Ⅰ型膠原及骨膜蛋白在骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞膜片中的表達(dá)研究＊

李麗生 何夢(mèng)嬌 駱凱 何武兵

當(dāng)前，我國(guó)中老年人骨質(zhì)疏松問(wèn)題嚴(yán)重，其中以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMO）最為常見(jiàn)[1]。PMO通常是由于絕經(jīng)后卵巢功能衰退，雌激素水平下降，從而導(dǎo)致的一種低骨量性疾病，骨脆性增加，在沒(méi)有創(chuàng)傷外力作用的情況下亦會(huì)發(fā)生嚴(yán)重骨折，嚴(yán)重危害中老年人的身體健康，同時(shí)也給社會(huì)帶來(lái)了一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，PMO的防治至關(guān)重要。在骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）研究中，細(xì)胞療法作為一種全新的治療方法近幾年被廣泛研究，當(dāng)前的主要研究熱點(diǎn)之一是以間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）為主的細(xì)胞療法。與傳統(tǒng)的酶消化法相比，細(xì)胞膜片技術(shù)（cell sheet technology，CST）可以無(wú)創(chuàng)性獲取種子細(xì)胞，同時(shí)還保留完整的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、細(xì)胞間連接及細(xì)胞表面相關(guān)蛋白[2]。因此，與傳統(tǒng)的組織工程相比，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cell，BMSC）膜片在骨和軟骨組織工程中具有良好的應(yīng)用前景[3]。本研究通過(guò)L-抗壞血酸誘導(dǎo)構(gòu)建不同時(shí)間點(diǎn)的PMO大鼠BMSC膜片，并檢測(cè)其ECM中的Ⅰ型膠原（collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ）及骨膜蛋白（periostin，POSTN）的表達(dá)，為骨質(zhì)疏松狀態(tài)下骨組織再生尋找新的途徑與技術(shù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2017年1月-2018年12月，20只SPF級(jí)3月齡雌性未孕SD大鼠，體重250～280 g，由上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2016-0006。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（FBS；澳大利亞Wisent公司），蘇木精、伊紅、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松（美國(guó)Sigma公司）；成脂誘導(dǎo)分化試劑盒（中國(guó) Cyagen 生物），Trizol Reagent（美國(guó) Invitrogen公 司 ）；SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）（日本Takara公司），兔抗大鼠Col-Ⅰ多克隆抗體、兔抗大鼠POSTN多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），Masson三色染色試劑盒、即用型免疫組化EliVisionTM plus試劑盒、DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG（中國(guó)Biosharp公司）；倒置熒光顯微鏡（IX-71，日本Olympus公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler480，瑞士Roche公司）。

1.2 方法

1.2.1 PMO大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng) 采用去勢(shì)法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，術(shù)后12周體外分離培養(yǎng)PMO大鼠BMSCs。腹腔注射麻醉下取出大鼠下肢管狀長(zhǎng)骨，反復(fù)沖洗收集骨髓腔沖洗液，室溫下 1 000 r/min 離心 5 min，DMEM 低糖培養(yǎng)液（含10% FBS、青霉素 100 U/ml、鏈霉素 100 μg/ml）重懸并吹打混勻、常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 PMO大鼠BMSCs的鑒定 原代BMSCs細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿，12 d后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，并進(jìn)行細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)、拍照。第3代BMSCs按5×104/個(gè)孔接種于12孔板，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，分別更換為成骨誘導(dǎo)液及成脂誘導(dǎo)液。成骨誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色，21 d后采用茜素紅染色（alizarin red，AR）觀察礦化結(jié)節(jié)；成脂誘導(dǎo)21 d后成脂誘導(dǎo)組采用油紅O染色觀察脂滴。

1.2.3 PMO大鼠BMSC膜片的體外構(gòu)建 第3代BMSCs按5×104/孔密度接種于12孔板，待細(xì)胞融合至 70%～80% 時(shí)，更換為含 50 μg/ml L- 抗壞血酸的培養(yǎng)液，每3天更換培養(yǎng)液，誘導(dǎo)10 d形成細(xì)胞膜片。

1.2.4 PMO大鼠BMSC膜片的組織學(xué)觀察 L-抗壞血酸連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5、10 d刮取細(xì)胞膜片。固定，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，連續(xù)切片，備用。蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及Masson染色觀察5、10 d的細(xì)胞膜片結(jié)構(gòu)，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ及POSTN基因表達(dá)檢測(cè) 第3代BMSCs按5×104/孔密度接種于12孔板，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，更換為含50 μg/ml L-抗壞血酸的培養(yǎng)液，分別于誘導(dǎo)的第5、10天按試劑盒說(shuō)明書提取兩組細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Col-Ⅰ和POSTN的表達(dá)，用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列，見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ及POSTN蛋白表達(dá)檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化，滴加3%過(guò)氧化氫后，滴加兔抗鼠Col-Ⅰ（1∶500）、兔抗鼠POSTN（1∶900），陰性對(duì)照組加 PBS，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜，辣根酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物試劑37 ℃孵育20 min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水，透明、中性樹膠封固。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMO大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)

原代培養(yǎng)（P0）3 d，顯微鏡下可見(jiàn)光亮的圓形細(xì)胞下散在的少量梭形細(xì)胞貼壁，見(jiàn)圖1A；P0培養(yǎng)7 d，梭形細(xì)胞快速生長(zhǎng)，纖維集落樣排列；P0培養(yǎng)12～14 d，相鄰集落達(dá)到80%融合并進(jìn)行傳代，見(jiàn)圖1B。傳代培養(yǎng)后第三代（P3）細(xì)胞增殖加速，形狀為多角形或梭形，見(jiàn)圖1C。

2.2 PMO大鼠BMSCs的鑒定

第1代細(xì)胞接種培養(yǎng)12 d左右，結(jié)晶紫染色后，肉眼觀察到紫色克隆集落，顯微鏡下見(jiàn)單細(xì)胞形成的克隆呈集落生長(zhǎng)，見(jiàn)圖2A、B。成骨誘導(dǎo)第7天，ALP染色后胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)深藍(lán)色物質(zhì)（不溶性），見(jiàn)圖2C。成骨誘導(dǎo)第21天，AR染色可見(jiàn)紅染的礦化結(jié)節(jié)大小不一，見(jiàn)圖2D。成脂誘導(dǎo)第21天，空泡樣脂滴采用油紅O染色后被染成橘紅色，見(jiàn)圖2E。

2.3 PMO大鼠BMSC膜片的大體觀察

經(jīng)L-抗壞血酸連續(xù)誘導(dǎo)10 d左右，細(xì)胞膜片的邊緣開(kāi)始皺縮卷曲，孔板底部可見(jiàn)一乳白色半透明的膜狀結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3A；從卷曲處小心刮起，漂浮于PBS中，見(jiàn)圖3B；完整刮起后細(xì)胞膜片明顯收縮，色呈乳白色，微薄磨玻璃樣半透明結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3C，可塑性較強(qiáng)。

2.4 PMO大鼠BMSC膜片的組織學(xué)觀察

細(xì)胞膜片HE染色結(jié)果顯示，第10天形成的細(xì)胞膜片厚度增加，細(xì)胞層數(shù)增多，ECM厚度也由第5天的20 μm左右增厚至50 μm左右。Masson染色結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，細(xì)胞間藍(lán)色膠原纖維明顯增多，見(jiàn)圖4。

2.5 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ及POSTN基因表達(dá)檢測(cè)

誘導(dǎo)第10天細(xì)胞膜片的ECM相關(guān)基因Col-Ⅰ及POSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于第5天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ、POSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 PMO大鼠BMSC膜片Col-Ⅰ、POSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：qPCR實(shí)驗(yàn)中，采用5只骨質(zhì)疏松大鼠，每只大鼠分離培養(yǎng)的BMSCs分別誘導(dǎo)形成5 d細(xì)胞膜片組、10 d細(xì)胞膜片組，兩分組各得到5組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

組別 Col-ⅠmRNA相對(duì)表達(dá)量POSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量第5天細(xì)胞膜片組（n=5） 1.04±0.36 0.98±0.08第10天細(xì)胞膜片組（n=5） 1.81±0.26 2.07±0.08 t值 5.100 15.971 P值 0.007 ＜0.001

2.6 PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片Col-Ⅰ及POSTN蛋白表達(dá)檢測(cè)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，第5天左右刮取的細(xì)胞膜片厚度較薄，但仍有表達(dá)Col-Ⅰ和POSTN。而誘導(dǎo)第10天刮取的細(xì)胞膜片，與第5天組相比，強(qiáng)表達(dá)ECM相關(guān)蛋白Col-Ⅰ和POSTN，并且厚度增厚，連續(xù)性較為完整，見(jiàn)圖5。

3 討論

OP是由諸多病因引起的以骨密度及骨量減少、骨小梁結(jié)構(gòu)破壞為特征的骨代謝疾病，常引起橈骨遠(yuǎn)端、肱骨近端、脊椎體、股骨頸骨折，嚴(yán)重影響中老年人，特別是中老年絕經(jīng)后女性的生活質(zhì)量[4]。PMO主要是由絕經(jīng)后雌激素缺乏引起的骨代謝失調(diào)，破骨細(xì)胞的骨吸收大于成骨細(xì)胞的骨形成作用。目前，PMO治療多采用抗骨吸收藥物（如雙磷酸鹽）和促進(jìn)鈣鹽沉積（如鮭魚降鈣素）改善和緩解PMO的癥狀，但藥物的不良反應(yīng)（如胃腸道、心血管方面的副作用）和其本身并不能促進(jìn)骨量再生的局限性限制了其在臨床上的應(yīng)用[5]。因此尋找PMO治療的新方法，促進(jìn)骨組織再生成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。

MSCs具有自我增殖、多向分化能力，已有相關(guān)研究證實(shí)其與OP的進(jìn)展密切相關(guān)。近幾十年來(lái)，MSCs廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)研究中，為骨和關(guān)節(jié)疾病的治療提供新的方法和思路。MSCs在OP治療中應(yīng)用前景廣泛。伴隨機(jī)體的衰老，人體中的BMSCs含量降低，成脂分化大于成骨分化，加速OP的進(jìn)展[6]。多項(xiàng)研究表明，BMSCs移植可能是預(yù)防或治療雌激素缺乏和老年性骨質(zhì)疏松癥的可行方法[7-9]。本研究獲取的PMO大鼠BMSCs具有增殖、克隆形成及成骨、成脂分化能力，可作為種子細(xì)胞應(yīng)用于后續(xù)的研究中。

細(xì)胞膜片是一種富含ECM的細(xì)胞片狀聚集，保留了內(nèi)源性ECM、受體和黏附蛋白，增強(qiáng)了細(xì)胞的活力和交流，允許自發(fā)地黏附到生物材料和生物表面[10]。當(dāng)前，構(gòu)建細(xì)胞膜片的方法有：溫度反應(yīng)系統(tǒng)、磁反應(yīng)系統(tǒng)、機(jī)械系統(tǒng)、光反應(yīng)系統(tǒng)等[2]。其中，溫度反應(yīng)系統(tǒng)和機(jī)械系統(tǒng)是骨和軟骨再生中制備細(xì)胞膜片應(yīng)用最廣泛的方法。機(jī)械系統(tǒng)通過(guò)添加 L-抗壞血酸刺激細(xì)胞分泌大量的ECM，連續(xù)培養(yǎng)從而形成細(xì)胞膜片，是制備細(xì)胞膜片最簡(jiǎn)單的方法[11]。在骨和軟骨組織工程中，BMSC細(xì)胞膜片被廣泛研究，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。Ma等[12]將機(jī)械法制備的兔BMSC細(xì)胞膜片移植到裸鼠皮下，結(jié)果顯示BMSC細(xì)胞膜片無(wú)須支架材料也具有異位成骨的潛能。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)機(jī)械法制備成骨誘導(dǎo)后的BMSC細(xì)胞膜片可促進(jìn)骨缺損部位的骨再生[13]。骨折愈合包括最初的炎癥反應(yīng)，隨后的骨痂形成以及最后的骨骼改建，最終恢復(fù)骨的結(jié)構(gòu)與功能。然而，在某些情況下，由于復(fù)雜的因素，如生物或機(jī)械環(huán)境的破壞，可能會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)生長(zhǎng)緩慢乃至不生長(zhǎng)的情況。一系列研究表明BMSC成骨誘導(dǎo)細(xì)胞膜片可增強(qiáng)骨折部位的骨形成，改善骨愈合延遲，并形成穩(wěn)定的新生骨[14-15]。此外，由于細(xì)胞膜片可操作性不佳，無(wú)法起到骨支撐作用，因此，可以通過(guò)在支架材料上復(fù)合細(xì)胞膜片來(lái)修復(fù)骨缺損，發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)。BMSC細(xì)胞膜片包裹多孔的磷酸三鈣β-TCP/Col-Ⅰ復(fù)合支架，經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后植入裸鼠體內(nèi)，表現(xiàn)出良好的成骨能力[16]。除了β-TCP支架外，聚（癸二?；视王ィ≒SeD）及聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）復(fù)合細(xì)胞膜片亦可促進(jìn)骨缺損部位的骨再生[17-18]。

目前細(xì)胞膜片技術(shù)在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下骨組織修復(fù)與再生的相關(guān)研究較少，本研究采用機(jī)械系統(tǒng)制備PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片，無(wú)須特定的培養(yǎng)基質(zhì)或技術(shù)，連續(xù)誘導(dǎo)10 d左右即可用細(xì)胞刮刀刮取完整的細(xì)胞膜片，所獲得的細(xì)胞膜片可塑性良好。HE、Masson染色結(jié)果提示誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞膜片中細(xì)胞層數(shù)增加，ECM增多，膜片增厚。

ECM是一種動(dòng)態(tài)變化的微環(huán)境，是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間質(zhì)中的大分子所構(gòu)成的非細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)，在為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持及附著位點(diǎn)和調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能中均有優(yōu)勢(shì)，參與組織的修復(fù)和再生。膠原蛋白是ECM的主要結(jié)構(gòu)成分，其中最豐富的膠原蛋白類型是Ⅰ型，Col-Ⅰ是皮膚、骨骼運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)相關(guān)組織完整性的主要構(gòu)架成分，同時(shí)參與細(xì)胞增殖、分化、信號(hào)傳遞等功能[19]。POSTN是一種分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，通過(guò)胞膜受體調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、增殖及分化，參與ECM組裝。POSTN調(diào)節(jié)ECM的交聯(lián)和穩(wěn)定，包括膠原蛋白的纖維化，為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（Col-Ⅰ、纖維連接蛋白、腱糖蛋白-C和層粘連蛋白γ2）和輔助蛋白（骨形成蛋白-1和CCN3）的組裝提供支架，是ECM復(fù)雜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[20]。POSTN可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)Cbfa-1和RANKL表達(dá)，調(diào)節(jié)骨代謝平衡[21]。本研究從基因及蛋白水平檢測(cè)PMO大鼠BMSC膜片不同時(shí)間點(diǎn)Col-Ⅰ、POSTN的分泌情況，結(jié)果提示骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的BMSCs仍然具有較強(qiáng)的細(xì)胞功能，保留的分泌ECM能力使形成的細(xì)胞膜片可塑性較強(qiáng)，生物學(xué)功能穩(wěn)定，自身分泌的ECM是骨組織再生和修復(fù)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和天然支架，為自體移植促進(jìn)骨質(zhì)疏松狀態(tài)下骨組織再生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，本研究構(gòu)建的PMO大鼠BMSC細(xì)胞膜片可保留自身分泌的ECM，為后續(xù)自體移植細(xì)胞膜片實(shí)現(xiàn)骨質(zhì)疏松狀態(tài)下骨組織再生提供幫助，但是其物理性能、體內(nèi)成骨能力及骨再生作用機(jī)制有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)探討。