小檗堿通過(guò)PERK-ATF4通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的改善作用

段書(shū)眾， 于文會(huì)， 張 華， 王景福*

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北 承德 067000)

糖尿病是臨床常見(jiàn)的代謝障礙疾病，近年來(lái)發(fā)病人數(shù)不斷增長(zhǎng)，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的全球性疾病[1]。血管并發(fā)癥是糖尿病患者常見(jiàn)的一類并發(fā)癥，發(fā)病率高、危險(xiǎn)性大[2]，而血管鈣化是糖尿病發(fā)生血管并發(fā)癥的主要特征，是增加糖尿病患者心血管疾病發(fā)病率、死亡率的重要推手[3]。因此，探索糖尿病血管鈣化的潛在作用機(jī)制，并采取有效防治措施具有重要意義。目前研究認(rèn)為，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)由收縮表型轉(zhuǎn)化為成骨表型是血管鈣化形成的共同基礎(chǔ)[4]。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)-激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的經(jīng)典信號(hào)通路，通過(guò)PERK發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)ATF4表達(dá)發(fā)揮作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，ERS可能介導(dǎo)高糖引起VSMC鈣化的過(guò)程[6]。

小檗堿是廣泛存在于黃柏、黃連等傳統(tǒng)中草藥中的植物堿，具有降脂、降糖、抗炎、抗氧化等作用[7]。目前研究表明，小檗堿能緩解ERS，且其對(duì)代謝綜合征器官損害的保護(hù)作用可能與改善ERS有關(guān)[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對(duì)血小板源生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的VSMC鈣化具有抑制作用[9]。本研究將基于PERK-ATF4通路，探討小檗堿對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMC鈣化的減輕作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞 大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞VSMC(貨號(hào)FE563)購(gòu)自美國(guó)ATCC庫(kù)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，傳代3次用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 小檗堿對(duì)照品(純度≥97%，貨號(hào)B832574)購(gòu)自北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司。DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)90113)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；pcDNA、pcDNA-ATF4由上海易匯生物科技有限公司構(gòu)建；鈣離子比色法檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)XG-E98821)購(gòu)自上海西格生物科技有限公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)ALH371-QIP、GL2018-RDH)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；p-PERK抗體、PERK抗體(貨號(hào)3192、3179)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；ATF4抗體、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)抗體、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，Runx2)抗體、Osterix抗體、GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(貨號(hào)ab23760、ab75285、ab23981、ab209484、ab245356、ab7090)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器 NAPCO-8800型恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Shellab公司；Stat Fax-2100型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Awareness公司；AlphaImager Mini型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞分組及給藥 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期VSMC細(xì)胞，以每孔4.0×104個(gè)的密度接種于24孔板，分為對(duì)照組，高糖組，小檗堿低、中、高劑量組，小檗堿+pcDNA組，小檗堿+pcDNA-ATF4組。高糖組培養(yǎng)基中加35 mmol/L葡萄糖；小檗堿低、中、高劑量組加35 mmol/L葡萄糖和濃度分別為50、100、200 μmol/L的小檗堿；小檗堿+pcDNA組、小檗堿+pcDNA-ATF4組加35 mmol/L葡萄糖和200 μmol/L小檗堿，同時(shí)VSMC細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-ATF4。小檗堿高劑量組、小檗堿+pcDNA組、小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細(xì)胞培養(yǎng)48 h，RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中ATF4 mRNA表達(dá)情況，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，結(jié)果通過(guò)2-ΔΔCT法計(jì)算表示。

2.2 甲基百里香酚藍(lán)比色法檢測(cè)鈣水平 各組VSMC細(xì)胞培養(yǎng)7 d，用PBS沖洗3次，每孔加入1 mL 0.6 mol/L HCl，于37 ℃環(huán)境中脫鈣1 h，離心分離上清液，采用鈣離子比色法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清液中鈣濃度；剩余細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解30 min，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，將上清液中鈣濃度用細(xì)胞蛋白濃度加以校正，即上清液中鈣濃度/細(xì)胞蛋白濃度表示鈣相對(duì)水平。

2.3 磷酸苯二鈉法檢測(cè)ALP活性 各組VSMC細(xì)胞培養(yǎng)7 d，用PBS沖洗3次，每孔加入l mL含1% TritonX的生理鹽水，于4 ℃環(huán)境中放置24 h，超聲裂解細(xì)胞30 s，離心分離上清液，采用ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性；剩余細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解30 min，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，將上清液ALP活性用細(xì)胞蛋白濃度加以校正，即上清液中ALP活性/細(xì)胞蛋白濃度表示ALP活性。

2.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中PERK-ATF4通路及骨相關(guān)蛋白表達(dá) 各組VSMC細(xì)胞培養(yǎng)7 d，離心收集細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白表達(dá)，電泳分離目標(biāo)蛋白，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，將膜放入相應(yīng)蛋白抗體稀釋液(p-PERK抗體、PERK抗體、ATF4抗體、OPN抗體、Runx2抗體、Osterix抗體、GAPDH抗體，均1∶1 500稀釋)中4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，將膜放入用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗稀釋液(1∶3 000)中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL法顯色，曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，將目的蛋白條帶灰度值用內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值加以校正，即目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 小檗堿高劑量組與小檗堿+pcDNA組VSMC細(xì)胞中ATF4 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與小檗堿+pcDNA組比較，小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細(xì)胞中ATF4 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組VSMC細(xì)胞中ATF4 mRNA表達(dá)比較

3.2 小檗堿對(duì)VSMC細(xì)胞鈣水平的影響 與對(duì)照組比較，高糖組VSMC細(xì)胞鈣水平升高(P<0.05)；與高糖組比較，小檗堿各劑量組VSMC細(xì)胞鈣水平降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；小檗堿高劑量組與小檗堿+pcDNA組VSMC細(xì)胞鈣水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與小檗堿+pcDNA組比較，小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細(xì)胞鈣水平升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組VSMC細(xì)胞鈣水平比較

3.3 小檗堿對(duì)VSMC細(xì)胞ALP活性的影響 與對(duì)照組比較，高糖組VSMC細(xì)胞ALP活性升高(P<0.05)；與高糖組比較，小檗堿各劑量組VSMC細(xì)胞ALP活性降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；小檗堿高劑量組與小檗堿+pcDNA組VSMC細(xì)胞ALP活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與小檗堿+pcDNA組比較，小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細(xì)胞ALP活性升高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組VSMC細(xì)胞ALP活性比較

3.4 小檗堿對(duì)VSMC細(xì)胞中PERK-ATF4通路及骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，高糖組VSMC細(xì)胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與高糖組比較，小檗堿各劑量組VSMC細(xì)胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性；小檗堿高劑量組與小檗堿+pcDNA組VSMC細(xì)胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與小檗堿+pcDNA組比較，小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細(xì)胞中p-PERK/PERK蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表4。

表4 各組VSMC細(xì)胞中p-PERK、PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達(dá)比較

4 討論

血管鈣化是引起糖尿病并發(fā)心血管疾病的危險(xiǎn)因素，同時(shí)是升高疾病死亡率的重要原因[10]。VSMC是參與血管鈣化發(fā)生的主要細(xì)胞，在受到高糖、氧化應(yīng)激等刺激因素的作用后，由收縮表型向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，并分泌大量骨相關(guān)蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化發(fā)生[11]。本研究采用含高糖的培養(yǎng)液模擬糖尿病機(jī)體內(nèi)的高糖環(huán)境，發(fā)現(xiàn)高糖組VSMC細(xì)胞鈣水平、ALP活性及細(xì)胞中成骨細(xì)胞標(biāo)志物OPN、Runx2、Osterix蛋白表達(dá)均升高，提示高糖能促進(jìn)VSMC細(xì)胞中鈣離子沉積，并誘導(dǎo)VSMC細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨樣細(xì)胞，即發(fā)生鈣化。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是動(dòng)態(tài)膜性細(xì)胞器，含有大量伴侶蛋白、糖基化酶及氧化還原酶，具有蛋白質(zhì)合成、修飾、折疊、脂質(zhì)、類固醇、糖原合成及鈣儲(chǔ)存、鈣穩(wěn)態(tài)維持等多種功能[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被外界環(huán)境刺激后，會(huì)發(fā)生ERS，影響許多蛋白質(zhì)的合成過(guò)程[13]。曾蓉等[14]研究表明，過(guò)度的ERS會(huì)促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生發(fā)展。PERK-ATF4是經(jīng)典的ERS途徑，在ERS發(fā)生時(shí)，PERK解除與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的結(jié)合狀態(tài)，活化形成p-PERK，可通過(guò)將eIF2α磷酸化阻斷合成過(guò)程，同時(shí)上調(diào)ATF4表達(dá)發(fā)揮作用[15]。沈潔等[16]研究顯示，降低大鼠血糖，緩解炎性反應(yīng)，可減輕ERS并抑制PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路激活。本研究顯示，高糖組VSMC細(xì)胞中p-PERK/PERK、ATF4蛋白表達(dá)升高，提示高糖環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)VSMC細(xì)胞中PERK-ATF4通路激活，發(fā)生ERS，可能與VSMC細(xì)胞鈣化存在一定聯(lián)系。

小檗堿是中草藥提取物，在糖脂代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[17]。張勇等[18]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對(duì)果糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)PERK通路激活過(guò)程具有抑制作用。張楠等[19]研究亦表明，小檗堿對(duì)大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與抑制ERS有關(guān)。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能調(diào)節(jié)高脂肪飲食小鼠的血脂水平，減輕炎癥損傷及血管鈣化，可能在改善動(dòng)脈粥樣硬化及心血管保護(hù)中發(fā)揮作用。本研究顯示，使用不同濃度小檗堿處理高糖誘導(dǎo)的VSMC細(xì)胞，細(xì)胞中p-PERK/PERK、ATF4蛋白表達(dá)降低，同時(shí)鈣水平、ALP活性及細(xì)胞中成骨細(xì)胞標(biāo)志物OPN、Runx2、Osterix蛋白表達(dá)均降低，且均呈劑量依賴性，提示小檗堿可以抑制PERK-ATF4通路激活，并減少VSMC細(xì)胞中鈣離子沉積，減輕VSMC細(xì)胞鈣化，但小檗堿對(duì)高糖誘導(dǎo)VSMC細(xì)胞鈣化的減輕作用是否與抑制PERK-ATF4通路激活有關(guān)，尚缺乏驗(yàn)證。

為進(jìn)一步探索PERK-ATF4通路在小檗堿減輕高糖誘導(dǎo)VSMC細(xì)胞鈣化過(guò)程中發(fā)揮的作用，本研究通過(guò)向VSMC細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-ATF4上調(diào)ATF4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高糖、高濃度小檗堿處理下，上調(diào)VSMC細(xì)胞中ATF4表達(dá)后，VSMC細(xì)胞鈣水平、ALP活性及細(xì)胞中成骨細(xì)胞標(biāo)志物OPN、Runx2、Osterix蛋白表達(dá)均升高，提示PERK-ATF4通路激活與VSMC細(xì)胞鈣化有關(guān)，小檗堿可能通過(guò)抑制PERK-ATF4通路激活，對(duì)高糖誘導(dǎo)VSMC細(xì)胞鈣化起抑制作用。

綜上所述，小檗堿能減輕高糖誘導(dǎo)的VSMC細(xì)胞鈣化，其機(jī)制可能與抑制PERK-ATF4通路激活有關(guān)。