IFN-γ、IL-2聯(lián)合檢測在結(jié)核病中的診斷價值

廖家吉 楊曉輝 蒲渝成 青建植

結(jié)核病是全世界人類最常見的細菌感染之一，由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染造成，但絕大多數(shù)MTB感染者無臨床癥狀。近年來，隨著MTB耐藥菌的出現(xiàn)，全世界范圍內(nèi)結(jié)核病的感染和傳播水平不斷升高。世衛(wèi)組織統(tǒng)計資料表明，全世界三分之一以上的人曾感染過MTB，其中10%發(fā)展為活動性結(jié)核病者，每年因其死亡人數(shù)高達300萬以上[1]。而我國作為結(jié)核病流行重災(zāi)區(qū)，對結(jié)核病的早期診斷和預(yù)防必須十分重視[2]。由于影像學檢查缺乏特異性，因此臨床上診斷結(jié)核病主要依靠病原學檢測，但MTB分離培養(yǎng)和抗酸桿菌涂片法的診斷陽性率偏低，且對活動性肺結(jié)核診斷敏感性不足[3]。因此，急需一種快速、簡便且準確的新診斷方法。在機體受到MTB感染時，主要依靠激活CD4+T細胞介導的免疫功能來清除，而分泌干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-2（IL-2）細胞因子的CD4+T細胞與抗結(jié)核感染緊密相關(guān)[4]。因此，本研究通過分析結(jié)核病患者IFN-γ和IL-2的表達水平，并探討IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測對結(jié)核病的診斷效能，為臨床輔助診斷結(jié)核病提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年5-7月廣西壯族自治區(qū)胸科醫(yī)院收治的462例疑似結(jié)核病患者作為研究對象。納入標準：年齡≥15歲；均接受結(jié)核病臨床癥狀、體征、胸部影像學、細菌學檢測和組織病理學檢查；確認結(jié)核病患者均接受常規(guī)治療并進行抗結(jié)核療效評估；臨床資料完整。排除標準：具有自身免疫性疾病或免疫缺陷病毒感染；妊娠、接受長期免疫抑制劑治療；合并惡性腫瘤及嚴重肝、腎器官功能不全嚴重疾病。男283例，女179例；年齡15～92歲，平均（56.27±16.13）歲。按照2018年最新實施的肺結(jié)核診斷標準（WS 288-2017），其中確診結(jié)核病232例，納入結(jié)核組，非結(jié)核病230例納入組非結(jié)核組。232例結(jié)核病中繼發(fā)性肺結(jié)核179例，肺外結(jié)核53例（含結(jié)核性胸膜炎25例，結(jié)核性關(guān)節(jié)炎13例，結(jié)核性腹膜炎7例，結(jié)核性腦膜炎5例及頸部淋巴結(jié)核3例）。結(jié)核組年齡15～88歲，非結(jié)核組年齡17～92歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)過本院倫理審查委員會審核批準通過，患者自愿參與本研究并知情同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

兩組均進行結(jié)核特異性細胞因子IFN-γ和IL-2檢測。采集患者外周靜脈血（每份不少于4 ml）至含肝素抗凝劑采血管中，加入等體積RPMI-1640（天津灝洋，RPMI1640LT，規(guī)格：500 ml/瓶）混勻后以（2～3）∶1加入淋巴細胞分離液（天津灝洋，LTS1077，規(guī)格：200 ml/瓶）上層，室溫梯度離心后吸取單個核細胞（PBMCs）層至RPMI培養(yǎng)液，計數(shù)后根據(jù)數(shù)量稀釋至工作濃度，取50 μl無血清培養(yǎng)基至空白對照孔，50 μl結(jié)核特異性融合蛋白至檢測孔，50 μl陽性刺激物至陽性對照孔，之后加入配好濃度的細胞懸液，37 細胞培養(yǎng)箱（Biobase，QP-160）中培養(yǎng) 16～20 h。本研究采用結(jié)核分枝桿菌特異性細胞因子檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）（DeFine.TB）[廣州迪澳醫(yī)療科技有限公司，批準文號：國食藥監(jiān)械（準）字2014第3401353號，規(guī)格：28人份/盒]分別檢測IFN-γ及IL-2表達水平，顯色反應(yīng)使用全自動酶標儀（深圳匯松，MB-580），試驗操作嚴格按照說明書步驟進行。

1.3 觀察指標

比較兩組結(jié)核特異性細胞因子IFN-γ和IL-2的表達水平。分析IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測對結(jié)核病的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析和處理，符合正態(tài)分布特征的計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析IFN-γ和IL-2及聯(lián)合檢測的診斷效能，曲線下面積（AUC值）比較采用Z檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組結(jié)核特異性細胞因子IFN-γ和IL-2的表達水平比較

結(jié)核組IFN-γ和IL-2表達水平分別為（256.98±24.36）、（106.90±10.21）pg/ml；非結(jié)核組IFN-γ和IL-2表達水平分別為（15.96±1.98）、（8.13±1.67）pg/ml。結(jié)核組IFN-γ和IL-2表達水平均明顯高于非結(jié)核組（t=9.818、9.510，P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組結(jié)核特異性細胞因子IFN-γ和IL-2的表達水平比較

2.2 IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測對結(jié)核病的診斷效能

繪制IFN-γ和IL-2及聯(lián)合檢測的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測AUC值明顯高于IFN-γ、IL-2單獨檢測的AUC值（Z=2.817、3.036，P＜0.05）。聯(lián)合檢測的Youden指數(shù)最高為0.750，敏感度和特異度分別高達89.3%和85.7%，見表2、圖2。

表2 IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測對結(jié)核病的診斷效能

圖2 IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測診斷結(jié)核病的ROC曲線

3 討論

盡管經(jīng)過多年診斷技術(shù)的革新和發(fā)展，目前結(jié)核病的診斷仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。MTB攜帶的蛋白和多糖抗原表達豐富，故針對結(jié)核病診斷的免疫學方法雖多但特異性較差，而常規(guī)結(jié)核病病原體陽性培養(yǎng)和鑒定的敏感性較低，因此，臨床上對診斷結(jié)核病，特別是活動性結(jié)核病提出了更高的需求。機體在被MTB感染后，會誘發(fā)巨噬細胞吞噬和消化MTB病原體，并將MTB抗原特異性片段遞呈T淋巴效應(yīng)細胞，刺激特異性CD4+T細胞迅速增殖和活化產(chǎn)生特異性淋巴因子包括IFN-γ、IL-2等激活巨噬細胞從而介導細胞免疫反應(yīng)[5]。同時，部分活化的CD4+T細胞在介導免疫反應(yīng)后分化為抗原特異性記憶T細胞，當再次遇到MTB刺激時，抗原特異性記憶T細胞會迅速增殖為效應(yīng)T細胞發(fā)揮更高效的細胞免疫反應(yīng)[6]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核組IFN-γ和IL-2表達水平均明顯高于非結(jié)核組（P＜0.05）。表明機體內(nèi)CD4+T淋巴細胞或抗原特異性記憶T細胞在MTB感染后，接受特異性抗原刺激產(chǎn)生了大量IFN-γ和IL-2細胞因子。

IFN-γ是主要的Th1型細胞效應(yīng)因子，具有廣泛的抗細菌和病毒及免疫調(diào)節(jié)的作用。既往研究表明，隨著細胞免疫應(yīng)答的啟動，CD4+Th1細胞分泌IFN-γ與IL-2等細胞因子激活巨噬細胞，而在抗結(jié)核感染過程中IFN-γ是促進巨噬細胞活化的重要組成部分，被激活的巨噬細胞發(fā)揮強大的溶菌效應(yīng)以殺傷結(jié)核分枝桿菌，在結(jié)核病的控制中舉足輕重[7]。近年來，隨著免疫診斷技術(shù)的飛速進步，開發(fā)出了以MTB的特異性抗原（CFP-10和ESAT-6）為抗原肽刺激的T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）法，MTB分泌的兩種特異性抗原會刺激人體T淋巴細胞分泌IFN-γ，從而通過檢測IFN-γ的釋放效應(yīng)來診斷結(jié)核病。在結(jié)核病診斷中取得了良好的效果，此方法因避免了患者因老年、免疫缺陷感染、自身免疫病及其他病原體感染帶來的影響，在結(jié)核病的診斷中擁有較高的敏感性和特異性[8]。但有報道發(fā)現(xiàn)，在活動性肺結(jié)核治療期間觀察到患者T細胞體外應(yīng)答下降，造成MTB分泌的特異性抗原（CFP-10和ESAT-6）刺激人體T細胞分泌IFN-γ的能力減弱，從而導致T-SPOT.TB在活動性結(jié)核病診斷中效果不甚理想[9]。

有報道顯示，經(jīng)ESAT-6/CFP-10刺激后抗原特異性記憶T細胞雖在28個月內(nèi)持續(xù)分泌IFN-γ，但從治療的第6個月開始ESAT-6/CFP-10特異性T細胞分泌IL-2的數(shù)量顯著增加[10]。且在活動性肺結(jié)核治療期間和治療后的28個月中，ESAT-6/CFP-10特異性T細胞從開始的IFN-γ和IFN-γ/IL-2的CD4+T細胞共同占優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑置贗FN-γ/IL-2的CD4+T細胞為主，并在治療期間和治療后出現(xiàn)只分泌IL-2的CD4+T細胞。因此，在體外ELISpot檢測未經(jīng)治療的活動性肺結(jié)核中，IFN-γ由兩個相對比例不同的CD4+T細胞功能亞群分泌而來，且IFN-γ和IL-2分泌CD4+T細胞呈對比動態(tài)變化，單一的IFN-γ檢測并不是活動性結(jié)核病的“金標準”。

IL-2具有廣泛的生物活性，在機體啟動的免疫應(yīng)答過程中，T細胞和B細胞增殖分化離不開IL-2的激活，且抗原特異性記憶T細胞在IL-2的刺激下才會大量分泌IFN-γ對細胞免疫應(yīng)答做出快速反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-2與IFN-γ一樣均為MTB感染后CD4+Th1細胞分泌的結(jié)核特異性細胞因子，結(jié)核病患者的血液和病灶部位的淋巴細胞是在IL-2刺激下被激活而釋放入血，且其與機體感染的炎癥嚴重水平密切相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測的敏感度為89.3%，而單獨檢測IFN-γ的敏感度為87.1%，這表明引入了IL-2作為聯(lián)合診斷標志物，增加了結(jié)核病的診斷敏感度。且IFN-γ的特異度僅為74.3%，而IL-2的診斷特異度高達85.2%。Tan等[12]報道表明，對MTB特異性細胞因子表達分析證實，IL-2對活動性結(jié)核病例的特異度高于IFN-γ。在結(jié)核病感染過程中，MTB特異性T細胞在慢性感染晚期表達高水平的PD-1，從而限制了其分泌IL-2而不是IFN-γ的能力[13]。這可能是IL-2在結(jié)核病診斷中的高特異度的合理解釋。本研究結(jié)果顯示當IFN-γ和IL-2聯(lián)合檢測時，特異度進一步提高到85.7%。同時，聯(lián)合檢測的AUC值明顯高于IFN-γ、IL-2的單獨檢測，提示聯(lián)合檢測的診斷效能更高，這得益于聯(lián)合檢測結(jié)合了IFN-γ高敏感性和IL-2高特異性的優(yōu)點，能顯著提高結(jié)核病的檢出率。

綜上所述，本次研究說明感染MTB后，結(jié)核病患者體內(nèi)T淋巴細胞中IFN-γ和IL-2的表達水平急劇升高，可以作為結(jié)核病的診斷標志物。且對結(jié)核病進行IFN-γ和IL-2聯(lián)合檢測，可以有效提高結(jié)核病準確度并減少漏檢的可能，這為結(jié)核病診治及防控帶來廣闊的應(yīng)用前景。