基于PI3K/Akt/FoxO1信號通路探索白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠胰腺組織的保護作用

王 芳， 姚敏娜， 張 雅， 王四旺*

(1.陜西能源職業技術學院醫學院，陜西 咸陽 712000；2.空軍軍醫大學藥學院，陜西 西安 710032)

據國際糖尿病聯盟2017年報道，全球2型糖尿病患者約有4.51億，在2045年預計達到6.93億，預測到2035年我國2型糖尿病人數將達到1.43億[1-2]。2型糖尿病發病機制復雜，目前認為胰島素抵抗及胰島β細胞功能缺陷是其發病的主要機制[3]，胰島素抵抗伴隨其發生、發展；胰島β細胞功能缺陷是2型糖尿病發生的必要條件[4]，而氧化應激可以直接或間接加重胰島素抵抗以及胰島β細胞的損傷[5-7]。因此，保護胰島β細胞功能，抑制胰島β細胞凋亡對治療2型糖尿病有著重大意義。通過研究表明，磷脂酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B/磷酸化插頭轉錄因子1(PI3K/Akt/FoxO1)信號通路對于胰島β細胞生長、發育、增殖、凋亡、分化和胰島素分泌等方面具有重要作用[8]。

白虎加人參湯始見于《傷寒雜病論》，由知母、石膏、甘草、粳米、人參組成，具有養陰清熱，益氣生津的功效，大量研究表明，白虎加人參湯可以有效改善糖尿病患者臨床癥狀，降低血糖，改善胰島素抵抗、保護胰島β細胞、抗氧化應激作用[9-13]，在臨床上已被應用于2型糖尿病治療，并且取得了很好的療效[14-19]，但是其作用機制尚不明確。因此，本研究通過探索白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠胰腺組織的保護作用及其作用機制，以期為白虎加人參湯臨床合理應用提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，體質量(200±20)g，由空軍軍醫大學實驗動物研究中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(軍)2021-001。飼養條件為溫度(23±2)℃，相對濕度(50±5)%，12 h/12 h自控照明，大鼠均有專業人員負責飼養，日常自由進食和飲水，適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 藥物 白虎加人參湯按組方比例取知母18 g、石膏50 g、炙甘草6 g、粳米9 g、人參10 g，以8倍量蒸餾水浸泡30 min，煎煮2次，合并煎液，濾過后濃縮至生藥量2 g/mL，置于4 ℃冰箱中保存備用。二甲雙胍(批號20190304)為陽性藥，購自中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司，批號S0130)；高脂高糖飼料(上海普路騰生物科技有限公司，批號20210621-074)；大鼠胰島素ELISA試劑盒(瑞典Mercodia公司，批號10-1250-10)；糖化血紅蛋白(HbAlc)試劑盒(瑞士ALEXIS公司，批號YB-R0298c)；甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(TCH)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL)試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，批號分別為A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1)；細胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒、抗Akt抗體、HRP標記山羊抗兔(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為G2026、G2002、GB111114、GB23303)；抗p-Akt抗體、抗FoxO1抗體、抗葡萄糖激酶(GCK)抗體、抗胰十二指腸同源盒因子-1(Pdx1)抗體、GAPDH抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號分別為4060、2880、3782、5679、5174)；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)[寶生物工程(大連)有限公司，批號AIG2018A]。血糖儀及血糖試紙(美國Abbott公司)；Nanodrop 2000超微量核酸蛋白檢測儀(美國Thermo Fisher公司)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 大鼠按照體質量隨機分為正常組(8只)和造模組(50只)，正常組繼續給予正常飼料喂養，造模組給予高脂高糖飼料喂養，4周后禁食不禁水12 h，造模組腹腔注射STZ(40 mg/kg)，正常組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 4.2)，72 h后禁食不禁水12 h，檢測血糖。1周后再次復查，2次空腹血糖(FBG)均大于16.7 mmol/L者為造模成功。

2.2 分組及給藥 挑選造模成功的大鼠，按照體質量隨機分為模型組，二甲雙胍組(200 mg/kg)，白虎加人參湯高、低劑量組(37.8、9.45 g/kg)，每組8只，給藥8周，模型組和給藥組每天均給予高脂高糖飼料，正常組每天繼續給予正常飼料。觀察記錄給藥期間大鼠體質量、FBG及行為狀態。

2.3 標本處理與采集 分別在給藥第0、2、4、6、8周時，禁食不禁水12 h后，尾靜脈取血，檢測FBG。腹腔給予10%水合氯醛麻醉，待大鼠完全麻醉，經腹主動脈取血，一部分裝于抗凝離心管中，用于檢測HbAlc；剩余血裝于普通離心管中，3 500 r/min離心15 min，分離上層血清，用于檢測其他生化指標。取血后，迅速分離出胰腺組織，稱定質量，分離出一部分放入4%多聚甲醛溶液中，用于石蠟切片制備及后續形態學觀察；剩余胰腺組織于-80 ℃凍存，用于PI3K/Akt/FoxO1信號通路相關蛋白檢測。

2.4 生化指標檢測 按照相關試劑盒說明書檢測HbAlc、胰島素(insulin，INS)、TG、TCH、HDL、LDL水平，并計算胰島素敏感指數(ISI)。

2.5 石蠟切片制備及病理學觀察 取固定于4%多聚甲醛溶液中的各組大鼠胰腺組織，用各體積分數乙醇梯度脫水，每級1.5 h，使用二甲苯透明標本，將透明化組織塊完全浸沒于60～65 ℃石蠟液體中恒溫過夜，用熔化的蠟液包埋組織，待冷卻成型后，在石蠟切片機上以5 μm厚度連續切片，脫蠟，蘇木精-伊紅染色，封片。于光學顯微鏡下觀察胰腺組織病理變化。

2.6 RT-qPCR法檢測胰腺組織中caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表達 取大鼠胰腺組織100 mg，采用實時熒光定量PCR法檢測caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表達，引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，以GAPDH為內參，引物序列見表1。反應條件為預變性95 ℃ 10 min；擴增 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環；熔解曲線反應條件為60 ℃升至95 ℃，0.3 ℃/15 s。使用2-ΔΔCT法計算基因相對表達。

表1 引物序列

2.7 Western Blot法檢測胰腺組織Akt、p-Akt、FoxO1、Pdx1、GCK蛋白表達 取大鼠胰腺組織100 mg提取總蛋白和核蛋白，經BCA法定量和蛋白變性后，進行SDS-PAGE電泳，蛋白轉移至PVDF轉膜后進行封閉，用一抗稀釋液分別稀釋一抗p-Akt(1∶5 000)、Akt(1∶5 000)、FoxO1(1∶5 000)、Pdx1(1∶5 000)、GCK(1∶5 000)、GAPDH(1∶5 000)，充分覆蓋PVDF膜，4 ℃孵育過夜，次日使用TBST洗5次，每次5 min，放入二抗(1∶2 000)溶液中，室溫孵育1 h，TBST洗5次，每次5 min，避光現配ECL化學發光液，于暗室中加至PVDF 膜的蛋白面，充分接觸，1～2 min后去盡殘液，放入暗匣中曝光，曝光后的膠片用顯影、定影試劑進行顯影和定影。將膠片進行掃描，以Photoshop軟件整理去色，Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

2.8 免疫組織化學染色觀察FoxO1蛋白表達 胰腺組織切片脫蠟至水，置EDTA緩沖液中微波修復，滴加5% BSA室溫封閉30 min，加入一抗FoxO1(1∶400)充分覆蓋切片，4 ℃孵育過夜，PBS洗4次，每次5 min，甩干，滴加二抗(1∶400)，甩干，滴加試劑SABC，室溫1.5 h，滴加3,3-二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，水洗3次，每次5 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。可見黃色或棕色沉積即為FoxO1蛋白陽性表達。

3 結果

3.1 白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠FBG、INS、HAblc水平的影響 正常組大鼠精神狀態良好，皮毛有光澤，空腹血糖正常。如圖1A所示，與正常組比較，模型組大鼠FBG升高(P<0.05)；與模型組比較，2周后，陽性藥組和白虎加人參湯高劑量組FBG水平降低(P<0.05)，而白虎加人參湯低劑量組在給藥4周后，FBG水平降低(P<0.05)，提示白虎加人參湯能夠降低2型糖尿病大鼠的FBG。如圖1B～1C所示，與正常組比較，模型組大鼠INS水平降低(P<0.05)，HAblc水平升高(P<0.05)；與模型組比較，8周后，各給藥組大鼠INS水平升高(P<0.05)，HAblc水平降低(P<0.05)。

3.2 白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠ISI的影響 如表2所示，與正常組比較，模型組ISI降低(P<0.05)；8周后，與模型組比較，各給藥組ISI均升高(P<0.05)。

表2 白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠ISI的影響

3.3 白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠胰腺指數的影響 采用STZ造模時，會損傷大鼠的胰腺組織，如圖2所示，模型組大鼠胰腺指數低于正常組(P<0.05)；白虎加人參湯干預8周后，大鼠胰腺指數與模型組比較均升高(P<0.05)，提示白虎加人參湯可改善2型糖尿病大鼠的胰腺萎縮。

3.4 白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠血脂代謝的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TCH、LDL水平均升高(P<0.05)，HDL水平降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TG、TCH、LDL水平均降低(P<0.05)，白虎加人參湯高劑量組大鼠血清HDL水平升高(P<0.05)，提示白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠的血脂具有改善作用。

3.5 白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠胰島病理組織形態學的影響 正常組大鼠胰島呈橢圓形，結構規整，胞團大小不一，結構完整、規則、邊緣清晰，散布于胰腺腺泡之間，胰島內β細胞豐富、大小均勻、形態飽滿，排列緊密，未發現病理變化；模型組大鼠胰島形態不規則，邊界模糊，結構紊亂，胰島內β細胞腫脹、變形，細胞質染色變淺；與模型組比較，各給藥組大鼠胰島內β細胞數目明顯增加，結構較規整，無明顯壞死，胰島邊界清晰，形態結構有所改善，見圖4。

3.6 白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠胰腺組織凋亡相關基因表達的影響 如圖5所示，與正常組比較，模型組大鼠胰腺組織caspase3、Bax/Bcl-2 mRNA表達升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠胰腺組織caspase3、Bax/Bcl-2 mRNA表達均降低(P<0.05)，提示白虎加人參湯具有抗2型糖尿病大鼠胰腺組織凋亡的作用。

3.7 白虎加人參湯對2型糖尿病大鼠胰腺組織p-Akt、Akt、Pdx1、FoxO1、GCK蛋白表達的影響 如圖6A～6E所示，與正常組比較，模型組大鼠胰腺組織PI3K/Akt/FoxO1信號通路受到抑制，p-Akt/Akt、Pdx1、GCK蛋白表達降低(P<0.05)，而FoxO1的核輸出減少，細胞核中FoxO1增多(P<0.05)，活性下降；與模型組比較，8周后，各給藥組大鼠胰腺組織p-Akt/Akt、Pdx1、GCK蛋白表達均升高(P<0.05)，FoxO1蛋白表達減少(P<0.05)，促進了FoxO1的核輸出。如圖6F所示，免疫組化實驗同Western blot實驗結果一致，提示白虎加人參湯可能是通過影響PI3K/Akt/FoxO1信號通路中的相關蛋白表達來發揮保護胰腺組織的作用。

4 討論

白虎加人參湯始見于《傷寒雜病論》，由知母、石膏、甘草、粳米、人參組成。生石膏辛甘大寒為君藥，專清肺胃之熱邪，既可清陽明之內熱, 又能滋養肺陰, 與少陰腎經之知母相配, 既可瀉無根之腎火, 宣氣分之郁熱, 又可養陰生津; 知母之辛苦寒涼, 下則潤腎燥以滋陰, 上則清肺金而瀉火，石膏知母相須為用，加強清熱生津的作用；人參為佐，一可升脾氣，助運化，資生化之源，二可補元氣，人參與石膏相配，石膏得人參能清熱補虛，且不傷氣陰，人參得石膏可補而不燥，二者相得益彰；粳米生胃津益胃氣; 甘草和胃養陰，共奏清熱止渴、益氣生津之效，為治療消渴病的有效方藥。

目前，胰島素抵抗和胰島β細胞功能缺陷被認為是2型糖尿病發病的重要病理生理機制[20]。因此，預防與治療2型糖尿病的關鍵是保護胰島β細胞、減少胰島β細胞凋亡及增加INS分泌。本實驗發現，給予白虎加人參湯8周后，2型糖尿病大鼠血清INS分泌增多，FBG和HAblc水平均下降，ISI升高，并且可改善2型糖尿病大鼠的血脂代謝。為了探究其INS分泌增多的原因，本研究發現，白虎加人參湯可以改善2型糖尿病大鼠的胰島組織病理變化，其還可以降低凋亡相關因子caspase3和Bax/Bcl-2的mRNA表達，增加胰腺指數，從而保護胰島β細胞，延緩胰島β細胞凋亡的進程。

PI3K/Akt信號通路作為一條經典信號通路, 對調控胰島β細胞的凋亡、增殖，調節INS敏感性，緩解胰島素抵抗[21]及促進INS分泌[22]等方面具有重要作用。PI3K通過影響Akt磷酸化，來介導胰島素和多種生長因子對糖代謝的調節及細胞生長、增殖和細胞周期調節等。FoxO1使Akt失去轉錄活性，抑制胰島β細胞凋亡[8]，增加胰島β細胞數目，保護胰島β細胞。FoxO1調控胰島β細胞增殖的過程，是Pdx1的負性調節劑，在胰島β細胞生長和發揮功能中起到關鍵作用。而Pdx1也是葡萄糖轉運子2(GLUT-2)和GCK等與胰島素釋放有關的一組基因轉錄調控因子。由此可見，PI3K/Akt/FoxOl信號通路對于胰島β細胞的生長、發育、增殖、凋亡和胰島素分泌等方面具有重要作用。本研究發現，白虎加人參湯可以提高胰腺組織中的p-Akt/Akt、Pdx1、GCK蛋白表達升高，減少FoxO1蛋白表達，促進了FoxO1的核輸出。

綜上所述，白虎加人參湯可以降低2型糖尿病大鼠FBG、HAblc水平，促進血清INS分泌及ISI升高，并且可改善2型糖尿病大鼠的血脂代謝，還可降低凋亡相關因子caspase3和Bax/Bcl-2的mRNA表達，增加胰腺指數，改善2型糖尿病大鼠的胰島組織病理變化，其機制可能是通過調控PI3K/Akt/FoxO1信號通路發揮作用。