基于網絡藥理與分子對接研究4味藥食兩用中藥治療2型糖尿病的機制

褚 煜， 陳 海， 呂宏陽， 陳 艷， 王 建*

(1.成都中醫藥大學公共衛生學院，四川 成都 611137；2.成都中醫藥大學西南特色中藥資源重點實驗室，四川 成都 611137；3.西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；4.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137)

糖尿病是以胰島β細胞受損以及胰島素抵抗為主要病理特征的慢性代謝性疾病，主要分為1型糖尿病、2型糖尿病以及特殊類型糖尿病，臨床上以2型糖尿病患者居多[1]。2型糖尿病患者需要長期甚至終身用藥治療，但長期口服降糖藥物對肝腎損害較大，且隨著用藥時間的延長會出現藥物繼發性失效等問題[2]。

藥食兩用中藥具有“多成分”“多靶點”“多通路”等特點與優勢，且毒副作用小、不良反應少，適合預防與治療2型糖尿病[3]。課題組前期基于輔助降血糖保健產品藥食兩用中藥原料統計[4]以及2020年版《中國藥典》中降糖處方的數據挖掘結果，優選出4味防治2型糖尿病的藥食兩用中藥，分別為黃芪、山藥、葛根、人參，但其防治2型糖尿病的機制不明，故本文結合網絡藥理學“多成分-多靶點-多通路”的分析優勢聯合分子對接結果，對其治療2型糖尿病的可能機制進行了探討。

1 材料

藥品標準查詢數據庫(https://www.drugfuture.com/standard/)；藥理學數據庫和分析平臺(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)；人類基因數據庫(https://www.genecards.org/)；比較毒物基因數據庫(http://ctdbase.org/)；DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)；Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step)；化學數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；蛋白質數據庫(http://www1.rcsb.org/)。Spass Modeler、Cytoscape3.6.1、Autodock Vina、Pymol等軟件。

2 方法

2.1 數據挖掘 以“消渴”“消渴病”“降糖”“糖尿病”“2型糖尿病”為檢索詞，檢索2020年版《中國藥典》和藥品標準查詢數據庫，獲取降糖處方數據。Spass Modeler進行頻次、鏈接強度統計分析，導入Cytoscape繪制網絡圖，再結合糖尿病保健食品中排序前10的藥食兩用中藥[4]，取交集后優選出4味。

2.2 藥物及疾病靶點篩選 從藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)中檢索獲取黃芪、山藥、葛根、人參主要成分及作用靶點，檢索條件為生物利用度(OB)>30%，類藥性(DL)>0.18，并在蛋白質數據庫(Uniprot)中對成分作用靶點進行基因ID轉換。人類基因數據庫(GeneCards)與比較毒物基因數據庫(CTD)中檢索與2型糖尿病相關的所有疾病靶點，中位數篩選保留相關性較強的疾病靶點后合并去重，將藥物成分作用靶點與2型糖尿病相關疾病靶點取交集處理后，得到兩者共同靶點。

2.3 PPI網絡構建 在STRING數據庫中將共同靶點進行蛋白互作分析，選定物種為“人”，得到靶蛋白互作網絡(PPI)，導入Cytoscape 3.6.1軟件中，對PPI網絡進行拓撲分析，并按degree值分布排列。繪制PPI網絡圖，根據拓撲分析結果篩選核心靶點，結合TCMSP數據庫獲取的成分靶點數據，Excel統計核心靶點關聯成分，篩選得到核心成分。

2.4 功能與通路富集 基于DAVID、Metascape富集分析工具，選定物種為“人”，進行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析。

2.5 中藥-成分-靶點-通路構建 將黃芪、山藥、葛根、人參成分進行編號，成分對應靶點，核心靶點對應通路，構建網絡文件屬性文件，導入Cytoscape 3.6.1軟件，繪制成分-靶點-通路網絡圖。

2.6 分子對接 在化學數據庫(PubChem)與蛋白質數據庫(RCSB-Pdb)中檢索核心成分靶點與配體文件，采用Autodock Vina軟件對核心成分-靶點進行分子對接。

3 結果

3.1 數據挖掘 在2020年版《中國藥典》和藥品標準查詢數據庫中檢索到相關處方43首、中藥111味，統計使用頻數前20的中藥，繪制高頻中藥鏈接關系網絡圖(圖1)，鏈接強度為1～17，中藥的顏色越紅，表明其出現在處方中次數越多；不同中藥間的連線越粗，表明兩藥配伍相關性越強。由此可知，黃芪使用頻次最高，其次為天花粉、地黃、麥冬、山藥、枸杞子、五味子、知母、葛根、人參，排名前10的配伍藥對依次為黃芪-天花粉、黃芪-地黃、黃芪-山藥、黃芪-枸杞子、黃芪-葛根、黃芪-麥冬、黃芪-五味子、黃芪-黃精、黃芪-黃連、黃芪-人參。與糖尿病保健食品中排名前十的藥食兩用中藥[4]取交集后，優選出黃芪、山藥、葛根、人參。

3.2 作用靶點 在TCMSP數據庫中獲得黃芪、山藥、葛根、人參活性成分共48個，作用靶點92個；在CTD、Gene Cards數據庫中獲得糖尿病相關靶點共988個，取交集后得到共同靶點56個，成分-疾病靶點見圖2。

3.3 PPI蛋白互作圖 在Cytoscape 3.6.1中繪制PPI圖，并按照重要性排列，按照節點度值(Degree)排序，篩選得到核心靶點，節點顏色越紅、越大，表明度值越高，結果見圖3。刪除與疾病無相關性靶點，得到11個藥物-疾病關鍵靶點，分別為AKT1、PTGS2、MAPK8、IL1B、JUN、CASP3、RELA、ICAM1、STAT1、AHR、NFKBIA，核心成分為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2，具體見表1。

表1 4味藥食兩中藥核心成分

3.4 GO功能富集 統計生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC)，篩選出排名前10者，并繪制GO功能富集分析組圖，結果見圖4、表2。由此可知，生物過程主要涉及生物過程為對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、對細胞外刺激的反應等；分子功能主要涉及核基因編碼、蛋白質功能等分子功能；細胞成分主要參與胞漿、核周區、膜區等定位。

表2 GO功能富集分析結果

3.5 KEGG通路富集 主要涉及通路包括糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路等，通路氣泡富集圖見圖5，氣泡大小代表通路上富集的基因數量，氣泡越大，表明富集的基因數目越多；氣泡顏色代表-logP值，其值由大到小從紅色到藍色變化。

3.6 成分-靶點-通路構建 通過 Cytoscape 3.6.1軟件繪制中藥-成分-靶點-通路圖，結果見圖6。

3.7 分子對接驗證 將核心成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2與AKT1、PTGS2、MAPK8等核心靶點進行分子對接，當結合鍵能<-5 kcal/mol時，表明兩者對接結果良好，采用R語言繪制結合鍵能熱圖，見圖7，并用Pymol繪制分子對接模型圖，見圖8～9。

4 討論

2型糖尿病發病機制復雜，主要為胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷[5]。常見降糖藥物作用途徑單一，并伴有不同程度的副作用，如導致低血糖、乳酸性酸中毒等問題[6]。藥食兩用中藥使用安全，降血糖作用溫和持久，兼具降脂、降壓、消炎、增強免疫等多種優勢[7]，具有治療2型糖尿病的重大潛能。目前2型糖尿病與低度炎癥相關性研究逐漸增多[8]，且腸道菌群失調可能成為重要誘導2型糖尿病發生的因素。

本研究結果表明，黃芪、山藥、葛根、人參4味藥治療2型糖尿病的核心靶點為AKT1、PTGS2、MAPK8等。其中，蛋白激酶(AKT)在調節細胞存活，胰島素信號轉導起關鍵作用，AKT1與胰島β細胞損傷修復密切相關[9]；前列腺素內過氧化物合酶(PTGS)參與誘導炎癥反應和脂質堆積，能負性調節胰島素分泌，并與胰島素敏感性降低相關[10]；絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)作為JNK信號通路重要調控基因[11]，與胰島素抵抗密切相關。分子對接結果表明，槲皮素、山柰酚與PTGS2結合最穩定，β-谷甾醇、人參皂苷Rh2則與MAPK8結合最穩定，表明4味藥核心成分通過作用核心靶點，可能減輕炎癥反應，改善胰島素抵抗來治療2型糖尿病。

KEGG通路富集分析主要涉及AGE-RAGE、TNF等通路。AGE-RAGE信號通路能夠引發一系列炎癥，導致胰島細胞受損和胰島素抵抗，與2型糖尿病發生密切相關[12]。TNF通路中主要效應分子為腫瘤壞死因子α(TNF-α)，其與腫瘤壞死因子受體(TNFR)結合，可產生C-Jun氨基末端激酶(JNK)和核因子-κB(NF-κB)等，誘導炎癥反應[13]引發胰島素抵抗。

GO功能富集生物過程涉及脂多糖反應、細菌來源分子反應、細胞外刺激的反應，提示糖尿病的防治可能涉及細菌來源的分子反應，而這與腸道菌群關系密切[14]。研究表明，2型糖尿病可能與腸道菌群變化及其代謝紊亂引起的低度炎癥有關[15]。機體正常情況下，以雙歧桿菌、乳桿菌為主的益生菌占優，形成菌膜結構，來抵抗病原菌對機體的侵襲[16]。而在2型糖尿病患者腸內，會出現厚壁菌門、變形菌門增多，擬桿菌門、放線菌門減少[17]，以及雙歧桿菌和乳酸桿菌減少，腸球菌和大腸桿菌增多[18]等變化。研究表明雙歧桿菌能改善高脂飲食小鼠糖耐量，降低TNF-α，IL-6等促炎細胞因子分泌，減輕炎癥反應和胰島素抵抗程度[19]，也可抑制腸道中常見致病菌如擬桿菌等的生長和增殖[20]，發揮調節腸道菌群穩定及抗炎的作用。腸道菌群也能通過微生物代謝物，交叉影響宿主的代謝穩態，從而與2型糖尿病的發病密切相關[21]。脂多糖(LPS)主要來源于革蘭氏陰性菌細胞壁。研究發現，2型糖尿病患者腸道內革蘭氏陰性菌的比例增加，LPS分泌增多[22]，激活NF-κB通路，促進TNF-α、IL-1β、IL-6等表達[23]，以及促進JNK的激活，從而引發炎癥反應。而且已有報道這2種途徑均與胰島素抵抗以及胰島素信號轉導有關[24]。此外，2型糖尿病患者腸道內，SCFAS產生菌尤其是丁酸產生菌會減少[25]，而雙歧桿菌作為丁酸鹽產生最重要的腸道細菌之一[26]，對促進SCFAS產生、減輕炎癥以及降低胰島素抵抗有積極作用[27]。

多項研究也表明槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2均可抑制NF-κB過度活化，減少LPS誘導的TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達，發揮抗炎作用，從而改善胰島素抵抗與胰島細胞損傷[28-31]。

綜上所述，核心成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2，通過作用AKT1、PTGS2、MAPK8等多靶點，參與調控AGE-RAGE、TNF等信號通路表達，可能通過調節腸道菌群失調，改善LPS、SCFAs等代謝途徑，共同發揮減輕炎癥反應、降低胰島素抵抗以及減少胰島β細胞損傷等作用，從而對2型糖尿病起到一定的治療作用。

5 結論

本研究基于網絡藥理學與分子對接的分析結果，探討了成分-腸道菌群-炎癥反應-2型糖尿病的關系，提示4味藥食兩用中藥可能通過腸道菌群對2型糖尿病起到一定的治療作用。本研究基于大數據，借助網絡藥理學與分子對接的方法初步闡明治療2型糖尿病機制，其結果仍有待于后續藥理實驗的驗證，并且針對2型糖尿病的不同證型，在中醫辨證施治的指導下如何正確使用藥食兩用藥亦是進一步研究的方向。