基于SIRT1/NF-κB信號通路探究丹參酮ⅡA對抗結核藥物致小鼠肝損傷的影響

王芝林， 于國英

(1.青海省第四人民醫院臨床藥學室，青海 西寧 810000；2.青海省第四人民醫院肝病科，青海 西寧 810000)

結核病是當今世界尤其是發展中國家的主要公共衛生問題之一，每年約有1 000萬新發病例，是引起成年人死于傳染病的主要病因[1]。臨床主要通過利福平和異煙肼等抗結核藥物對結核病進行治療，利福平和異煙肼的聯合使用能有效治療結核桿菌引起的結核病，然而長期或大劑量使用會導致部分患者產生藥物性肝損傷，嚴重者可能導致肝衰竭，威脅患者健康[2]。目前藥物性肝損傷的發病機制尚不明確，沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的去乙酰化酶，可通過抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)改善藥物性肝損傷[3]。丹參酮ⅡA是中藥丹參的主要有效成分之一，具有抗纖維化、抗癌、抗血管生成等多種作用，被用于心血管疾病、糖尿病、肝病等多種疾病的治療[4-5]。研究表明，丹參酮ⅡA對利福平導致的小鼠肝損傷具有一定的保護作用[6]。本研究通過構建抗結核藥物致小鼠肝損傷模型，探討丹參酮ⅡA對肝損傷小鼠的保護作用及對SIRT1/NF-κB信號通路的影響，以期了解丹參酮ⅡA在抗結核藥物致肝損傷中的可能作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠72只，體質量18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2019-0009，于溫度22～25 ℃、相對濕度50%～70%、通風良好的實驗室中飼養，自由飲水進食，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 試劑與藥物 丹參酮ⅡA(純度≥97%，貨號T4952)，購自美國Sigma公司；利福平膠囊(國藥準字H51020786，批號20190125)，購自成都錦華藥業有限責任公司；異煙肼片(國藥準字H31020494，批號20190624)，購自上海上藥信誼藥廠有限公司。SRT1720、EX527(貨號S1129、S1541)，購自美國Selleck公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號AQ-M0183、EM0109)，購自武漢菲恩生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、RIPA裂解液(貨號G1120、R0010)，購自北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(貨號P0012)，購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗鼠SIRT1、NF-κB、β-actin一抗，山羊抗兔IgG H&L(貨號ab189494、ab32360、ab5694、ab6702)，購自英國Abcam公司。

1.3 儀器 CA94089酶標儀，購自美國Molecular Devices公司；BX51顯微鏡，購自日本Olympus公司；Gel-Doc凝膠成像系統，購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 分組與給藥 60只小鼠隨機分為對照組，模型組，丹參酮ⅡA低、高劑量組，SRT1720(SIRT1激活劑)組，丹參酮ⅡA+EX527(SIRT1抑制劑)組，每組10只。除對照組外，其余各組小鼠每天灌胃給予100 mg/kg 利福平和100 mg/kg 異煙肼[7]，對照組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續30 d。利福平、異煙肼灌胃后2 h，丹參酮ⅡA低、高劑量組小鼠給予10、50 mg/kg 丹參酮ⅡA灌胃[6]，SRT1720組小鼠給予20 mg/kg SRT1720灌胃[8]，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠給予50 mg/kg丹參酮ⅡA和10 mg/kg EX527灌胃[9]，對照組和模型組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續30 d。給藥期間，觀察小鼠精神狀態、進食飲水及活動情況，并記錄體質量變化。

2.2 取材 末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，腹主動脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，取適量用于生化指標檢測，剩余血清分裝后于-80 ℃冰箱保存。處死小鼠，無菌條件下摘取肝臟，生理鹽水沖洗，一部分置于10%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋；另一部分保存于-80 ℃冰箱中，用于后續實驗。

2.3 小鼠血清肝功能、血脂及炎癥因子水平檢測 全自動生化分析儀檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。取-80 ℃冰箱中保存的血清，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.4 HE染色觀察小鼠肝組織病理學變化 取“2.2”項下石蠟包埋的肝組織，石蠟切片機切片(4 μm)，脫蠟至水，HE染色，顯微鏡下觀察小鼠肝組織病理學形態，并進行病理學損傷評分。肝組織病理學損傷評分標準主要依據肝細胞壞死、炎性細胞浸潤、肝竇充血、門管區水腫4個方面進行評分(無病變或非常輕微為0分，輕度病變為2分，重度病變為3分，極重度病變為4分)，各項評定分數總和為最終肝組織病理學損傷評分，每組隨機選取10個視野，取平均值后進行統計學分析。

2.5 免疫組化檢測小鼠肝組織SIRT1、NF-κB蛋白表達 取“2.2”項下石蠟包埋的肝組織，石蠟切片機切片(4 μm)，60 ℃烤箱烘干，常規脫蠟、水化后抗原修復，加入兔抗鼠SIRT1、NF-κB一抗，4 ℃過夜，加入山羊抗兔IgG H&L二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇短暫分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察SIRT1、NF-κB陽性表達(棕黃色)。每張切片隨機選取3個區域，Image J圖像分析軟件測定光密度。

2.6 Western blot法檢測小鼠肝組織中SIRT1、NF-κB蛋白表達 取“2.2”項下于-80 ℃冰箱中保存的小鼠肝組織，加入RIPA組織裂解液，冰上勻漿，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，在95 ℃下變性，配制10%分離膠，5%濃縮膠，取10 μL樣品上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后轉膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜3次，加入兔抗鼠SIRT1、NF-κB、β-actin一抗稀釋液，在4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜3次，加入山羊抗兔H&L IgG二抗稀釋液，室溫孵育，TBST洗膜3次，化學發光法顯色，蛋白凝膠成像系統成像，Image J圖像處理軟件分析蛋白條帶灰度值。

3 結果

3.1 小鼠一般情況 對照組小鼠毛發整齊干凈，進食飲水、活動正常，體質量增加規律；模型組小鼠毛發稀疏蓬亂，精神萎靡，活動量減少，進食飲水量下降，體質量增加不明顯或下降；丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠活動、進食飲水情況較模型組有所改善；而丹參酮ⅡA+EX527組小鼠狀態較丹參酮ⅡA高劑量組稍差。

3.2 丹參酮ⅡA對小鼠血清肝功能及血脂水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低(P<0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠血清ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高(P<0.01)；與丹參酮ⅡA高劑量組比較，SRT1720組小鼠血清ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平無明顯差異(P>0.05)，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠血清ALT、AST、TBIL、TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低(P<0.01)，見表1。

表1 各組小鼠血清肝功能及血脂水平比較

3.3 丹參酮ⅡA對小鼠肝組織病理學變化及病理學損傷評分的影響 對照組小鼠肝組織形態正常，結構完整，無病變發生，肝細胞排列均勻；模型組小鼠肝小葉受到破壞，肝索排列紊亂，伴有炎性細胞浸潤，肝細胞出現大量壞死，病理損傷評分高于對照組(P<0.01)；丹參酮ⅡA低劑量組小鼠肝組織損傷程度降低，炎性細胞浸潤變輕，部分肝細胞出現壞死，病理損傷評分低于模型組(P<0.01)；丹參酮ⅡA高劑量組和SRT1720組小鼠肝小葉結構基本完整，肝索排列較為整齊，炎性細胞浸潤程度和細胞壞死減輕，病理損傷評分均低于模型組(P<0.01)，且2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；而丹參酮ⅡA+EX527組小鼠肝組織損傷程度重于丹參酮ⅡA高劑量組(P<0.01)，見圖1、表2。

表2 各組小鼠病理損傷評分比較

3.4 丹參酮ⅡA對小鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.01)；與丹參酮ⅡA高劑量組比較，SRT1720組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平差異無統計學意義(P>0.05)，丹參酮ⅡA+EX527組血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.01)，見表3。

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較

3.5 丹參酮ⅡA對小鼠肝組織SIRT1、NF-κB蛋白表達的影響 小鼠肝組織SIRT1主要表達于細胞核內，NF-κB在細胞核和細胞漿內均有表達。與對照組比較，模型組小鼠肝組織SIRT1陽性表達降低(P<0.01)，NF-κB陽性表達升高(P<0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠肝組織SIRT1陽性表達升高(P<0.01)，NF-κB陽性表達降低(P<0.01)；與丹參酮ⅡA高劑量組比較，SRT1720組小鼠肝組織SIRT1、NF-κB陽性表達差異無統計學意義(P>0.05)，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠肝組織SIRT1陽性表達降低，NF-κB陽性表達升高(P<0.01)，見表4、圖2。

表4 各組小鼠肝組織SIRT1、NF-κB蛋白表達比較

3.6 丹參酮ⅡA對小鼠肝組織SIRT1/NF-κB通路蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠肝組織SIRT1蛋白表達降低(P<0.01)，NF-κB蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA各劑量組和SRT1720組小鼠肝組織SIRT1蛋白表達升高(P<0.01)，NF-κB蛋白表達降低(P<0.01)；與丹參酮ⅡA高劑量組比較，SRT1720組小鼠肝組織SIRT1、NF-κB蛋白表達無明顯差異(P>0.05)，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠肝組織SIRT1蛋白表達降低(P<0.01)，NF-κB蛋白表達升高(P<0.01)，見表5、圖3。

表5 各組小鼠肝組織SIRT1/NF-κB通路蛋白表達比較

4 討論

利福平和異煙肼是臨床上治療結核病的主要藥物，兩者長期聯合使用會引起藥物性肝損傷的發生[10-11]。本研究通過利福平和異煙肼聯合灌胃構建抗結核藥物致肝損傷小鼠模型，探討藥物性肝損傷小鼠治療相關機制，結果表明，模型組小鼠血清ALT、AST、TBIL水平升高，且肝組織中肝小葉受到破壞，肝索排列紊亂，伴有炎性細胞浸潤，肝細胞出現大量壞死，提示造模成功，可用于后續實驗研究。

丹參酮ⅡA具有抗炎、抗氧化、抗菌等多種生物學活性，可用于多種肝臟疾病的治療[12-13]。研究表明TNF-α、IL-1β的表達與藥物性肝損傷、免疫性肝損傷等肝臟疾病發生有關[14-15]。本研究結果提示，炎癥與利福平和異煙肼引起的藥物性肝損傷的發生有關。Huang等[16]研究表明丹參酮ⅡA能夠抑制高脂飲食誘導的肝損傷大鼠的炎癥反應和肝細胞凋亡，改善大鼠肝損傷。Zhang等[17]研究表明丹參酮ⅡA通過改變乙酰氨基酚及其代謝產物的藥代動力學特征，防止乙酰氨基酚誘導的小鼠肝毒性。Yang等[18]研究表明丹參酮ⅡA能夠減輕利福平誘導的膽汁淤積引起的大鼠肝損傷。本研究結果提示，丹參酮ⅡA對藥物性肝損傷可能有一定的治療效果。進一步研究表明，丹參酮ⅡA可能通過抑制利福平聯合異煙肼引起的炎癥反應，減輕小鼠肝損傷，具體機制有待進一步研究。

SIRT1參與炎癥反應、物質代謝、氧化應激等多種生物學途徑[19]。NF-κB是炎癥反應的主要調節因子，參與炎癥性疾病的發生發展[20]。SIRT1通過抑制NF-κB信號通路，從而發揮抗炎作用[21]。Niu等[22]研究表明SIRT1的上調通過抑制NF-κB信號通路防止高脂飲食誘導的小鼠肝損傷。本研究結果表明，SIRT1/NF-κB信號通路可能與抗結核藥物引起的肝損傷有關。研究發現激活SIRT1/NF-κB信號通路有助于改善利福平聯合異煙肼導致的小鼠肝損傷。Quan等[23]認為丹參酮ⅡA可能通過調節SIRT1/NF-κB信號通路保護脂多糖誘導的小鼠肺損傷。本研究結果提示，丹參酮ⅡA可能促進SIRT1/NF-κB信號通路的激活。本研究還發現，與丹參酮ⅡA高劑量組比較，丹參酮ⅡA+EX527組小鼠肝組織SIRT1蛋白表達降低，NF-κB蛋白表達升高，且小鼠血清炎癥因子水平升高，肝損傷程度加重，進一步說明丹參酮ⅡA通過激活SIRT1/NF-κB信號通路，減輕抗結核藥物導致小鼠肝損傷。

綜上所述，丹參酮ⅡA可能通過激活SIRT1/NF-κB信號通路，抑制利福平和異煙肼聯合導致的小鼠炎癥反應，減輕小鼠肝損傷，這可能是丹參酮ⅡA在治療藥物性肝損傷中的相關機制。本研究為臨床使用丹參酮ⅡA防治抗結核藥物引起的肝損傷提供了理論依據。