LIMK1高表達通過LIMK1/cofilin1通路促進人結腸癌SW480細胞增殖、遷移與侵襲

潘志兵, 李娟, 蘇堅, 夏紅, 劉芳, 蘇琦

(1.南華大學衡陽醫學院腫瘤研究所 湖南省腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南省衡陽市 421001；2.婁底市中心醫院消化內科，湖南省婁底市 417000；3.南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院，湖南省衡陽市 421001)

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率與死亡率分別居于全球第三位與第二位[1]。由于結腸癌患者就診時大多已發生侵襲轉移，從而手術、化療、放療等療效差，死亡率高于50%[2]。因此，研究結腸癌侵襲轉移的分子機制，尋找其關鍵標記，為靶向干預治療及對結腸癌的防治具有重要意義。

LIM激酶1(LIM domain kinase 1，LIMK1)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，可通過磷酸化和失活肌動蛋白解聚因子cofilin調節肌動蛋白聚合，調控腫瘤細胞增殖、細胞周期與侵襲轉移等[3]。大量文獻表明，LIMK1在人類各種類型癌癥中異常調控，促進癌癥進展[3-8]。課題組前期工作證明，LIMK1在胃癌與結腸癌中高表達與腫瘤大小、淋巴結轉移及TNM分期有關[9-10]。本研究探討LIMK1高表達對人結腸癌SW480細胞增殖、遷移、侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

LIMK1與β-actin抗體(Abcam公司)，p-LIMK1、cofilin1、p-cofilin1(Abzoom公司)，Rac1(Millipore公司)，Pak1(Epitomics公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，RT reagent Kit、pMD18-T vector(TaKaRa公司)，PCR試劑盒(Promega公司)，DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)，真核表達質粒pIRES2-EGFP、LipofectamineTM2000、殺稻瘟菌素、oligo DNA、platinum Pfx DNA Polymerase(Invitrogen公司)，BglII、SalI、T4 DNA ligase(NEB公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)，ECL發光檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，質粒抽提試劑盒與壯觀霉素(Sigma公司)，Transwell小室(Corning公司)，Matrigel(BD公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI-1640培養基(Gibco公司)。

1.2 細胞培養及分組

人結腸癌SW480細胞系南華大學腫瘤研究所保存。培養于10%新生牛血清的RPMI-1640培養液中，37 ℃、5%CO2恒濕培養箱中傳代培養。實驗分為空載體組、SW480組、LIMK1高表達組(LIMK1/SW480組)。

1.3 構建真核表達載體

設計與合成引物序列LIMK1：F 5′-GGGGCATCATCAAGAGCA-3′，R 5′-CCAGGCAGTTGTGGGAGT-3′。將合成好的LIMK1序列裝入pMD18-T載體，再轉化至感受態細胞DH5α。BglII/SalI將TA克隆質粒酶切，37 ℃酶切2 h，酶切體系：10×buffer 5 μL，TA克隆質粒5 μL，BglII 1 μL，SalI 1 μL，ddH2O 38 μL。BglII/SalI將pIRES2-EGFP酶切，37 ℃酶切2 h，酶切體系：10×buffer 5 μL，pIRES2-EGFP 2 μL，BglII 1 μL，SalI 1 μL，ddH2O 41 μL。電泳并回收酶切的LIMK1片段。用T4 DNA ligase連接回收的片段與載體，室溫連接2 h。從每個轉化平板上分別挑取4個克隆，搖菌并抽提質粒進行測序驗證。

1.4 建立穩定高表達LIMK1基因SW480細胞

1×105/mL SW480細胞接種于6孔培養板，培養24 h后，取出6孔板，無血清RPMI-1640培養基洗滌3次，再換1.5 mL無血清Opti-MEM培養基洗滌3次，放回培養箱中。將4.0 μg的質粒DNA(pIRES2-EGFP-LIMK1真核表達載體和pIRES2-EGFP空載體)用無血清的Opti-MEM稀釋，最終體積為250 μL，并標記為A液。10 μL LipofectamineTM2000加到240 μL無血清Opti-MEM培養基中混勻，標記為B液。孵育5 min后，將A與B液混合得到C液，混勻后室溫中孵育20 min。將500 μL C液加到6孔培養板，輕輕搖勻，培養6 h，吸棄原培養液，更換為含10%胎牛血清的Opti-MEM培養液。48 h后將孔內細胞以1∶10比例傳代。培養24 h后，用含G418終質量濃度為500 mg/L的RPMI-1640完全細胞培養基繼續培養并篩選陽性克隆SW480細胞，隔天換液1次，連續培養14天后，挑取發綠色熒光的陽性克隆細胞至96孔板，待形成陽性單克隆細胞后再挑取至24孔板擴大培養，以250 mg/L G418作為維持質量濃度，反復3～4次，最后移入培養瓶培養并凍存。

1.5 RT-PCR檢測

RNA試劑盒提取細胞總RNA，AMV酶作用下反轉錄合成cDNA。PCR引物序列：LIMK1：F 5′-GGGGCATCATCAAGAGCA-3′，R 5′-CCAGGCAGTTGTGGGAGT-3′，138 bp；β-actin：F 5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3′，R 5′-TGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3′，367 bp。PCR反應條件：94 ℃，5 min；94 ℃，40 s；52.3 ℃，45 s；72 ℃ 80 s，28個循環；72 ℃ 10 min。5 μL的PCR產物經1%的瓊脂糖電泳，嗅化乙啶染色，IS1000圖像分析軟件讀取條帶灰度值。

1.6 Western blotting

收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定。每組取等量樣本進行凝膠電泳，電泳后轉膜，封閉1 h，加一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，采用ECL發光法，最后X片曝光、顯影、定影。

1.7 MTT檢測

取對數生長期SW480細胞，接種到96孔板，每組設置6個復孔；細胞貼壁4～6 h后，更換細胞培養基為150 μL RPMI-1640完全細胞培養基，再加入20 μL 5 g/L MTT溶液，培養4 h；吸棄上清液，加入150 μL DMSO溶液；搖床上平搖10～15 min，酶聯免疫檢測儀測量各孔在570 nm處光密度值(OD)。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD570/對照組OD570 nm)×100%。

1.8 流式細胞術檢測

取對數生長期SW480細胞，4 ℃預冷PBS液重懸細胞，800 r/min離心5 min，加入4 ℃預冷70%乙醇固定。檢測前，將固定的細胞800 r/min離心5 min，預冷PBS液洗滌1次，加入RNA酶50 μL，37 ℃水浴30 min，然后加1 g/L碘化丙啶50 μL，避光振蕩混勻，4 ℃放置30 min，300目尼龍網濾過，上機檢測，進行細胞周期分析。

1.9 劃痕實驗

調整細胞為1×106/mL，吸1 mL細胞懸液接種于6孔板，每組3個平行樣本。RPMI 1640培養液37 ℃、5%CO2培養，直至形成細胞單層。用Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，無血清培養液洗細胞3次，加新鮮無血清培養基。顯微鏡下測量劃痕區相對距離，實驗重復3次。

1.10 侵襲實驗

將基質膠稀釋液鋪置在Transwell小室中，放置成膜。100 μL細胞稀釋液接種至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培養液添加至下腔，小室放置在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養36 h后取出，擦棄小室上層細胞并用4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶祡染色。顯微鏡下隨機選取4個高倍視野進行細胞計數，取平均值。每組細胞設3個復孔，實驗重復3次。

1.11 統計學分析

2 結 果

2.1 LIMK1高表達SW480穩定細胞系構建

LIMK1基因cDNA序列與真核表達載體pIRES2-EGFP連接，獲得pIRES2-EGFP-LIMK1重組真核表達載體，取部分質粒進行BglII和SalI雙酶切鑒定(圖1A)。抽提質粒后進行測序，插入序列與LIMK1全長cDNA的GenBank序列完全一致，表明LIMK1全長cDNA已經成功連接到pIRES2-EGFP載體上。將重組質粒轉染SW480細胞24 h后，倒置熒光顯微鏡可見綠色熒光。加入G418(500 mg/L)篩選14天后，可見陽性克隆細胞(圖1B)，挑選克隆細胞加G418繼續培養(圖1C)。

轉染空載體的SW480細胞LIMK1 mRNA和蛋白表達與SW480細胞均無明顯差異(P>0.05)。LIMK1真核表達載體轉染SW480細胞后，LIMK1 mRNA和蛋白表達均明顯增加(P<0.05)，表明成功構建穩定高表達LIMK1基因的SW480細胞(圖1D和E)。

圖1 LIMK1高表達SW480細胞的構建

2.2 LIMK1高表達對SW480細胞增殖、細胞周期的影響

LIMK1/SW480組細胞增殖能力高于SW480組和空載體組(P<0.05;圖2A)，提示LIMK1高表達對SW480細胞增殖具有促進作用。

LIMK1/SW480組G2/M期細胞百分率較SW480組和空載體組明顯降低(P<0.05)。表明LIMK1高表達可抑制SW480細胞G2/M期阻滯作用(圖2B、C、D)。

圖2 LIMK1高表達對SW480細胞增殖和細胞周期的影響

2.3 LIMK1高表達對SW480細胞遷移能力影響

0 h時，各組遷移距離基本相同。劃痕24 h后，LIMK1/SW480組瘢痕距離[(12.6±0.73)μm]明顯低于SW480組[(36.0±0.50)μm]和空載體組[(37.8±0.63)μm](P<0.05)。表明LIMK1高表達可促進SW480細胞遷移(圖3)。

圖3 LIMK1高表達對SW480細胞遷移的影響

2.4 LIMK1高表達對SW480細胞侵襲能力的影響

LIMK1/SW480組穿膜細胞數(174±6.95)明顯多于SW480組(102±9.94)和空載體組(99±8.28)，差異有顯著性(P<0.05)。表明LIMK1高表達可促進SW480細胞侵襲(圖4)。

圖4 LIMK1高表達對SW480細胞侵襲的影響(結晶紫染色，40×)

2.5 LIMK1高表達對SW480細胞LIMK1/cofilin1通路的影響

LIMK1/SW480組LIMK1、p-LIMK1、cofilin1較空載體組與SW480細胞組表達上調(P<0.05；圖5)。表明LIMK1高表達可上調LIMK1，促進LIMK1與cofilin1的磷酸化。

圖5 LIMK1高表達對SW480細胞通路影響

3 討 論

LIMK1在多種腫瘤中高表達與遷移侵襲有關。在一項臨床隊列研究中，高水平的LIMK1患者顯示出明顯較低的總生存率和較大的淋巴結轉移潛力[3]。在結直腸癌組織中，LIMK1高表達與腫瘤轉移和患者預后不良密切相關。上調LIMK1可促進上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)與激活PI3K/Akt通路，增加增殖和遷移與移植瘤的生長和轉移，而沉默LIMK1效果相反[4]。肺腺癌組織中LIMK1高表達與淋巴結轉移、TNM分期和不良預后相關，表明LIMK1可以作為肺腺癌不良預后的生物標志物和潛在的治療靶點[5]。前列腺癌LIMK1表達明顯高于良性前列腺增生。LIMK1上調與前列腺體積、PSA及其抗原密度、Gleason評分、T分期、淋巴結轉移、囊外擴展和精囊侵襲、手術邊緣陽性密切相關。分析顯示，LIMK1是前列腺癌轉移、復發與生存縮短的獨立危險因素[6]。LIMK1在胃癌中高表達，并且胃癌腹膜轉移較原發性胃癌中LIMK1表達增加，敲除LIMK1可下調p-cofilin顯著抑制胃癌細胞的遷移和侵襲以及消除裸鼠體內胃癌細胞的腹膜和肝轉移[7]。

LIMK1/cofilin1通路在調控腫瘤細胞增殖和侵襲轉移中起著重要作用。在骨肉瘤組織和細胞中PAK4、LIMK1和cofilin-1均高表達，并與臨床分期、遠處轉移和腫瘤分級相關。沉默PAK4可通過降低LIMK1/cofilin-1通路的活性抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移與裸鼠移植瘤生長[8]。SphK2與S1P可通過激活PAK1/LIMK1/cofilin1信號通路促進三陰性乳腺癌轉移[11]。LncRNA DANCR在肝癌中高表達，與增殖和轉移相關，并且DANCR可通過誘導miR-27a-3p調控ROCK1/LIMK1/cofilin1通路，促進肝癌的發展，誘導EMT[12]。在胰腺癌中發現LINC00941和ROCK1高表達，而miR-335-5p低表達。沉默LINC00941可抑制胰腺癌細胞生長、轉移和EMT。LINC00941作為miR-335-5p的分子海綿和ROCK1的ceRNA，可促進ROCK1上調和激活LIMK1/cofilin-1通路[13]。

本研究結果顯示，采用真核表達載體轉染技術成功構建高表達LIMK1基因的SW480細胞，LIMK1高表達可通過LIMK1/cofilin1通路上調LIMK1和激活LIMK1與cofilin1促進SW480細胞增殖與遷移侵襲。因此，LIMK1可能是診治結腸癌的靶點。

目前，靶向LIMK1的有效抑制劑和小分子化合物的研發成為抗腫瘤治療的新途徑。研究發現，土木香內酯(ATL)通過靶向抑制LIMK酶活性激活cofilin，從而上調Gactin/Factin比值，抑制惡性膠質瘤細胞遷移和侵襲[14]。Dasatinib可直接靶向LIMK1下調p-LIMK1和p-cofilin，抑制cyclin D1、D3和CDK2表達，阻滯細胞在G1期，增加Caspase-3和Caspase-7表達誘導細胞凋亡，抑制高表達LIMK1的SCID小鼠移植瘤生長，表明Dasatinib是一種治療肺癌的新型LIMK1抑制劑[15]。Luteolin靶向LIMK1下調LIMK1通路相關靶點p-LIMK和p-cofilin，增加Caspase-3水平，降低cyclin D1表達，誘導細胞凋亡和阻滯細胞在G1期。此外，Luteolin通過降低體內Ki-67、p-LIMK和p-cofilin的表達抑制移植瘤的生長[16]。

課題組前期工作證實，LIMK1在結腸癌高表達與腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期顯著相關[10]。大蒜的有效成分二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)可下調LIMK1抑制結腸癌細胞遷移與侵襲，沉默LIMK1可增強DADS抑制作用[17-19]。蛋白質組學技術鑒定發現LIMK1是DADS作用人胃癌細胞的潛在靶點[20]。同時證明，DADS通過下調LIMK1抑制人胃癌細胞EMT與侵襲，而沉默LIMK1抑制人胃癌細胞遷移與侵襲[9,21]。然而，DADS是否可阻斷LIMK1/cofilin通路抑制結腸癌細胞遷移侵襲，尚待進一步研究。