中草藥提取復(fù)合物對乳鴿腸道微生物、生產(chǎn)性能和免疫器官指數(shù)的影響

陳志炫，陳蕙如，陳丹心，林友鈞

（1.泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 泉州 362212；2.泉州市本草賦醫(yī)藥科技有限公司，福建 泉州 362104）

0 引言

【研究意義】從2020年7月1日起，我國全面禁止了含有促生長類藥物（除中藥類外）的飼料添加劑，因此尋找有效的替代抗生素的產(chǎn)品成為科研人員的重點研究方向。中草藥的應(yīng)用在我國有著悠久的歷史，從中草藥中尋找替代抗生素的產(chǎn)品成為研究熱點[1]。【前人研究進展】桃金娘是中國南方地區(qū)民間傳統(tǒng)常用中草藥，以“通經(jīng)活血，收斂止血”的功效收載于《獸藥國家標準（化學(xué)藥品、中藥卷）第一冊》中，但對于桃金娘在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究處于初始階段，尤其是獸藥新產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用尚未起步[2]。有研究表明，桃金娘烯醇對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細菌有很好的抑制作用[2-3]，但將其作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽中卻少有報道。三辛酸甘油酯[4-5]、薄荷醇[6-8]和樟腦[9-10]，這三者也都具有很好的抗菌活性，并在豬、雞、日本鵪鶉等畜禽的應(yīng)用上顯示出對提高飼料利用率和生長性能以及改善腸道菌群具有一定的效果。【本研究切入點】和桃金娘烯醇一樣，肉豆蔻酸異丙酯也具有很好的抗菌活性[11]，但卻少有報道將肉豆蔻酸異丙酯作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽中。在已有報道的關(guān)于替代抗生素產(chǎn)品的研究中，大多是以雞、鴨、豬等畜禽作為實驗動物[1,12-13]，而較少以鴿子作為試驗動物的報道。在前期研究中，根據(jù)中藥方劑“君臣佐使”的配伍理論，我們提取了以桃金娘為主藥，配以薄荷、沒藥等中草藥的有效成分。通過體外抑菌試驗確定所篩選出的中草藥復(fù)方提取物的抑菌效果，接著對有良好抑菌效果的中草藥復(fù)方提取物進行GC-MS分析化合物組成，最后確定了一個以三辛酸甘油酯、桃金娘烯醇、肉豆蔻酸異丙酯、薄荷醇和樟腦為主要成分的復(fù)合物（命名為復(fù)合物T）。復(fù)合物T作為一個替代抗生素的新產(chǎn)品還需要通過體內(nèi)外的試驗來進一步驗證。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用乳鴿為晚成雛需要親鴿子哺育的特性，以10日齡白卡奴乳鴿作為試驗動物，通過人工灌喂的方式進行喂養(yǎng)至30日齡，以期為替代抗生素產(chǎn)品的研究工作提供新的試驗動物模型。同時，通過進一步的體外抑菌試驗和應(yīng)用于乳鴿的養(yǎng)殖試驗，以驗證復(fù)合物T作為替代抗生素備選產(chǎn)品的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

復(fù)合物T的組成成分為三辛酸甘油酯11%、桃金娘烯醇3.5%、肉豆蔻酸異丙酯11%、薄荷醇8%、樟腦6.5%，酒精為介質(zhì)，占60%。其中，三辛酸甘油酯、肉豆蔻酸異丙酯、薄荷醇和樟腦均購自上海麥克林生化科技有限公司，桃金娘烯醇購自上海源葉生物科技有限公司，酒精購自西隴科學(xué)股份有限公司。大腸桿菌（Escherchia coli）菌種編號為ATCC8739，購自上海魯微科技有限公司。

1.2 不同用量復(fù)合物T對大腸桿菌抑制率的測定

采用液體培養(yǎng)基抑制測定法，將培養(yǎng)好的大腸桿菌菌液10 μL和LB液體培養(yǎng)基180 μL加入96孔板的試驗孔中，置于TECAN Infinite 200 PRO多功能酶標儀中進行37 ℃孵育培養(yǎng)，在OD600達到0.5時，分別加入10 μL的體積分數(shù)分別為20.000 0%，10.000 0%，5.000 0%，2.500 0%，1.250 0%，0.625 0%，0.312 5%，0.156 3%的復(fù)合物T和質(zhì)量濃度為2 000 mg·L-1，1 000 mg·L-1的氨芐西林溶液。試驗組復(fù)合物T的體積分數(shù)以二倍稀釋法，分別為1.000 0%，0.500 0%，0.250 0%，0.125 0%，0.062 5%，0.031 3%，0.015 6%和0.007 8%，各試驗組分別記為C1、C1/2、C1/4、C1/8、C1/16、C1/32、C1/64、C1/128；陽性對照組氨芐西林質(zhì)量濃度則為 100 mg·L-1，50 mg·L-1，分別記為AMP100，AMP50。同時設(shè)定一組無添加的陰性對照組。每組8個重復(fù)。在添加復(fù)合物T或氨芐西林后的1、2、3、4、6、8、12、16、20、24 h分別測定OD600，并計算抑制率及12 h和24 h的半抑制濃度（IC50）。

試驗組抑制率/%=（1-試驗組OD600值/陰性對照組OD600平均值）×100；

陽性對照組抑制率/%=（1-陽性對照組OD600值/陰性對照組OD600平均值）×100

1.3 乳鴿養(yǎng)殖試驗設(shè)計

隨機選取健康、體重均勻的，由親鴿哺育至10日齡的白卡奴乳鴿180只，稱取每只乳鴿的體重（BW），保證各處理初始體重?zé)o顯著差異(P＞0.05) ，乳鴿采購自福建集盛鴿業(yè)股份有限公司。將乳鴿隨機分為 3 組，每組 5 個重復(fù)，每個重復(fù) 12只乳鴿。其中處理1為對照組（CT組），飼喂基礎(chǔ)飼糧；處理2為試驗T1組，飼喂基礎(chǔ)飼糧添加313 mg·kg-1復(fù)合物T；處理3為試驗T2組，飼喂基礎(chǔ)飼糧添加625 mg·kg-1復(fù)合物T。基礎(chǔ)飼糧為參照NRC（1994）營養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。所有乳鴿采用人工灌喂的方式進行飼喂，飼養(yǎng)至30日齡，灌喂前先將飼料與水按1∶2的比例混合成粥樣，人工灌喂養(yǎng)殖標準見表2。飼養(yǎng)過程中，確保乳鴿可自由飲水，并保證鴿舍通風(fēng)良好，光照、溫度和濕度按種鴿養(yǎng)殖標準進行操作。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Nutritional composition of basal diet (air-dry basis)%

表2 試驗乳鴿人工灌喂養(yǎng)殖標準Table 2 Standard for introgastric oral feeding squabs

1.4 檢測指標和方法

1.4.1 腸道微生物的測定 第30日齡，每個重復(fù)分別采集新鮮糞便，參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》進行腸道微生物菌群的培養(yǎng)和菌落總數(shù)的測定。其中，大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基進行37 ℃有氧培養(yǎng)，雙歧桿菌和乳酸菌分別用TPY培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基進行37 ℃厭氧培養(yǎng)。麥康凱培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基均采購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，TPY培養(yǎng)基采購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。數(shù)據(jù)結(jié)果以lgCFU·g-1為單位。

1.4.2 生長性能的測定 第30日齡時，空腹12 h后逐只稱取各乳鴿的體重，計算乳鴿試驗期間所增長的體重，再結(jié)合乳鴿灌喂養(yǎng)殖標準計算平均日增重和料重比。同時，記錄每天乳鴿的死亡數(shù)，計算存活率。

1.4.3 免疫器官指數(shù)的測定 第30日齡，每重復(fù)隨機抽取 3只體重相近的乳鴿進行屠宰，分別取脾臟、胸腺、法氏囊，并剔除附著的組織用濾紙吸干血水后稱鮮重，并參照高玉云等[14]的方法計算免疫器官指數(shù)。

1.4.4 屠宰性能的測定 根據(jù)NY/T 823—2020《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量計算方法》規(guī)定的方法，測定屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腹脂率、胸肌率、腿肌率。

1.4.5 肉品質(zhì)的測定 根據(jù)NY/T 2793—2015《肉的食用品質(zhì)客觀評價方法》規(guī)定的方法測定左側(cè)胸肌 45 min 的pH（pH45min）和 24 h的pH（pH24h）、失水率和剪切力，其中，失水率采用蒸煮損失來衡量。測定儀器為德國DOSTMANN PH5肉類食品酸度計和C-LM 3B數(shù)顯式肌肉嫩度儀。

1.4.6 血清生化指標的測定 在屠宰前，用真空采血管進行翅靜脈采血5 mL，傾斜靜置，待血清滲出后，-4 ℃ 和 3 000 r·min-1條件下離心 15 min，取上清液，分裝于EP 管中，置于-80 ℃ 凍存。谷草轉(zhuǎn)氨酶活性和尿酸含量的測定采用購自北京盒子生工科技有限公司的試劑盒，血清肌酐含量和尿素氮含量的測定采用購自上海晶抗生物工程有限公司的試劑盒，測定儀器為瑞士TECAN Infinite 200 PRO多功能酶標儀。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件中的ANOVA過程進行單因子方差分析，使用 Duncan 氏法進行多重比較，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同用量復(fù)合物T對大腸桿菌的抑制率

如表3所示，體積分數(shù)為1.000 0%、0.500 0%、0.250 0%、0.125 0%和0.062 5%的復(fù)合物T對大腸桿菌的抑制率均顯著高于其他各組；從體積分數(shù)為0.062 5%開始，復(fù)合物T對大腸桿菌的抑制率隨著體積分數(shù)的減少而顯著下降；在12 h，體積分數(shù)為0.062 5%及以上的復(fù)合物T與AMP100對大腸桿菌的抑制率均沒有顯著性差異（P＞0.05），并且均顯著高于AMP50（P＜0.05）；在 24 h，除了體積分數(shù) 0.015 6% 和0.007 8%，其他體積分數(shù)的復(fù)合物T對大腸桿菌的抑制率都顯著高于兩個抗生素對照組（P＜0.05）。

表3 不同用量復(fù)合物T對大腸桿菌的抑制率Table 3 Inhibition on E.coli by Compound T in different concentrations %

在12 h和24 h，復(fù)合物T對大腸桿菌的IC50的計算值分別為0.063 2%和0.042 6%。根據(jù)上述結(jié)果，在后續(xù)的乳鴿養(yǎng)殖試驗中，選擇體積分數(shù)為0.062 5%和0.031 3%的復(fù)合物T作為兩個試驗因子。

2.2 復(fù)合物T對乳鴿腸道微生物的影響

如表4所示，對于大腸桿菌，T1組和T2組兩個試驗組的均值均小于對照組，但各組之間無顯著性差異（P＞0.05）；對于雙歧桿菌，T2組顯著高于CT組和T1組（P＜0.05），而CT組和T1組之間無顯著性差異（P＞0.05）；對于乳酸菌，T2組顯著高于CT組（P＜0.05），而T1組與CT組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

表4 復(fù)合物T對乳鴿腸道微生物的影響Table 4 Effect of Compound T on gut microflora of squabs lgCFU·g-1

2.3 復(fù)合物T對乳鴿生長性能的影響

如表5所示，各組之間的10日齡體重均無顯著性差異（P＞0.05），達到了對試驗樣本選擇的要求；T2組的30日齡體重顯著高于CT組（P＜0.05），而T1組與CT組之間無顯著差異（P＞0.05）；T2組的平均日增重顯著高于CT組（P＜0.05），而T1組與CT組之間無顯著差異（P＞0.05）；T2組的料重比顯著低于CT組（P＜0.05），而T1組與CT組之間無顯著差異（P＞0.05）；各組之間存活率無顯著差異（P＞0.05）。

表5 復(fù)合物T對乳鴿生長性能的影響Table 5 Effect of Compound T on growth of squabs

2.4 復(fù)合物T對乳鴿免疫器官指數(shù)的影響

如表6所示，T2組的法氏囊指數(shù)顯著高于CT組（P＜0.05），而T1組與CT組之間沒有顯著差異（P＞0.05）；對于脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，T2組的均值最大，但各組之間都沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表6 復(fù)合物T對乳鴿免疫器官指數(shù)的影響Table 6 Effect of Compound T on immune organ indices of squabs ‰

2.5 復(fù)合物T對乳鴿屠宰性能的影響

如表7所示，總體上，相對于CT組，T1組和T2組的屠宰性能較好；其中，T2組的胸肌率顯著高于CT組（P＜0.05），T1組的胸肌率也高于CT組，但兩者之間無顯著差異（P＞0.05）；對于屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腹脂率和腿肌率，各組之間均無顯著差異（P＞0.05）。

表7 復(fù)合物T對乳鴿屠宰性能的影響Table 7 Effect of Compound T on slaughter performance of squabs %

2.6 復(fù)合物T對乳鴿肉品質(zhì)的影響

如表8所示，對于pH45min和pH24h，各組的均值都較為接近，無顯著差異（P＞0.05）；T1組失水率的均值最大，但各組之間均無顯著性差異（P＞0.05）；T1組剪切力的均值最小，但各組之間均無顯著性差異（P＞0.05）。

表8 復(fù)合物T對乳鴿胸肌肉品質(zhì)的影響Table 8 Effect of Compound T on breast meat quality of squabs

2.7 復(fù)合物T對乳鴿血清生化指標的影響

如表9所示，T2組谷草轉(zhuǎn)氨酶的均值最大，但各組之間均無顯著差異（P＞0.05）；T2組的血清肌酐均值最小，但各組之間均無顯著差異（P＞0.05）；T1組尿素氮的均值最大，但各組之間均無顯著差異（P＞0.05）；各組尿酸的均值相近，并且都無顯著差異（P＞0.05）。

表9 復(fù)合物T對乳鴿血清生化指標的影響Table 9 Effect of Compound T on serum biochemical indices of squabs

3 討論

3.1 人工灌喂乳鴿作為試驗動物的效果

乳鴿在孵出后發(fā)育還不充分，絨羽稀疏，眼睛未睜開，因此，在自然條件下，乳鴿出殼后需要在親鴿的保護下，通過喂飼由嗉囊腺分泌的主要含蛋白質(zhì)和脂肪的鴿乳使其睜眼、豐羽并充分發(fā)育[15]。這一哺育過程大約需要30 d。鴿乳開始為乳糜狀，隨著時間的推進，親鴿初步消化的飼料占鴿乳的比例越來越高，從9 d開始就基本為經(jīng)嗉囊浸潤的半消化飼料和消化液的混合物[15]，25 d后親鴿吐喂減少，逼迫乳鴿自行采食。本試驗通過模擬親鴿哺喂的過程，將10日齡白卡奴乳鴿通過人工灌喂的方式喂養(yǎng)至30日齡，試驗乳鴿的采食可以被精確地控制，試驗過程和相關(guān)數(shù)據(jù)采集達到良好的預(yù)期效果。

3.2 復(fù)合物T對微生物的影響

根據(jù)前期的研究基礎(chǔ)，我們篩選了一個以三辛酸甘油酯、桃金娘烯醇、肉豆蔻酸異丙酯、薄荷醇和樟腦為主要成分的復(fù)合物T作為替代抗生素的備選產(chǎn)品。其中，三辛酸甘油酯常作為乳化劑和載體應(yīng)用于醫(yī)藥當中[16]，將其應(yīng)用到青年豬上可改變腸道菌群[4]。桃金娘烯醇對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細菌具有抑制作用[2-3]。革蘭氏陰性菌，尤其是綠膿桿菌對肉豆蔻酸異丙酯具有很強的敏感性[11]。作為傳統(tǒng)的中草藥，薄荷和樟腦都具有很好的抗炎活性、抗氧化活性及抗菌活性[6,17-18]，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陰性菌都均具有顯著的抑制作用[6,9]。在飼料中添加樟腦可抑制日本鵪鶉腸道大腸桿菌的生長，并促進腸道乳酸菌的增長[10]。這些報道和本試驗的結(jié)果是相一致的，體外的抑制結(jié)果表明復(fù)合物T對于大腸桿菌有很好的抑制作用，并且體積分數(shù)0.031 3%以上的復(fù)合物T對大腸桿菌的抑制率超過了質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的氨芐西林溶液。相對于對照組，復(fù)合物T 以625 mg·kg-1的添加更能促進乳鴿腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸菌的生長。

3.3 復(fù)合物T對乳鴿生長性能的影響

有報道指出，三辛酸甘油酯可以刺激鯉魚幼仔的生長并提高存活率[19-20]，且可以提高斷奶仔豬的生長性能[5]和青年豬的飼料轉(zhuǎn)化率[4]。在雞、豬等畜禽上的應(yīng)用顯示，薄荷醇可以提高飼料利用率、生長性能、血液生化指標等[7-8]。Sedaghat等[10]卻發(fā)現(xiàn)在飼料中僅添加樟腦卻對日本鵪鶉的體重和飼料轉(zhuǎn)化率沒有顯著的影響。前人的報道顯示，桃金娘烯醇有很好的抗炎活性[21]，可以加速人和老鼠胃潰瘍的治愈[22]；肉豆蔻酸異丙酯作為一類重要的香料和乳化劑，可直接添加在食品中以改善食品的香氣與口感[23], 但將這二者作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽中卻少有報道。本試驗的結(jié)果顯示復(fù)合物T 以625 mg·kg-1的添加可以促進乳鴿的生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率。

3.4 復(fù)合物T對乳鴿免疫器官指數(shù)的影響

利用胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)來評價禽類的免疫狀態(tài)是通常的做法[12]，免疫器官指數(shù)的提高說明飼料中的添加物能夠影響家禽的免疫應(yīng)答[14]。前人的研究結(jié)果表明，三辛酸甘油酯可促進斷奶仔豬免疫球蛋白A(IgA)的分泌，并降低白細胞介素6(IL-6)的水平，從而提高斷奶仔豬的免疫功能[5]。50 mg·kg-1的桃金娘烯醇可抑制哮喘模型大鼠的免疫因子白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及丙二醛 (MDA)，增加干擾素 γ(INF-γ)、白細胞介素10(IL-10)及超氧化物歧化酶(SOD)[24]。薄荷醇也可以調(diào)節(jié)白細胞介素1α(IL-1α)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)[25]，并可改善公雞的免疫性能[26]。在飼料添加樟腦可增強日本鵪鶉對綿陽紅細胞、禽流感病毒和新城疫病毒的體液免疫反應(yīng)[10]。肉豆蔻酸異丙酯常作為促滲劑和佐劑應(yīng)用于醫(yī)藥當中[27]，但關(guān)于其對機體免疫的影響的研究卻鮮有報道。在本試驗中，復(fù)合物T 以625 mg·kg-1的添加可以顯著提高乳鴿的法氏囊指數(shù)，表明復(fù)合物T能影響乳鴿的免疫器官功能，但其對免疫功能的具體影響還需要后續(xù)的研究來進一步明確。

3.5 復(fù)合物T對乳鴿屠宰性能和肉品質(zhì)的影響

屠宰性能是肉禽重要的生產(chǎn)指標，可以直接衡量養(yǎng)殖情況的經(jīng)濟效益。本試驗的結(jié)果表明在基礎(chǔ)飼糧中添加復(fù)合物T可以提高乳鴿的屠宰性能，以添加625 mg·kg-1的效果最好，尤其是胸肌率，得到顯著提高。

隨著消費需求從數(shù)量到質(zhì)量的提升，肉品質(zhì)也成為畜禽養(yǎng)殖中越來越重要的經(jīng)濟指標。pH、剪切力和失水率是評價肉品質(zhì)的重要指標。pH值直接反映著肉的酸味，剪切力衡量肉的嫩度。失水率也叫持水性，衡量肉在外界環(huán)境的作用下保持其原有水分的能力[14]。本試驗結(jié)果顯示，對于這3個指標，各組之間的沒有顯著差異，說明在飼料中添加復(fù)合物T并不會影響乳鴿的肉品質(zhì)。

3.6 復(fù)合物T對乳鴿血清生化指標的影響

一般藥物進入血液后，其代謝主要是經(jīng)過肝臟來完成，而腎臟是藥物排泄的主要途徑[28-29]。谷草轉(zhuǎn)氨酶是評價肝功能的重要指標之一，其活性的增加提示著肝臟細胞損害的增多[28]。本試驗的結(jié)果顯示，空白試驗組和兩個試驗組之間的谷草轉(zhuǎn)氨酶都沒有顯著的差異，說明在飼料中添加313 mg·kg-1和625 mg·kg-1的復(fù)合物T不會影響乳鴿的肝功能。臨床上對血清肌酐、尿素氮和尿酸的檢測是了解腎功能的主要方法[28-29]。本試驗對這三個指標的檢測顯示，各組之間也都沒有顯著的差異，說明在飼料中添加 313 mg·kg-1和 625 mg·kg-1的復(fù)合物T 無腎功能損害，無細胞毒性。

4 結(jié)論

以三辛酸甘油酯、桃金娘烯醇、肉豆蔻酸異丙酯、薄荷醇、樟腦為主要成分的復(fù)合物T對大腸桿菌（菌種編號為ATCC8739）具有很好的抑制作用，并可促進腸道有益菌的生長，對乳鴿的生長性能具有一定的促進作用，適宜添加量為625 mg·kg-1。因此，復(fù)合物T可作為替代抗生素的備選產(chǎn)品做進一步的研究。