白屈菜紅堿PLGA納米粒的制備及其體內藥動學研究

徐志杰

(威海海洋職業學院，山東 威海 264300)

白屈菜紅堿屬于異喹琳類苯并菲啶型生物堿，可從白屈菜、博落回、血水草、飛龍掌血等藥材中獲得[1]，具有抗腫瘤、消炎、改善肝功能、抑菌、抑制膽堿酯酶、鎮痛、抗糖尿病等活性[2-4]，但該成分在水中的溶解度僅為58.46 μg/mL[5]，口服給藥后半衰期短[6]，體內易被代謝[7-8]，口服生物利用度只有7.46%[8]，而且其固體分散體[5,9]穩定性可能存在問題，容易析晶。趙義軍等[10]采用單硬脂酸甘油酯制備了固體脂質納米粒，但該輔料可能會對人體器官有一定損傷作用[11]；柳陽等[12]制備了白屈菜紅堿脂質體，但包封率不足80%，達不到2020年版《中國藥典》對納米制劑包封率的要求。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是一種兩親性嵌段共聚物，在體內外通過主體降解(生成水溶性單體乳酸和羥基乙酸)、表面侵蝕等機理釋放藥物[13]，在納米制劑領域中的應用較多[14-16]，可有效提高難溶性藥物的溶解度、溶出度、生物利用度、藥效等參數[17-20]。因此，本實驗制備白屈菜紅堿PLGA納米粒，并考察其體內藥動學，以期為相關新制劑的開發提供參考依據。

1 材料

BSA224S型電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；TJTD-806型溶出儀(北京海富達科技有限公司)；Q-060S型超聲儀(深圳市千雨超聲波實業有限公司)；Master-sizer型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)；BDF-86型超低溫冰箱(濟南童鑫生物科技有限公司)；85-2A型磁力攪拌器(常州市億能實驗儀器廠)；89-TH型真空凍干機(上海爭巧科學儀器有限公司)；XD-200A型旋轉蒸發儀(上海賢德實驗儀器公司)。

白屈菜紅堿對照品(批號110807-201806，純度98.4%，中國食品藥品檢定研究院)；白屈菜紅堿原料藥(批號180428，純度98%，湖北廣奧生物科技有限公司)。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，LA∶GA=50∶50，分子量38 000 Da，東莞市豪圣塑膠原料有限公司)；甘露醇(批號201025，湖南九典制藥股份有限公司)；泊洛沙姆188(批號P20200610，武漢興起點生物科技有限公司)。

SD大鼠，體質量200～240 g，購于青島市動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK(LU)2018-0007，在實驗室適應1周后進行藥動學研究。

2 方法與結果

2.1 白屈菜紅堿含量測定

2.1.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相甲醇-0.05 mol/L KH2PO4(35∶65)；體積流量1.0 mL/min；溫度30 ℃；檢測波長282 nm。

2.1.2 供試品溶液制備 取1 mL PLGA納米粒混懸液，置于50 mL量瓶中，加入3 mL丙酮超聲處理5 min，甲醇定容，量取2 mL至10 mL量瓶中，流動相定容，即得。

2.1.3 線性關系考察 取白屈菜紅堿對照品約10 mg，精密稱定，甲醇稀釋成每1 mL約含0.2 mg該成分的貯備液，流動相依次稀釋至10、5、2、1、0.5、0.05 μg/mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積(Y)對其質量濃度(X)進行回歸，得方程為Y=15.078 9X-0.061 43(r=0.999 4)，在0.05～10 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 方法學考察 取供試品溶液適量，于 0、3、6、9、12、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得白屈菜紅堿含量RSD為0.63%，表明溶液在24 h內穩定性良好。制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得白屈菜紅堿含量RSD為1.55%，表明該方法重復性良好。取0.05、2、10 μg/mL對照品溶液，同一天內在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定6次，測得日內精密度RSD分別為0.64%、0.38%、0.76%；同法連續測定6 d，每天1次，測得日間精密度RSD分別為0.95%、0.38%、0.71%，表明該方法精密度良好。取9份PLGA納米粒混懸液，每份0.5 mL，每3份為1組，共3組，分別加入貯備液0.75 mL(低)、1.25 mL(中)、1.75 mL(高)，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得白屈菜紅堿平均加樣回收率分別為101.54%、99.48%、100.77%，RSD分別為1.04%、0.68%、0.81%。

2.2 PLGA納米粒制備[13]取30 mg白屈菜紅堿原料藥、處方量PLGA，溶于15 mL丙酮中，超聲溶解，作為有機相，逐滴加到60 mL含一定濃度泊洛沙姆188的水相中(磁力攪拌，轉速800 r/min)，超聲處理后減壓旋蒸除去有機溶劑，置于-15 ℃冰箱中10 min，過0.45 μm微孔濾膜，蒸餾水補足至60 mL，即得。

2.3 指標測定 取PLGA納米粒混懸液適量，蒸餾水稀釋30倍，混勻，取適量于粒度分析儀上測定粒徑、Zeta電位。取1 mL納米粒混懸液至超濾管(截留分子量10 000 Da)中，8 000 r/min離心30 min，測定續濾液中游離白屈菜紅堿量(m1)；按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定白屈菜紅堿總量(m2)，計算包封率、載藥量，公式分別為包封率=[(m2-m1)/m2]×100%、載藥量=[(m2-m1)/m總]×100%，其中m總為PLGA載體、白屈菜紅堿總量。

2.4 制備工藝優化 采用單因素試驗。

2.4.1 表面活性劑種類 固定白屈菜紅堿用量為30 mg，PLGA用量為300 mg，表面活性劑濃度為1%，超聲功率為250 W，超聲時間為10 min，考察吐溫-80、聚乙烯醇、F68對包封率、載藥量、粒徑的影響，結果見表1。由此可知，加入吐溫-80后，包封率、載藥量較低，粒徑較大；加入聚乙烯醇后，包封率、載藥量最高，但它具有一定毒性[16]，可能會影響制劑安全性；F68安全性較好，雖然包封率、載藥量略低于加入聚乙烯醇后，但粒徑最小。因此，最優表面活性劑為F68。

表1 表面活性劑種類對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)

2.4.2 PLGA用量 固定白屈菜紅堿用量為30 mg，F68濃度為1%，超聲功率為250 W，超聲時間為10 min，考察PLGA用量100、200、300、400、500 mg對包封率、載藥量、粒徑的影響，結果見表2。由此可知，隨著PLGA用量增加，包封率升高，在500 mg時無明顯變化，但載藥量顯著降低，粒徑顯著升高，可能是由于其用量過大時體系黏度增加，不利于納米分散所致。因此，最優PLGA用量為400 mg。

表2 PLGA用量對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)

2.4.3 表面活性劑濃度 固定白屈菜紅堿用量為30 mg，PLGA用量為400 mg，超聲功率為250 W，超聲時間為10 min，考察F68濃度0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.3%、1.5%對包封率、載藥量、粒徑的影響，結果見表3。由此可知，F68濃度小于1.0%時，包封率、載藥量顯著降低，可能是因為濃度過低時影響乳化效果，未能有效包裹藥物，但濃度過高時又會導致體系黏度升高，影響PLGA載體包裹藥物，這與F68增溶作用有關；F68濃度小于1.0%時粒徑顯著增加，但大于1.0%時無明顯變化。因此，最優表面活性劑濃度為1%。

表3 表面活性劑濃度對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)

2.4.4 超聲功率 固定白屈菜紅堿用量為30 mg，PLGA用量為400 mg，F68濃度為1%，超聲時間為10 min，考察超聲功率150、200、250、300、350 W對包封率、載藥量、粒徑的影響，結果見表4。由此可知，超聲功率為350 W時，包封率、載藥量顯著降低，但粒徑無明顯變化；為300 W時，粒徑顯著低于250 W時。因此，最優超聲功率為300 W。

表4 超聲功率對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)

2.4.5 超聲時間 固定白屈菜紅堿用量為30 mg，PLGA用量為400 mg，F68濃度為1%，超聲功率為300 W，考察超聲時間6、8、10、12、15 min對包封率、載藥量、粒徑的影響，結果見表5。由此可知，超聲時間為15 min時，體系溫度較高，對PLGA納米粒有一定破壞作用，而且粒徑增大；為12 min時，包封率、載藥量均顯著高于10、15 min時，同時粒徑顯著小于15 min時。因此，最優超聲時間為12 min。

表5 超聲時間對包封率、載藥量、粒徑的影響(n=3)

2.5 驗證試驗 按“2.4”項下優化工藝平行制備3批PLGA納米粒，測得平均包封率為(83.71±1.73)%，載藥量為(5.76±0.27)%，粒徑為(231.82±15.73)nm(圖1)，PDI為0.101±0.014，Zeta電位為(-17.11±1.94)mV(圖2)。

2.6 凍干粉制備 由于PLGA納米粒Zeta電位絕對值較低，可能會影響其儲存穩定性，故進一步將其制成凍干粉。選擇6%甘露醇作為凍干保護劑，將PLGA納米粒置于-45 ℃超低溫冰箱中預凍2 d，再放到初始溫度為-35 ℃的冷凍干燥機中抽真空24 h，取出粉末，立即密封，迅速置于干燥器中保存，測定復溶后其平均粒徑為(284.71±18.66)nm，PDI為0.173±0.019，Zeta電位為(-13.58±1.69)mV。

2.7 晶型分析 取原料藥、空白輔料(比例同PLGA納米粒凍干粉)、物理混合物(原料藥、空白輔料用量比例同PLGA納米粒凍干粉)、PLGA納米粒凍干粉適量，進行XRPD掃描，設定速度為6°/min，2θ范圍為3°～52°，結果見圖3。由此可知，原料藥在5.7°、10.8°、11.6°、14.9°、15.3°、20.4°、22.6°、24.3°處出現衍射峰；空白輔料也出現大量衍射峰，有些強度遠大于原料藥；物理混合物在5.7°、10.8°、11.6°處仍可發現原料藥特征衍射峰；PLGA納米粒凍干粉未見原料藥特征衍射峰，表明后者轉變為無定形狀態。

2.8 溶解度測定 取過量原料藥、物理混合物、PLGA納米粒凍干粉各3份，加入適量蒸餾水，置于37 ℃恒溫振蕩箱中振蕩3 d，取上層混懸液，過0.22 μm水相膜，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算溶解度。結果，原料藥、物理混合物平均溶解度分別為58.46、62.93 μg/mL，而PLGA納米粒凍干粉達783.08 μg/mL，是原料藥的13.4倍。

2.9 體外溶出研究 取原料藥、PLGA納米粒凍干粉(均含15 mg白屈菜紅堿)，加入5 mL蒸餾水，置于透析袋中，以900 mL蒸餾水為釋藥介質，設定溫度為(37±1)℃，轉速為100 r/min，于設定時間點各取樣2 mL，同時補加2 mL蒸餾水，過0.22 μm水相膜，計算累積溶出度，結果見圖4。由此可知，原料藥在24、48、72 h內累積溶出度分別為31.24%、36.76%、43.19%，而PLGA納米粒分別達66.04%、74.83%、81.07%。

2.10 體內藥動學研究

2.10.1 分組、給藥與采血 采用0.5%CMC-Na溶液制備原料藥、PLGA納米粒灌胃液，質量濃度均為3 mg/mL。將禁食過夜的12只大鼠隨機分為2組，每組6只，均以15 mg/kg劑量灌胃給藥(結束后均用1 mL蒸餾水沖洗灌胃針，并注入胃內)，其中原料藥組于0.167、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h采血，PLGA納米粒組于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h采血，均取0.2～0.3 mL，置于肝素浸潤離心管中，振蕩混勻，3 000 r/min離心3 min，移取上層血漿，冷凍保存。

2.10.2 血漿處理 參考文獻[3,6]報道，血漿室溫解凍，量取100 μL至離心管中，加入內標溶液(取鹽酸小檗堿對照品適量，甲醇制成600 ng/mL，即得)50 μL、甲醇200 μL，渦旋3 min得混懸液，加入1 mL氯仿，渦旋振蕩3 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液，40 ℃ N2吹干，加入甲醇100 μL，振蕩復溶，進樣分析。

2.10.3 線性關系考察 將對照品溶液用甲醇依次稀釋至1 800、900、450、200、100、20 ng/mL，分別精密量取100 μL至離心管中，40 ℃ N2吹干，加入空白血漿100 μL，渦旋3 min后加入50 μL內標溶液，作為血漿對照品溶液，按“2.10.2”項下方法處理，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品、內標峰面積比值為縱坐標(Y)，對照品質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為Y=0.029 4X-0.411 8(r=0.991 7)，在20～1 800 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.10.4 方法學考察 取空白血漿、血漿對照品溶液(20 ng/mL)、給藥12 h后血漿適量，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖5，可知對照品、內標均不受血漿內源性物質干擾，表明該方法專屬性良好。取血漿樣品溶液適量，于0、3、6、9、12、24 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得對照品、內標峰面積比值RSD為8.06%，表明樣品在24 h內穩定性良好。取20、450、1 800 ng/mL血漿對照品溶液適量，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定6次，測得對照品、內標峰面積比值RSD分別為3.66%、6.17%、4.23%，表明儀器精密度良好。取20、450、1 800 ng/mL對照品溶液各100 μL，加入50 μL內標溶液，40 ℃ N2吹干，加入100 μL空白血漿，按“2.10.2”項下方法操作處理，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，并與實測值進行對比，測得白屈菜紅堿平均加樣回收率分別為91.94%、96.41%、93.07%。

2.10.5 結果分析 血藥濃度-時間曲線見圖6，主要藥動學參數見表6。由此可知，與原料藥比較，PLGA納米粒tmax、t1/2延長(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，生物利用度增加至4.08倍。

表6 白屈菜紅堿主要藥動學參數

3 討論

本實驗在制備供試品溶液過程中發現，甲醇定容時白屈菜紅堿色譜峰對稱性差，而流動相定容時較好，可能是由于流動相可有效消除溶劑效應所致。結果顯示，PLGA納米粒將白屈菜紅堿溶解度提高至13.4倍，可能與該成分表面積增大、處方中表面活性劑增溶、存在狀態改變等因素有關[19-20]；在各個時間點的累積溶出度均高于原料藥，其原因除了與白屈菜紅堿溶解度提高有關外，還可能是藥物釋放使得納米結構存在間隙，加大PLGA與介質之間的接觸面積，從而加速該劑型降解及藥物釋放[21]。同時，白屈菜紅堿PLGA納米粒tmax顯著延長，可能與載體材料緩釋作用有關[22]，處方中泊洛沙姆188可減緩胃腸道蠕動[23]，增加藥物胃腸道滯留時間，從而影響入血速度；相對生物利用度提高至4.08倍，可能是由于該劑型可提高白屈菜紅堿溶解度、溶出度，從而解決了藥物吸收瓶頸。

另外，PLGA納米粒載體的包裹作用可減少胃腸道各種酶代謝、pH值等對白屈菜紅堿穩定性的影響[20,23-24]，該成分以無定型狀態存在，比晶型藥物更易吸收[25-26]，并且該劑型可有效促進藥物透過黏液層與細胞層進入血液循環[16]，從而提高口服吸收生物利用度。今后，可對白屈菜紅堿PLGA納米粒的注射藥動學、抗腫瘤作用等方面作進一步探索。