復合發酵法優化低鹽黑豆醬油風味研究

冉偉，姜婷婷，李興華，李想

(四川旅游學院，成都 610100)

目前醬油的釀造方法主要為高鹽稀態發酵工藝和低鹽固態發酵工藝兩種，通常采用黃豆和黃豆粕為原料[1]。低鹽固態發酵工藝相對于高鹽稀態發酵工藝具有發酵溫度高、生產周期較短、通過發酵劑添加能有效地保證生產過程穩定、提高原料的利用率等特點，目前被國內大部分生產企業選用[2]。同時因在發酵過程中鹽的添加量相對較低，符合目前低鹽健康的生活理念，低鹽固態發酵工藝制備的醬油深受消費者喜愛[3]。但是其風味物質含量及口味不及高鹽稀態發酵工藝制備的醬油。如何改善低鹽發酵醬油的風味成為目前亟需解決的問題。

復合發酵法是食品工業生產領域常用的一種風味改良方法，生物發酵劑的添加能有效去除醬油在制備過程中產生的異味，同時還能豐富其風味物質種類及含量，達到改善口味的目的[4]。目前醬油生產企業多采用多菌種混合發酵的方式，實現菌種互補、縮短發酵時間及改善發酵效果。房峻等[5]通過強化嗜鹽四聯球菌，添加魯氏接合酵母菌改善醬油品質，有效提高了醬油樣品中氨基酸和有機酸含量，揮發性風味物質種類總量提高2.4倍；鄧岳等[6]通過多菌混合制曲制備醬油，特征性風味物質含量均高于傳統非添加菌種醬油，醬油品質得到了有效改善。目前，采用復合發酵法優化低鹽醬油工藝的研究相對較少。

嗜鹽四聯球菌是一種中度嗜鹽菌，能夠在發酵過程中產生高濃度乳酸，對發酵速度和成品呈味物質含量有一定影響[7]。魯氏接合酵母在醬油的制備過程中能產生多種風味物質，使醬油醇厚的香氣增加。本研究選取富含不飽和脂肪酸、膳食纖維等生物活性物質且抗氧化效果較好的黑豆替代傳統黃豆為原料，在傳統低鹽固態發酵工藝基礎上添加嗜鹽四聯球菌和魯氏接合酵母菌進行發酵，以感官評定和氨基態氮含量為指標，通過單因素試驗結合響應面優化復合發酵法制備低鹽黑豆醬油的最佳工藝，并對比分析其與傳統工藝制備的低鹽黑豆醬油品質差異，為相關企業生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆、麩皮：購于中糧集團有限公司；米曲霉3.042 (Aspergillusoryzae3.042)：購于成都市青羊生物科技有限公司；嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)、魯氏接合酵母(Saccharomycesrouxii)：購于美國QLED公司；氨基酸標樣、酵母膏、胰蛋白胨、MRS 培養基等：購于成都瑞星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

XRP100電子天平 梅特勒-托利多國際有限公司;BJPX88恒溫培養箱 濟南鑫貝西生物技術有限公司；UV-4430紫外可見光分光光度計 青島明博環保科技有限公司；GBQ100L發酵罐 山東雙子機械工程有限公司；高效液相色譜儀 深圳市鴻永精儀科技有限公司；API 5000液質聯用儀、氣質聯用儀 譜質分析檢測技術(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 低鹽黑豆醬油制備工藝

1.3.1.1 制曲工藝

將黑豆浸泡8 h，放入蒸鍋中蒸45 min，添加1.5倍的水后再于123 ℃滅菌15 min，按6∶4的比例將黑豆和麩皮混合，接種0.5%的醬油曲精，攪拌均勻后放入培養箱內，在溫度32 ℃、濕度75%的條件下制曲48 h，每8 h翻曲1次。

1.3.1.2 發酵工藝

成曲樣品粉碎，按1∶2的比例將粉碎后的樣品與鹽水(100 g/L NaCl)混合，放入發酵罐中進行發酵，期間每天攪拌1次。傳統制備方法在30 ℃條件下自然發酵120 d。復合發酵法按試驗設計的發酵溫度、發酵時間進行發酵，其中在發酵0 d添加魯氏接合酵母，在發酵10 d添加嗜鹽四聯球菌。

1.3.2 單因素試驗設計

在預試驗基礎上，復合發酵法制備的低鹽黑豆醬油的條件：發酵時間80 d，發酵溫度30 ℃，魯氏接合酵母菌接種量2%，嗜鹽四聯球菌接種量1%。在其他條件不變的前提下對單個因素不同梯度進行單因素試驗，分析其對感官品質及氨基態氮含量的影響。各因素單因素試驗水平：發酵時間60，65，70，75，80，85，90，95，100 d，發酵溫度26，27，28，29，30，31，32，33，34 ℃，魯氏接合酵母菌接種量1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%，嗜鹽四聯球菌接種量0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%。

隨著我國城市化的推進，物業管理企業也逐漸的從大城市普及到了中小城市，隨之而來的競爭也日益激烈，為了爭奪資源，物業管理公司都想盡辦法來擴大資源，物業管理的覆蓋面積不斷增大，這就需要更多的人力。除此之外，監控線延長帶來的管理上的困難也可想而知，相應的管理成本也會隨之增長。

1.3.3 響應面優化設計

根據單因素試驗結果，確定發酵時間、發酵溫度、魯氏接合酵母菌接種量和嗜鹽四聯球菌接種量等因素對低鹽黑豆醬油品質影響較大的水平，運用Design-Expert 13軟件進行響應面試驗設計，并確定試驗方案，建立回歸方程預測模型，確定最佳工藝條件。具體因素及水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.3.4 感官評價

通過對低鹽黑豆醬油的感官屬性進行分析，確定感官評價標準，分別從色澤、氣味、滋味和形態4個方面進行評價，具體見表2。選取10名具有食品科學等相關專業背景的感官評價員，其中男5名，女5名,年齡在18～22歲，在評價前進行統一培訓。樣品用相同的器皿盛裝，置于45 ℃水浴鍋中加熱5 min，隨機抽樣評價，取評分平均值為最終評分。

表2 感官評定標準Table 2 The sensory evaluation standard

1.3.5 其他理化指標測定

氨基態氮含量測定參考胡伊等[9]的方法，采用高氯酸非水滴定法；氯化鈉的測定參考董淑杰等[10]的方法，采用離子色譜-電導法；可溶性無鹽固形物的測定參考尹樂斌等[11]的方法，采用直接干燥重量法；游離氨基酸含量的測定參考褚千千等[12]的方法，采用三硝基苯磺酸法測定；有機酸含量的測定參考于敏等[13]的方法，采用高效液相色譜法測定；揮發性風味物質的測定參考袁爾東等[14]的方法，采用固相微萃取聯合氣質聯用技術(SPME-GC-MS)進行測定。

1.4 數據處理

試驗結果用平均值表示，使用Excel 2010軟件進行作圖和數據分析。

2 結果與分析

2.1 復合發酵法優化低鹽黑豆醬油工藝條件

2.1.1 單因素試驗

復合發酵法優化低鹽黑豆醬油單因素試驗結果見圖1～圖4。

圖1 發酵時間對氨基態氮含量和感官評分的影響Fig.1 The effect of fermentation time on the content of amino nitrogen and sensory score

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，感官評分和氨基態氮含量均呈上升趨勢，發酵時間為90 d時，感官評分達到最大值96.12，此時氨基態氮含量為(8.25±0.12) mg/mL，說明此時低鹽黑豆醬油風味最佳。隨著發酵時間的延長，二者均呈下降趨勢，主要受發酵后期有機酸等次生代謝物的影響，導致風味品質下降。綜合分析，發酵時間為90 d時品質最佳。

圖2 發酵溫度對氨基態氮含量和感官評分的影響Fig.2 The effect of fermentation temperature on amino nitrogen content and sensory score

由圖2可知，發酵溫度為30 ℃時感官評分和氨基態氮含量最高，29 ℃和31 ℃次之，溫度過低，低鹽黑豆醬油的微生物代謝緩慢，影響風味物質的形成，溫度過高又會抑制微生物的代謝活動，導致風味物質濃度降低，發酵溫度為30 ℃時品質最佳。

圖3 魯氏接合酵母菌對氨基態氮含量和感官評分的影響Fig.3 The effect of Saccharomyces rouxii on the content of amino nitrogen and sensory score

圖4 嗜鹽四聯球菌對氨基態氮含量和感官評分的影響Fig.4 The effect of Tetragenococcus halophilus on the content of amino nitrogen and sensory score

由圖3和圖4可知，隨著兩種菌接種量的增加，感官評分和氨基態氮含量均呈先上升后下降的趨勢，魯氏接合酵母菌接種量為1.9%時，其感官評分為95.16，氨基態氮含量為(8.21±0.32) mg/mL，嗜鹽四聯球菌接種量為1.2%時，其感官評分為96.12，氨基態氮含量為(8.42±0.18) mg/mL，發酵菌種的添加對低鹽黑豆醬油中微生物代謝有較大影響，在發酵過程中能有效分解黑豆蛋白質，產生氨基酸等小分子化合物，直接影響低鹽黑豆醬油滋味，也是判斷發酵程度的重要指標，綜合分析，魯氏接合酵母菌接種量為1.9%時品質最佳，嗜鹽四聯球菌接種量為1.2%時品質最佳。

2.1.2 響應面優化試驗結果分析

表3 響應面設計與結果Table 3 Response surface design and results

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

續 表

由表3可知單因素試驗最佳結果，復合發酵法制備低鹽黑豆醬油的最佳工藝條件為發酵時間90 d、發酵溫度30 ℃、魯氏接合酵母菌接種量1.9%、嗜鹽四聯球菌接種量1.2%。采用Design-Expert 13軟件進行處理分析。根據方差分析結果除去不顯著項得到模型的二次多項回歸方程為Y=-9819.8875+26.20167A+440.325B+1793.91667C+670.83333D-0.045AB-1AC+0.6AD-17.5BC+2BD+40CD-0.131667A2-6.76667B2-315.41667C2-352.91667D2。

由表4可知，模型的P值小于0.0001，差異極顯著，失擬項的P值為0.2216，差異不顯著，表明模型是極顯著的。因素A、B、AB、AC、AD、BC、BD、CD對結果影響不顯著(P>0.05)；因素D對結果影響顯著(P<0.05)；因素C、A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著(P<0.01)；RAdj2為92.74%，說明模型中殘差相互獨立，擬合度良好，試驗誤差小，可以用于復合發酵法制備低鹽黑豆醬油的最佳工藝條件優化與預測。

2.1.3 響應曲面圖分析與結果優化

根據回歸方程的分析結果，考察復合發酵法制備低鹽黑豆醬油工藝條件的發酵時間、發酵溫度、魯氏接合酵母菌接種量、嗜鹽四聯球菌接種量4個因素的交互作用對配方的影響，具體見圖5～圖10。通過Design-Expert 13得回歸模型提取復合發酵法制備低鹽黑豆醬油的最佳配方方案：發酵時間90 d、發酵溫度30 ℃、魯氏接合酵母菌接種量1.964%、嗜鹽四聯球菌接種量1.2%，模型預測所得的感官評分為96.1；考慮到試驗條件，將復合發酵法制備低鹽黑豆醬油最佳配方方案修正為發酵時間90 d、發酵溫度30 ℃、魯氏接合酵母菌接種量1.9%、嗜鹽四聯球菌接種量1.2%。為了進一步檢驗預測結果的可靠性，在修正后的最佳配方條件下進行3次平行試驗，平均感官評分為95.88，與模型預測所得的感官評分相對誤差為0.0127，與預測值具有良好的吻合性，可以用于實際生產。

圖5 A與B交互影響響應面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction between A and B

圖6 A與C交互影響響應面Fig.6 Response surface diagram of interaction between A and C

圖7 A與D交互影響響應面圖Fig.7 Response surface diagram of interaction between A and D

圖8 B與C交互影響響應面圖Fig.8 Response surface diagram of interaction between B and C

圖9 B與D交互影響響應面圖Fig.9 Response surface diagram of interaction between B and D

圖10 C與D交互影響響應面圖Fig.10 Response surface diagram of interaction between C and D

2.2 復合發酵法與傳統發酵法制備的低鹽黑豆醬油品質比較

2.2.1 氯化鈉、可溶性無鹽固形物含量及感官評分比較

醬油中氯化鈉濃度對酶的代謝影響較大，濃度過高會制約酶的分解，濃度過低又不能有效抑制雜菌的生長，一般濃度在6～8 mg/mL適宜[15]。對比分析復合發酵法和傳統發酵法制備的低鹽黑豆醬油，氯化鈉含量分別為6.89 mg/mL和7.21 mg/mL，差異不顯著，均在合理范圍內，兩種方法在制備過程中均按相同比例混合，受發酵時間及溫度等因素影響，水分蒸發，直接影響成品中氯化鈉濃度。可溶性無鹽固形物主要是原料的分解物，其含量越高說明成品品質越好。由圖11可知，復合發酵法制備的低鹽黑豆醬油無鹽固形物含量為20.12 mg/mL，高于傳統發酵法16.9%，達到特級醬油標準20 mg/mL。感官評價結果為消費者最直接的感受，評分增加了5.5%，說明復合發酵法工藝優化有效提升了低鹽黑豆醬油的發酵品質。

圖11 兩種發酵方法的氯化鈉、可溶性無鹽固形物含量及感官評分Fig.11 Sodium chloride, soluble salt-free solid content and sensory score of black bean soy sauce prepared by the two fermentation methods

2.2.2 游離氨基酸含量比較分析

游離氨基酸是低鹽黑豆醬油鮮味的主要來源，是評價其品質的主要指標，復合發酵法與傳統發酵法制備的低鹽黑豆醬油游離氨基酸含量見表5。

表5 兩種發酵法的游離氨基酸含量Table 5 Free amino acid content of black bean soy sauce prepared by the two fermentation methods mg/dL

由表5可知，傳統方法制備的低鹽黑豆醬油中游離氨基酸總量為45.41 mg/dL，其中鮮味氨基酸含量為11.7 mg/dL，占總量的25.75%，甜味氨基酸含量為4.36 mg/dL，占總量的9.6%；接種了魯氏接合酵母菌和嗜鹽四聯球菌的低鹽黑豆醬油中鮮味氨基酸含量為15.56 mg/dL，相比傳統發酵法增加了32.99%，甜味氨基酸含量為5.6 mg/dL，相比傳統發酵法增加了28.44%；綜合分析，低鹽黑豆醬油在發酵過程中添加菌種后，游離氨基酸總量有了顯著提升，特別是直接影響低鹽黑豆醬油鮮甜味的氨基酸含量增加顯著，能更好地改善復合發酵法制備的低鹽黑豆醬油品質。

2.2.3 有機酸含量比較分析

表6 有機酸含量Table 6 Organic acid content mg/dL

醬油中的有機酸能有效改善醬油的滋味，其含量差異對醬油的口感和質量有直接的影響[16]。由表6可知，復合發酵法優化工藝制備的低鹽黑豆醬油共有檸檬酸、酒石酸、丙酸、蘋果酸、乳酸和乙酸6種有機酸，總量比傳統發酵法制備的低鹽黑豆醬油高15.55%。其中具體改善醬油風味和能有效防腐抑菌的蘋果酸、乳酸、乙酸和丙酸等含量高于傳統低鹽黑豆醬油54.51%，說明工藝優化與魯氏接合酵母菌和嗜鹽四聯球菌接種對其品質改良具有積極的意義。

2.2.4 揮發性風味物質比較分析

表7 揮發性風味物質的種類Table 7 Types of volatile flavor substances 種

通過對兩種方法制備的低鹽黑豆醬油樣品中揮發性風味物質的檢測與分析，由表7可知，傳統發酵法制備的低鹽黑豆醬油與復合發酵法制備的低鹽黑豆醬油所檢測到的揮發性風味物質種類差異較大，復合發酵法揮發性風味物質總量達69種，比傳統發酵法多20種，說明通過工藝優化，添加魯氏接合酵母菌和嗜鹽四聯球菌能有效提升醬油中揮發性風味物質的種類，更有利于醬油的滋味調和。

3 結論

添加魯氏接合酵母菌和嗜鹽四聯球菌的復合發酵法，在改善低鹽黑豆醬油品質方面具有積極的作用。在單因素試驗的基礎上，利用Design-Expert 13軟件建立以感官評分為指標的二次多項式回歸模型，用響應面法優化得最佳工藝：發酵時間為90 d，發酵溫度為30 ℃，魯氏接合酵母菌接種量為1.9%，嗜鹽四聯球菌接種量為1.2%，按該工藝條件生產的低鹽黑豆醬油品質最佳，感官評分為95.88，氨基態氮含量為8.45 mg/mL。并對最佳工藝條件生產的低鹽黑豆醬油與傳統發酵法制備的低鹽黑豆醬油在品質上進行了對比分析，研究發現，復合發酵法制備的低鹽黑豆醬油在氯化鈉含量、可溶性無鹽固形物含量及感官評分上均優于傳統發酵法制備的低鹽黑豆醬油，達到特級醬油標準；在生產過程中添加菌種的低鹽黑豆醬油游離氨基酸總量有了顯著提升，特別是直接影響低鹽黑豆醬油鮮甜味的氨基酸含量增加顯著，有機酸總量比傳統發酵法制備的低鹽黑豆醬油高15.55%，揮發性風味物質總量達69種，比傳統發酵法多20種，說明其能更好地改善低鹽醬油的品質。本研究為相關企業生產提供了理論依據。