右歸丸中鹿角膠的鑒別

鄧杰華， 李存金， 周云峰， 鄧見春， 吳 喆， 黃炳泉*

(1.宜春市檢驗檢測中心，江西 宜春 336000；2.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029；3.高安市人民醫院，江西 宜春 336000)

右歸丸由熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、菟絲子、鹿角膠、杜仲、肉桂、當歸、制附子組成，具有溫補腎陽、填精益髓的功效，主治腎陽不足，命門火衰證，方中附子、肉桂、鹿角膠培補腎中元陽，溫里祛寒，共為君藥[1]。鹿角膠又稱白膠、鹿膠，是由鹿科動物梅花鹿或馬鹿等的角經水煎煮[2]、濃縮制成，乃溫補腎陽之上品[3]，同時具有抗乳腺增生、抗骨質疏松、活血、鎮痛[4-8]等作用。

膠類藥材是指由動物的皮、骨骼等加工而成的膠原蛋白水解肽，根據原料來源和功效不同，可分為阿膠、鹿角膠、龜甲膠、黃明膠、海龍膠、新阿膠等[9]，其蛋白質類成分組成較為復雜[4]，對胰蛋白酶消化膠類藥材蛋白質產生的肽段進行分析的研究已有報道[9-10]。鹿角膠屬于名貴藥材，全國需求量大，一些不法商家為節約成本、謀求暴利，會在鹿角膠熬制過程中摻入豬皮、牛皮、驢皮等成分[11-12]，以達到以次充好、以假亂真的目的。右歸丸標準未對鹿角膠藥材進行質量控制，難以保證鹿角膠投料質量[2]?；诖?，擬采用UPLC-MS/MS 技術，建立同時檢測右歸丸中鹿角膠、豬皮源(新阿膠)、牛皮源(黃明膠)及驢皮源(阿膠)的方法，實現右歸丸中同時測定鹿角膠與非法添加成分，以期為右歸丸質量標準的提升提供依據和思路。

1 材料

Waters Acquity UPLC H-class/xevo TQD液相色譜質譜聯用儀(美國Waters公司)；SPX-150881-II生化培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)；PL-S60超聲波清洗儀(東莞康士潔超聲波科技有限公司)；MS205DU電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TG16-WS離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

右歸丸(43批來自市場監督抽樣，2批通過網絡平臺自購)。鹿角膠(批號121694-201702)、阿膠(批號121274-201703)、新阿膠(批號121745-201701)、黃明膠(批號121695-201802)對照藥材均購于中國食品藥品檢定研究院。碳酸氫銨(批號BCBL9865V)、胰蛋白酶(批號SLBZ8570)均購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。乙腈購于德國默克公司；甲酸購于美國賽默飛公司；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～1.5 min，5%A；1.5～3.0 min，5%～10%A；3.0～4.0 min，10%～20%A；4.0～5.0 min，20%～60%A；5.0～5.1 min，60%～95%A；5.1～6.5 min，95%A；6.5～6.6 min，95%～5%A；6.6～8.5 min，5%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測，多反應監測(MRM)模式；脫溶劑氣溫度600 ℃，體積流量1 000 L/h；錐孔氣體積流量60 L/h，其他參數見表1。其中，鹿角膠離子對選擇參照2020年版《中國藥典》[2]鹿角膠鑒別項，黃明膠、阿膠離子對選擇參照藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件(編號2014014)[13]，新阿膠離子對選擇參照鹿角膠中豬皮源成分檢查項補充檢驗方法(BJY201915)[14]。

表1 各樣品質譜參數

2.3 溶液制備

2.3.1 對照藥材溶液 稱取鹿角膠對照藥材粉末約0.1 g，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm水系微孔濾膜濾過，取續濾液10 mL，置于50 mL離心管中，加胰蛋白酶溶液(取胰蛋白酶適量，加1%碳酸氫銨溶液制成每1 mL中含1 mg的溶液，臨用現配)1 mL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。精密稱取黃明膠、新阿膠、阿膠對照藥材粉末各0.1 g，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取5 mL，置于同一100 mL量瓶中，加鹿角膠基質溶液(取鹿角膠對照藥材粉末約0.1 g，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得)稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液1 mL，置于1.5 mL進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液100 μL，搖勻，置于37 ℃生化培養箱中恒溫酶解12 h，即可。

2.3.2 供試品溶液 樣品剪細，取約1.5 g(約相當于鹿角膠0.1 g)，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，8 000 r/min離心10 min，0.22 μm水系微孔濾膜過濾，取續濾液1 mL，置于1.5 mL進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液100 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 取不含鹿角膠的右歸丸陰性樣品約1.5 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm水系微孔濾膜過濾，取續濾液40 mL，置于50 mL離心管中，加胰蛋白酶溶液4 mL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.3.4 陽性樣品溶液 取陰性樣品約1.5 g，精密稱定，加入鹿角膠、黃明膠、新阿膠、阿膠對照藥材各0.1 g，按“2.3.3”項下方法制備，即得。

2.3.5 空白溶液 取空白樣品適量，按“2.3.3”項下方法制備，即得。

2.4 專屬性試驗 取“2.3”項下對照藥材、供試品、陰性樣品、陽性樣品、空白溶液適量，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，供試品溶液出現與鹿角膠對照藥材保留時間一致的色譜峰；陽性樣品溶液出現與各對照藥材相對應的色譜峰；空白溶液對測定無干擾；陰性樣品溶液含有1個與阿膠對照藥材保留時間一致的色譜峰，但提取相應離子對后未發現上述色譜峰，表明陰性樣品、空白溶液均對測定無干擾，該方法專屬性良好。

2.5 檢出限 精密量取“2.3”項下對照藥材溶液適量，加陰性樣品溶液稀釋，當鹿角膠對照溶液稀釋5 000倍(相當于稱取對照藥材0.02 mg)、黃明膠對照溶液稀釋1 000倍(相當于稱取對照藥材0.1 mg)、新阿膠對照溶液稀釋1 000倍(相當于稱取對照藥材0.1 mg)、阿膠對照溶液稀釋1 000倍(相當于稱取對照藥材0.1 mg)時，能檢出各成分相應離子對。

2.6 精密度、重復性試驗 取同一份混合對照藥材溶液適量，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定6次，測得4種膠特征肽的定量離子對峰面積RSD為0.8%～1.4%，表明儀器精密度良好。平行精密稱取同一批樣品6份，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得鹿角膠、黃明膠、新阿膠、阿膠峰面積RSD分別為2.5%、2.9%、3.2%、2.1%，表明該方法重復性良好。

2.7 樣品測定 取45批樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，提取各成分離子流圖，進行子離子掃描驗證，與對照藥材溶液進行比較，若供試品溶液出現與各對照藥材特征離子對保留時間一致的色譜峰，而且二級質譜基本一致，則可判定該溶液含有相應成分。結果，所有批次樣品均檢出鹿角膠特征離子對，而豬皮源、牛皮源、驢皮源成分均未檢出。

3 討論

鹿角膠取樣量為0.1 g，按照右歸丸處方量及制劑工藝計算，樣品取樣量約為1.5 g；各對照藥材在用1%碳酸氫銨溶液溶解定容后，可直接用水膜過濾，而樣品屬于小蜜丸和大蜜丸，煉蜜含量較高，用1%碳酸氫銨溶液超聲提取后，溶液較黏稠渾濁，難以透過0.22 μm水膜，過濾操作困難，需要經過離心使溶液沉淀下沉，選取上清液再進行過濾。另外，當樣品與酶的比例為10∶1、酶解時間為12 h時，酶解基本完全，各特征離子的峰面積基本無顯著變化。

4 結論

本實驗采用超高效液相色譜-質譜聯用(UPLC-MS/MS)法建立右歸丸中鹿角膠質量控制方法，其檢測速度快，專屬性強，準確度高，能同時完成方中鹿角膠及常見摻偽成分的檢驗檢測，可對該制劑中鹿角膠藥材進行有效監控，并能進一步完善相關質量標準。