當(dāng)歸揮發(fā)油對人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的作用

朱麗娟， 宋潤澤， 羅慧英， 王麗娟， 張安平， 臧凱宏*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院血管外科，甘肅 蘭州 730000)

結(jié)直腸癌是全球最常見的癌癥之一，其發(fā)病率和死亡率均居于前列，對人類的生命和健康造成嚴(yán)重威脅[1]。目前，結(jié)直腸癌主要通過手術(shù)切除治療，輔之以放、化療等其他治療手段，會引起抑制骨髓、細(xì)胞耐藥等副作用[2]。天然藥物具有多重作用靶點，能夠影響腫瘤進(jìn)程的多個環(huán)節(jié)，且毒性較低，不易產(chǎn)生耐藥性，是結(jié)直腸癌綜合治療的重要手段。當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels是臨床常用的中藥，具有潤腸通便、活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛的功效，其化學(xué)成分復(fù)雜，可分為揮發(fā)油和多糖、有機酸等水溶性成分兩大類[3]，已有研究證實，當(dāng)歸多糖等水溶性成分能夠抑制多種癌癥[4]，但其揮發(fā)性成分對腫瘤的作用尚不明確。本實驗以人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞為對象，研究當(dāng)歸揮發(fā)油影響人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的作用及相關(guān)分子機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫，由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)研究所傳代保種。

1.2 試劑與藥物 當(dāng)歸揮發(fā)油(蘭州和盛堂制藥股份有限公司，批號20180709)。MTT、胰酶(美國Sigma公司，貨號298-93-1、8049-47-6)；青霉素與鏈霉素雙抗混懸液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號20180626、20180902)；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國HyClone公司，批號AB212917、NIJ1221)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號20181219、20181125)；Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、β-catenin、c-myc、cyclin D1抗體(美國CST公司，貨號4223、5023、9664、8480、18583、55506)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(英國Abcam公司，貨號ab6721)。

1.3 儀器 Shellab 2323型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Shellab公司)；SW-CJ-IFD型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；Anke TDL-5型低速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；ELX 800型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；VE-180型電泳儀(上海天能科技有限公司)；ME104E/02型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；LX11-22PH/FL型倒置相差顯微鏡、BX-51型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及給藥 HCT-116細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為對照組及6.25、12.5、25、50、100 μg/mL當(dāng)歸揮發(fā)油組，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，用培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104/mL，每孔90 μL加至96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，對照組加入培養(yǎng)液10 μL，當(dāng)歸揮發(fā)油組分別加入10 μL 6.25、12.5、25、50、100 μg/mL當(dāng)歸揮發(fā)油，每組均設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率 各組細(xì)胞按“2.1”項下方法培養(yǎng)44 h后，每孔均加入10 μL終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MTT，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，各孔加入10% SDS 100 μL，振蕩10 min，于570 nm波長處檢測吸光度(A)，計算細(xì)胞增殖抑制率。

2.3 細(xì)胞克隆形成實驗 取對數(shù)生長期HCT-116細(xì)胞，計數(shù)并于60 mm培養(yǎng)皿中接種250個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，設(shè)對照組、當(dāng)歸揮發(fā)油組，分別加入500 μL培養(yǎng)液、50 μg/mL當(dāng)歸揮發(fā)油，培養(yǎng)2～3周，出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時，PBS清洗，用冰醋酸和無水甲醇(1∶7)配制的固定液固定15 min，待自然干燥后用1%結(jié)晶紫染液染色30 min，流水緩慢沖洗凈殘余染液，室溫干燥，倒置顯微鏡下計數(shù)并計算克隆形成率。

2.4 細(xì)胞劃痕實驗 取對數(shù)生長期HCT-116細(xì)胞接種于12孔板，按“2.3”項下方法分組，培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合度時，取10 μL吸頭在孔中輕輕劃直線，將周邊脫落的細(xì)胞用PBS清洗，加入含5%胎牛血清及相應(yīng)藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下拍照，實驗重復(fù)3次。

2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期HCT-116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，在60 mm培養(yǎng)皿中接種6 mL細(xì)胞懸液，按“2.3”項下方法分組，培養(yǎng)24 h后加入相應(yīng)藥物600 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷的300 μL PBS(pH 7.4)將其混勻，緩慢加入預(yù)冷的無水乙醇700 μL，4 ℃固定24 h以上。檢測時用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞沉淀，1 000 r/min離心5 min，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，加入50 mg/L RNase與50 mg/L碘化丙啶(PI)工作液，混勻后避光染色30 min，流式細(xì)胞儀設(shè)定激發(fā)波長488 nm，吸收波長600 nm，將細(xì)胞過濾后上機檢測，通過Modifit軟件分析各周期中細(xì)胞比例。

2.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率 按“2.5”項下方法收集細(xì)胞沉淀，嚴(yán)格按試劑盒說明操作，用250 μL Binding Buffer將細(xì)胞懸浮，加入AnnexinV-FITC及PI各2.5 μL，混勻后避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀設(shè)定激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，1 h內(nèi)上機檢測，通過FlowJo軟件分析，在FCM雙變量的散點圖上，左下象限反映活細(xì)胞比例，右上及右下象限分別反映晚期和早期凋亡細(xì)胞比例，細(xì)胞凋亡率比例由晚期和早期凋亡細(xì)胞比例總和表示。

2.7 Western blot法檢測細(xì)胞凋亡及Wnt/β-Catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期HCT-116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，將9 mL細(xì)胞懸液接種在100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，按“2.3”項下方法分組，培養(yǎng)24 h后加入相應(yīng)藥物1 mL，培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h，加入Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、cleaved-caspase-3(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、c-myc(1∶1 000)、cyclin D1(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌后ECL顯影。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算蛋白相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸揮發(fā)油對HCT-116細(xì)胞增殖的影響 與對照組(0 μg/mL當(dāng)歸揮發(fā)油)比較，當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量濃度為6.25～100 μg/mL時，細(xì)胞抑制率升高(P<0.01)，并呈劑量依賴性，IC50值為(52.49±4.32)μg/mL，故選擇50 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實驗，見圖1。

3.2 當(dāng)歸揮發(fā)油對HCT-116細(xì)胞克隆形成的影響 與對照組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油組HCT-116細(xì)胞克隆數(shù)減少，克隆形成率降低(P<0.01)，表明當(dāng)歸揮發(fā)油可抑制HCT-116細(xì)胞的克隆形成能力，見圖2。

3.3 當(dāng)歸揮發(fā)油對HCT-116細(xì)胞遷移的影響 與對照組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油組HCT-116細(xì)胞的遷移能力受到抑制，見圖3。

3.4 當(dāng)歸揮發(fā)油對HCT-116細(xì)胞周期的影響 與對照組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油組HCT-116細(xì)胞S期及G2期比例減少(P<0.05，P<0.01)，G1期比例增加(P<0.01)，表明當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過阻滯HCT-116細(xì)胞G1期，使細(xì)胞增殖受阻，見圖4。

3.5 當(dāng)歸揮發(fā)油對HCT-116細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油組HCT-116細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)，達(dá)到(30.13±3.61)%，見圖5。

3.6 當(dāng)歸揮發(fā)油對HCT-116細(xì)胞Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油組HCT-116細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值降低(P<0.01)，見圖6。

3.7 當(dāng)歸揮發(fā)油對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油組HCT-116細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、c-myc、cyclin D1表達(dá)均降低(P<0.01)，表明當(dāng)歸揮發(fā)油抑制結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞的作用可能與其下調(diào)細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)，見圖7。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，結(jié)直腸癌是由于邪氣侵襲、飲食不節(jié)及情志失調(diào)等因素引起的濕、熱、淤、毒淤積在體內(nèi)而形成的，因此，臨床治療主要以清熱解毒、活血化瘀、益氣健脾、利水滲濕類藥物為主[5]。當(dāng)歸具有活血化瘀的功效，其水溶性成分如當(dāng)歸多糖等已被發(fā)現(xiàn)可用于多種腫瘤的治療，本實驗主要研究其揮發(fā)油成分對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的影響。

惡性腫瘤細(xì)胞增殖速度快，且具有轉(zhuǎn)移性和侵襲性，這是其死亡率居高不下的主要原因[6]。本實驗結(jié)果顯示，6.25～100 μg/mL當(dāng)歸揮發(fā)油能夠劑量依賴性地抑制HCT-116細(xì)胞增殖，IC50值為(52.49±4.32)μg/mL，因此，選擇50 μg/mL當(dāng)歸揮發(fā)油作用于HCT-116細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞克隆、遷移等基本生物學(xué)特性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)歸揮發(fā)油能夠降低HCT-116細(xì)胞的克隆形成率，抑制其遷移能力，提示當(dāng)歸揮發(fā)油在體外能夠抑制HCT-116細(xì)胞生長，對結(jié)直腸癌細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用。

研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細(xì)胞增殖速度快主要與細(xì)胞周期調(diào)控失衡有關(guān)[7-9]，一旦細(xì)胞周期調(diào)控出現(xiàn)問題，細(xì)胞可能就會發(fā)生衰老或者凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸揮發(fā)油作用后，HCT-116細(xì)胞在G1期的比例增加，S期的細(xì)胞比例減少，細(xì)胞增殖周期阻滯于G1期，導(dǎo)致細(xì)胞DNA合成所需的mRNA和蛋白質(zhì)供給不足，影響腫瘤細(xì)胞生長。細(xì)胞周期阻滯往往伴隨著細(xì)胞凋亡，本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸揮發(fā)油能夠提高HCT-116細(xì)胞的凋亡率，降低凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值，升高cleaved-caspase-3表達(dá)，提示當(dāng)歸揮發(fā)油抑制HCT-116細(xì)胞增殖與其將細(xì)胞阻滯于G1期，誘導(dǎo)凋亡密切相關(guān)。

Wnt/β-catenin信號通路是影響細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移及凋亡的關(guān)鍵信號通路[10-11]，研究發(fā)現(xiàn)，大部分結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活密切相關(guān)[12-14]。β-catenin是Wnt信號通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Wnt信號通路被激活后，可以阻礙β-catenin的降解，使大量游離的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成異二聚體，激活下游的c-myc、clyclin D1等多種靶基因，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸揮發(fā)油能夠降低HCT-116細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路下游關(guān)鍵蛋白c-myc、clyclin D1的表達(dá)，提示當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，進(jìn)而抑制HCT-116細(xì)胞的增殖、克隆和遷移，將細(xì)胞阻滯于G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。