷凍條件下脂肪氧化與水解情況，將TBA值列為新鮮度評價有效指標之一。近年來，近紅外光譜技術作為一種簡便、快捷、綠色、高效的新型檢測分析技術，在淡水魚品質評價等方面受到廣泛應用[7-10]，如Tito等[9]利用紅外光譜對大西洋三文魚的微生物數量進行預測；Ding等[10]使用近紅外反射光譜技術結合支持向量回歸方法建立鰱魚K值的快速測定模型。在檢測新鮮度指標的基礎上，淡水魚常采用化學反應動力方法進行貨架期的預測。如Hong等[11]通過測定TVB-N、菌落總數和K值的變化實現鳙魚貨架期的預測；姜元欣等[12]采用TVB-N建立了凍藏羅非魚的貨架期預測模型，鞠健[13]通過測定脂肪的酸價、過氧化值和TBA建立冷藏鱸魚的貨架期預測模型。淡水魚因種類、養殖環境、加工貯藏環境等差異，其貨架期也存在差異。目前關于斑點叉尾鮰凍藏貨架期的預測模型還沒有相關研究與報道。

本研究以斑點叉尾鮰魚肉為研究對象，分別在-6℃、-10℃、-14℃、18℃冷凍貯藏鮰魚片119 d。在貯藏過程中使用近紅外快速測定鮰魚片的新鮮度指標(TVB-N、TBA、TMA和K值)，運用化學反應動力方法建立各指標的貨架期預測模型。

1 材料

1.1 材料與試劑

鮮活的斑點叉尾鮰(約1～3 kg)購于湖北省武漢市白沙洲水產品批發市場。

高氯酸，上海靈峰化學試劑有限公司；苦味酸，山東西亞化學工業有限公司；腺嘌呤核糖三磷酸標品，上海源葉生物科技有限公司；硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇、石油醚(30～60℃)硫代巴比妥酸、冰醋酸、液體石蠟、甲苯、無水碳酸鉀、甲醛、無水硫酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BCD-575WDBI 冰箱，青島海爾股份有限公司；高效液相色譜儀，島津(中國)有限公司；FoodScan 肉制品分析儀；FOSS HM 294 Homogeniser 230V，丹麥福斯。

2 方法

2.1 樣品處理

在10℃冷庫中將鮰魚敲擊致暈殺死，去除內臟、表皮，流水清洗干凈后，取背部魚肉，然后用PE包裝袋分裝(每袋約400 g)，分別于-6℃、-10℃、-14℃、-18℃貯藏119 d。其間，每間隔7 d分別進行近紅外掃描和理化分析測定TVB-N、K值、TBA和TMA。

2.2 近紅外新鮮度指標測定

采用透射式FoodScan近紅外光譜掃描儀進行光譜采集。首先將儀器開機30 min進行自檢及預熱，將解凍后300 g樣品置于FOSS HM 294高速均質器中絞碎(8000 r/min，5 min)，絞碎的樣品置于樣品盤(r×h=68×17 mm)，輕輕拍打除去樣品中氣泡并使樣品表面平整。樣品平衡至室溫(約25℃)，使用FoodScanTM透射近紅外光譜儀(2 nm分辨率，850～1050 nm)進行凍藏鮰魚樣品新鮮度掃描，分別獲得鮰魚冷凍貯藏中TVB-N、TBA、TMA和K值的近紅外掃描值。

2.3 指標測定

2.3.1TVB-N含量參考GB5009.228-2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》方法并略作修改[13]。稱取約5.0 g，置于錐形瓶中，加50 mL水，不時振搖，浸漬30 min后過濾，濾液置冰箱備用；將盛有10 mL吸收液及5～6滴混合指示液(V(甲基紅)∶V(溴甲酚綠)=1∶5)的錐形瓶置于冷凝管下端，使之插入硼酸吸收液(20 g/L)液面下，準確吸取5.0 mL上述試樣濾液于蒸餾器反應室內，加5 mL氧化鎂混懸液(10 g/L)，迅速蓋塞，并加水以防漏氣，通入蒸汽，進行蒸餾，蒸餾5 min即停止，吸收液用鹽酸標準滴定溶液(0.01 mol/L)標準滴定溶液滴定至紫紅色，同時做試劑空白試驗，計算試樣中揮發性鹽基氮的含量

式中：X為試樣中的TVB-N值，mg·100 g-1,V1為測定用樣液消耗鹽酸溶液體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標準溶液體積，mL；c為鹽酸標準溶液的濃度，mol/L；14為與1.00 mL鹽酸標準滴定溶液相當的氮的質量，mg；m為試樣質量，g。計算結果保留3位有效數字。

2.3.2TBA值參考Tarladgis等[14]方法，10 g絞碎的魚肉于凱氏蒸餾瓶中，加入20 蒸餾水攪拌混合均勻，再加入2 mL鹽酸溶液(m(HCl)∶m(H2O)= 1∶2)及2 mL液體石蠟，采用水蒸氣蒸餾，收集50 mL蒸餾液。5 mL蒸餾液與5 mL TBA醋酸溶液(0.2883 g硫代巴比妥酸溶解于100 mL 90%冰醋酸)于25 mL比色管中充分混合，100℃水浴加熱35 min后冷卻10 min，在535 nm處測定吸光度A，以蒸餾水取代蒸餾液為空白樣。

XTBA=A×7.8

式中：X為試樣中的TBA值，mg/kg；A為樣品溶液在535 nm吸光度值；7.8為換算系數。

2.3.3TMA的測定參考Yu等[14]方法略作修改，準確吸取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL 100 μg/mL三甲胺氮標準溶液于25 mL的比色管中，分別加蒸餾水至5 mL(相當于0、6、12、18、24、30 μg/mL三甲胺氮)，用蒸餾水做空白。向每支試管中依次加入10%甲醛溶液1 mL，無水甲苯10 mL及1+1碳酸鉀溶液3 mL，立即蓋塞，漩渦震蕩2 min后靜置20 min，待分層后吸去下面水層，加入0.5 g無水硫酸鈉進行脫水，吸出5 mL萃取液于比色管中，再加入0.02%苦味酸5 mL顯色，并輕輕振動使之混合，410 nm下讀取吸光值，作含量-吸光度標準曲線；稱取絞碎魚肉約4.0 g加入20%三氯乙酸20 mL于具塞三角瓶，振搖后靜置30 min，待蛋白質沉淀后過濾。取濾液5 mL于25 mL具塞比色管中，接下來的試驗步驟同標準液的步驟一樣，最后根據標準曲線計算樣品中的三甲胺氮含量

式中：X為試樣中的TMA值，mg·100 g-1,c為樣品中三甲胺氮濃度，μg/mL；v為試樣處理總體積，20 mL；m為試樣質量，g。

2.3.4K值的測定參考Shi等[15]方法，取2.00 g絞碎的魚肉，加10%(體積分數)高氯酸20 mL，漩渦震蕩1 min，漿液離心(10000 r/min，4℃，6 min)分離，上清液沉淀用5%高氯酸20 mL洗滌，離心，最后合并上清液；用10 mol/L和1 mol/L NaOH溶液調節pH至6.4，并用蒸餾水定容至50 mL。用0.22 μmL濾膜過濾，濾液貯存于-20℃冰箱待測。HPLC條件：色譜柱Agilent Zorbax SB-Aq(250 mm×4.6 mm)，采用0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)平衡洗脫；樣品進樣量20 μL，流速1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長254 nm；ATP關聯物標準品HPLC圖譜的測定：ATP、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黃嘌呤核苷(HxR)、次黃嘌呤(Hx)以及它們的混合物在相同條件下測定，并繪制標準圖譜。以測得的HxR、Hx之和與腺苷三磷酸關聯化合物總量的百分比作為鮮度指標(K值)：

2.4 模型的建立及驗證

2.4.1化學反應動力學貨架期預測模型水產品在貯藏腐敗過程中微生物的生長及相關化學反應產物的累計，一般遵循一級化學反應動力學[16-17]，將不同貯藏溫度過程中新鮮度指標數值與貯藏時間進行非線性擬合，確定對應不同貯藏溫度下各指標的反應速率常數K(表2)。

水產品在腐敗過程中，其微生物生長繁殖及化學反應的進行，最主要的影響因素是溫度。通常情況下采用Arrhenius公式表示反應速率常數K與溫度的變化關系：

其中：K0為頻率因子；Ea為活化能，J/mol；T為溫度，K；R為常數8.314 J/(mo1/K)。K0和Ea是與相關物質性質有關的常數。將不同貯藏溫度下各指標反應速率常數K，用lnK對熱力學溫度的倒數(1/T)進行線性擬合，依據斜率-Ea/R和截距lnK0求出不同指標的反應活化能Ea和反應速率常數K0，因此常采用不同貯藏溫度的樣品進行化學反應動力學貨架期建立。

依據一級化學反應動力學和Arrhenius公式推導出貨架期的預測方程：

因此，貨架期預測模型

(1)

2.4.2化學反應動力學貨架期預測模型的驗證穩定性驗證：將近紅外掃描值與模型預測值進行對比，以相對誤差值來評價化學反應動力學貨架期預測模型的穩定性。準確度驗證：將理化檢測的實測值與模型預測值進行對比，以相對誤差值來評價化學反應動力學貨架期預測模型的準確度。

2.5 數據處理

采用SPSS 20.0和WPS2019進行相應數據處理、圖表繪制及動力學貨架期預測模型的建立。

3 結果與分析

3.1 凍藏鮰魚片新鮮度變化

隨著貯藏時間的延長，淡水魚的新鮮度會逐漸降低直至腐敗變質，因此常采用TVB-N、TBA、TMA和K值等化學指標對淡水魚的新鮮度進行評價[18-19]。如圖1-圖4所示，隨著貯藏時間的延長，近紅外快速掃描與理化分析2種方式測定的凍藏鮰魚片TVB-N、TBA、TMA和K值均呈逐漸增加趨勢，且不同貯藏溫度的鮰魚片各新鮮度指標的增加速率具有一定的差異性。在凍藏過程中鮰魚片TVB-N、TBA、TMA在貯藏前期呈緩慢增加的趨勢，后期則呈現迅速上升，而K值則在貯藏過程中較其他新鮮度指標增長速率較快。在貯藏過程中，鮰魚片在腐敗微生物及相關蛋白酶的作用下，蛋白質被分解成氨及胺類等堿性含氮物質，且在貯藏過程中不斷積累，因此TVB-N值逐漸增加[20]；脂肪易被氧化成醛、酮類化合物等脂肪氧化物，其與TBA試劑反應生成穩定的紅色化合物可反映脂肪的氧化程度，因此隨著脂肪氧化產物的累積，TBA值也呈現逐漸增加趨勢[21]。隨著貯藏時間延長，TMA含量貯藏增加，主要是因為鮰魚片的氧化三甲胺在腐敗微生物及酶的作用下分解成三甲胺、二甲胺和胺等物質[22]。魚體在死亡后，魚肉的三磷酸腺苷(ATP)逐步降解為二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、肌苷酸、肌苷和次黃嘌呤等物質，最終產物(HxR和Hx)在貯藏過程中逐漸積累，在這個過程中魚肉的新鮮度也相應降低[6]。

圖1 不同貯藏溫度下鮰魚片的TVB-N變化

圖2 不同貯藏溫度下鮰魚片的TBA變化

圖3 不同貯藏溫度下鮰魚片的TMA變化

圖4 不同貯藏溫度下鮰魚片的K值變化

淡水魚的TVB-N、TBA、TMA和K值等4個指標限定值分別是15 mg/100g[23]、0.5 mg MDA/kg[24]、0.15 mg/100g[25]和60%[26]。在不同貯藏溫度下經不同新鮮度指標對鮰魚片貨架期進行評價，發現基于不同指標的貨架期間存在著一定的差異性，且不同方式測定的同一指標的貨架期也略有差異；隨著貯藏溫度降低，凍藏鮰魚片的貨架期呈逐漸延長，且不同指標在表征貨架期方面也存在著一定的差異性，具體結果如表1所示。例如，這表明不同指標對鮰魚片貨架期的評定存在著一定的差異性，可能是因為在貯藏過程中不同指標的化學反應速率具有一定的差異性，這在林琳等[27]和鞠健[28]的研究中也得到了證實。不同的貯藏溫度下鮰魚片同種新鮮度指標的數值增加速率也存在一定差異性，其從大到小依次是-6℃>-10℃>-14℃>-18℃，這是因為低溫能夠有效抑制了腐敗微生物的生長、相關蛋白酶的活性及相關化學反應的進行，使得不同貯藏溫度下鮰魚片同種新鮮度指標的產物累積存在著一定差異性[29]。

表1 不同貯藏溫度下鮰魚片近紅外掃描值和實測值貨架期

3.2 貨架期預測模型的建立

利用SPSS 20.0對不同貯藏溫度下近紅外掃描新鮮度指標數值與貯藏時間的進行非線性擬合，其結果如表2所示。

表2 近紅外掃描各指標非線性參數擬合

由表2可知，隨著貯藏溫度降低，各新鮮度指標的化學反應速率常數K逐漸減小，說明較低貯藏溫度能夠延緩鮰魚片生化反應速率，且能有效降低鮰魚片品質劣變速率[30-31]，同時這也使得前面不同貯藏溫度下同種新鮮度指標的數值增加速率差異性的結論也得到了證實。此外，除近紅外掃描指標TMA在259 K擬合精確度較低外，其他指標擬合精度R2均大于0.90，表明一級化學反應動力學方程能較好描述凍藏鮰魚片的新鮮度變化，這為一級化學反應動力學方程和Arrhenius公式建立貨架期預測模型提供了可行性。

將表2各指標不同貯藏溫度下lnK與貯藏溫度1/T作圖進行線性擬合，結果如圖5和表3所示。各新鮮度指標其擬合精度R2范圍為0.9097～0.9633，這表明貯藏溫度與反應速率常數K相關性高，模型預測效果好。且由表3也可知，鮰魚片不同新鮮度指標反應速率常數K和活化能Ea也均存在著差異性，這可能是因為鮰魚片在不同溫度冷凍貯藏過程中各種化學反應速率存在差異性，其相應產物的累積也有所不同，也進一步證實了不同化學指標在評價鮰魚片新鮮度方面存在著的差異性[30]。

表3 近紅外掃描各指標的不同貯藏溫度與反應速率常數K線性擬合結果

圖5 近紅外掃描各指標的不同貯藏溫度與反應速率常數K線性擬合

經反應速率常數lnK與貯藏溫度1/T進行線性擬合后，鮰魚片TVB-N、TBA、TMA和K值的反應速率常數K0分別為6427.2367、356.9158、21.5980、1.9736，活化能Ea分別為29700.10 J/mo1、21078.48 J/mo1、15268.66 J/mo1、10006.73 J/mo1，將反應速率常數K和活化能Ea代入式(1)，可分別得到基于化學反應動力學方程建立的近紅外TVB-N、TBA、TMA和K值的貨架期預測模型計算公式：

式中：A0為相應指標的初始值；A為儲藏t天后對應指標值；R為常數8.314 J/(mo1·K)，T為貯藏溫度，K。

3.3 貨架期預測模型的驗證

為了驗證基于近紅外測定數據建立的化學反應動力學貨架期預測模型穩定性，依據各指標的限定值、初始值和貨架期預測模型公式計算出各新鮮度指標貨架期的預測值，并且與近紅外貨架期掃描值(表1)進行對比，穩定性驗證結果如表4所示，其中“-”表示在貯藏期結束時新鮮度指標未達到其限值，而無法確定貨架期。結果表明貨架期掃描值與預測值相對誤差在-3.17%～5.71%，貨架期預測模型的穩定性均在94%以上，即基于近紅外測定數據建立的化學反應動力學貨架期模型穩定性較好。

表4 不同貯藏溫度下化學動力學貨架期預測模型的穩定性驗證

為了進一步驗證基于近紅外建立化學動力學貨架期預測模型的準確度，將各貨架期的預測值與理化檢測的實測值(表1)對比，準確度驗證結果如表5所示。貨架期的實測值與預測值相對誤差在-5.45～-2.95%，貨架期預測模型的準確度均在94%以上，即貨架期預測模型的準確性高。

表5 不同貯藏溫度下化學動力學貨架期預測模型的準確度驗證

綜合分析可知，基于近紅外測定的數據建立化學反應動力學貨架期預測模型其穩定性和準確度均在94%以上，說明本文基于近紅外光譜結合化學反應動力學建立了良好的定溫凍藏鮰魚片貨架期預測模型，這對定溫凍藏淡水魚的貨架期預測具有重要的意義。

4 結論

1)分別在-6℃、-10℃、-14℃和-18℃凍藏鮰魚片，隨著貯藏時間延長近紅外和理化分析測定的TVB-N、TBA、TMA和K值均呈現上升趨勢，表明凍藏鮰魚片的新鮮度逐漸下降。

2)隨著貯藏溫度升高，各指標的反應速率逐漸增加，符合一級化學反應動力學方程，且各新鮮度指標的反應速率常數K均具有較高的相關性(R2>0.90)。

3)經驗證，各新鮮度指標的貨架期預測模型期的穩定性和準確度均在94%以上，表明基于近紅外快速測定的新鮮度數據建立的化學反應動力學貨架期預測模型，能夠實現對凍藏鮰魚片進行可靠的預測。