金平馬藍重要農藝性狀及其與主要活性成分含量的相關性

李 河，郭建偉, 2，盧丙越，孟衡玲，張 薇，王田濤

(1.云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室/紅河學院生物科學與農學學院，云南 蒙自 661199; 2.中國科學院昆明植物研究所山地未來研究中心，昆明 650201)

【研究意義】馬藍[Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek]為爵床科多年生草本植物，廣泛分布于中國華東、華南及西南地區；莖、葉可制成中藥材青黛，根莖和根可作為南板藍根入藥，具有清熱解毒、涼血消斑的功效[1]，為云南哈尼族和貴州苗族習用藥材。靛玉紅和靛藍是馬藍的主要活性成分[2]，靛玉紅臨床可用于治療慢性粒細胞白血病，靛藍既可作染料又具有抗紫外線、抗氧化、抗菌消炎等作用[3]。雖然馬藍種植區域廣泛但由于環境及種植技術等因素造成產量和藥用成分差異較大且不穩定，其在種植中多采為自繁，不利于馬藍的優良品種選育。在選育優良作物品種時，可以根據作物的農藝性狀和主要成分等進行綜合評價[4-5]。研究馬藍農藝性狀及其活性成分，對馬藍優良品種選育及標準化栽培具有重要的指導意義。【前人研究進展】目前研究主要集中于馬藍藥用成分測定[6-7]、藥用成分比較[8-9]、基因生物學[10-11]、高效栽培[12-15]等方面，而關于馬藍遺傳變異研究報道少見。黃玉吉等[16]通過對7個不同產地馬藍進行PAPD分析，發現馬藍種質資源遺傳差異與地理位置無明顯聯系，而與形態特征有明顯聯系。熊清平等[17]研究表明，野生馬藍的藥用部位、形態特征和橫切面組織結構與栽培馬藍差異明顯，生態環境對馬藍生理特征、形態特征、藥用部位、組織結構等產生較大影響。張武君等[18]、肖春霞等[8]、羅丹冬等[9]和張英嬌等[12]研究表明，生態環境和栽培措施對馬藍中靛藍和靛玉紅含量影響顯著。羅君等[19]研究表明，貴州主產區不同海拔、不同采收期和不同初加工方法馬藍樣品中靛藍、靛玉紅的含量存在較大差異。8月采收的馬藍植株中靛藍、靛玉紅的含量較高，并隨時間增加呈下降趨勢；不同初加工方法對馬藍藥材中靛藍、靛玉紅的含量影響較大，以陰干法較好，其次為曬干。侯惠嬋等[20]研究表明，非花果期、花期、果期的馬藍中靛玉紅、靛藍的含量依次遞減，未干燥情況下，靛藍含量下降85%，而靛玉紅含量增加4倍。馬藍農藝性狀和藥用成分有待進一步研究?！颈狙芯壳腥朦c】本研究以不同馬藍居群為研究對象，探討其重要農藝性狀和主要活性成分的差異及其相互關系。【擬解決的關鍵問題】本研究通過對金平縣生產中常見4個馬藍居群進行品比試驗，測定其重要農藝性狀和各部位主要活性成分指標并進行變異系數、相關、主成分分析，為馬藍標準化栽培和優良品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2018年11月至2019年12月在云南省紅河州金平縣阿得博鄉苦竹箐村進行。該地位于103°12′36.67″E，22°56′59.66″N，海拔1480 m，年平均氣溫16.1 ℃，年均降雨量2700 mm，土壤為紅壤土，非常適合馬藍生長。

1.2 試驗材料

2018年11月底，采集生育期和長勢相似的4個馬藍居群材料：1號居群JP1哈尼語音譯為“海稱”，2號居群JP2哈尼語音譯為“苗淺”，3號居群JP3哈尼語音譯為“苗活”，4號居群JP4哈尼語音譯為“苗滿”，剪取20 cm、帶有嫩莖的枝條，作為扦插材料，采集地點為云南省紅河州金平縣沙依坡鄉水源村。

1.3 試驗方法

將采集的4個馬藍居群材料，剪取長8～10 cm、帶有2對剪除半片葉的未成熟嫩莖頂部枝條進行無性扦插育苗。2019年2月中旬，苗長至6～10 cm 時進行移栽。每個居群種植3個小區，每小區面積8 m×5 m=40 m2，行距35 cm，株距25 cm；施農家肥15 000 kg/hm2，磷酸二氫鉀復合肥450 kg/hm2作為底肥，栽培及田間管理參考張丹雁等[13]進行馬藍的標準化種植。2019年12月進行取樣，每個小區按照五點取樣法取樣，每小區選取15株長勢均勻的馬藍植株，分別利用鋼卷尺、游標卡尺和電子天平測定其農藝性狀，指標包括株高、莖粗、葉長、葉寬、一級分枝數、二級分枝數、根鮮重、莖鮮重、葉鮮重、株鮮重、根干重、莖干重、葉干重、株干重14個農藝性狀，其中葉長、葉寬以平均值進行統計分析。將各居群馬藍整株采集并帶回實驗室，放在陰涼干燥的地方風干。把風干好的植株按不同居群不同部位分離并粉碎過50目篩，保存備用。

1.4 馬藍靛藍和靛玉紅含量測定

1.4.1 色譜條件 流動相是甲醇-水，其比例為75∶25；檢測波長為290 nm；流速為0.10 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣1～8 μL[21]。

1.4.2 配制樣品待測液 分別取馬藍葉片0.2 g、莖1 g、根2 g (精確至0.01 mg)，并用專用濾紙包好。用長鑷子把用濾紙包好的小樣包放入60 mL球形索氏提取器中，量取50 mL氯仿加入索氏提取器中，用電爐加熱、回流提取，到溶液顏色呈現無色為止。把回流得到的溶液直接轉移至旋轉蒸發儀中，在40 ℃下蒸干，在25 mL容量瓶中用甲醇-氯仿(80∶20)將干品分次溶解后定容到刻度線。在0.45 μm有機微孔濾膜中過濾，濾液則為待測溶液。用1000 μL移液槍吸取2 mL待測液于2 mL進樣瓶中。

1.4.3 系統適應性考察 (1)考察相關線性關系。以精準電子天平稱取購自上海源葉生物科技有限公司的靛玉紅、靛藍標準品各5 mg，加入10 mL容量瓶，以甲醇-氯仿(80∶20)作為溶劑溶解樣品，在稀釋至刻度后搖晃樣品液至大致混勻，以此作為實驗中的所需母液，用移液槍分別吸取母液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL至2 mL進樣瓶中，再用1000 μL移液槍分別吸取甲醇溶液1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL加入到對應進樣瓶中，搖勻后可得到靛玉紅和靛藍濃度為100、200、300、400、500 μg/mL。按實驗要求，先后選取1、8 μL為進樣量。繪制標準曲線，以進樣量為橫坐標(μg)，峰面積為縱坐標，根據所繪曲線可求出靛玉紅、靛藍含量與峰面積的回歸方程。

(2)色譜儀精密度試驗。取靛玉紅、靛藍母液溶液各2 mL于2 mL進樣瓶中(制備及濃度與相關線性關系同)，分別精密進樣1、8 μL，按照色譜條件，連續5次進樣，得出靛玉紅峰面積RSD為0.63%、靛藍的為0.47%。連續進樣5次，兩者的值均小于1%，說明儀器精密度良好。

(3)色譜儀穩定性試驗。用電子天平稱取4號馬藍居群莖粉末1 g (精確至0.01 mg)，制備待測液5份，按試驗要求色譜條件，在0、2、4、8、12 h分別精密進樣5 μL，得出靛玉紅峰面積RSD為0.34%、靛藍的為0.39%。得出在12 h內待測樣品溶液穩定。

(4)重現性試驗。電子天平稱取4號馬藍居群莖粉末約1 g (精確至0.01 mg)，制備待測液5份，按色譜條件，分別進樣5 μL，得出靛玉紅峰面積RSD為0.56%，而靛藍的則為0.61%。結果得出試驗重現性良好。

(5)加樣回收試驗。用電子天平稱取1 g (精確至0.01 mg)的4號馬藍莖粉末，準確加入0.18 mg靛玉紅和靛藍作為對照，制備5份待測液，按實驗要求色譜條件，分析、計算得到靛玉紅和靛藍平均回收率分別為98.3%和98.1%。此方法測定馬藍靛玉紅和靛藍含量可行。

1.5 數據處理與分析

使用軟件Excel 2010對數據進行處理統計，計算平均值、標準差及變異系數等。用SPSS 17.0對數據進行方差分析、相關分析和主成分分析等。

2 結果與分析

2.1 金平不同馬藍居群重要農藝性狀的多重比較

由表1可知，馬藍各居群間農藝性狀差異各不相同。株高JP1與JP4差異不顯著，二者均顯著高于JP2和JP3，JP2與JP3差異不顯著。莖粗JP4顯著高于JP3，JP3顯著高于JP1，JP1與JP2差異不顯著。葉長、葉寬JP4與JP3、JP1差異不顯著，三者均顯著高于JP2。一級分枝數JP1、JP2、JP3間差異不顯著，三者均顯著高于JP4。二級分枝數JP2顯著高于JP3，二者與JP1、JP4差異均不顯著。根鮮重JP1、JP3差異不顯著，二者均顯著低于JP2。莖鮮重JP2、JP4與JP3差異不顯著，三者均顯著高于JP1。葉鮮重JP1、JP2、JP4間差異不顯著，三者均顯著低于JP3。株鮮重JP2、JP3、JP4差異不顯著，三者均顯著高于JP1。根干重JP1與JP3差異不顯著，二者均顯著低于JP2。莖干重JP2和JP4均顯著高于JP1，與JP3差異不顯著。葉干重JP3顯著高于JP4，JP4顯著高于JP1和JP2，JP1與JP2差異不顯著。株干重JP2和JP4顯著高于JP1，與JP3差異不顯著。各馬藍居群根、莖、葉干重占株干重比值分別為12.37%～22.26%、52.03%～70.58%、9.16%～35.60%。JP3馬藍整株含有靛玉紅5582.88 mg，分別比JP1、JP2、JP4高224.60%、78.17%、17.56%；JP3馬藍整株含有靛藍34465.50 mg，分別比JP1、JP2、JP4高242.58%、113.38%、1.17%。

2.2 金平不同馬藍主要活性成分的多重比較

由表1可知，根靛玉紅含量JP3顯著高于JP1、JP2，與JP4差異不顯著。莖靛玉紅含量各居群間差異不顯著。葉靛玉紅含量JP2、JP3、JP4差異不顯著，三者均顯著高于JP1。根靛藍含量JP3顯著高于其它居群，JP1與JP2差異不顯著，二者均顯著高于JP4。莖靛藍含量JP3與JP4差異不顯著，二者均顯著高于JP1和JP2。葉靛藍含量JP2、JP3、JP4差異不顯著，三者均顯著高于JP1。靛玉紅含量根、莖、葉比值為1∶(1.99～2.79)∶(10.87～18.01)；靛藍含量根、莖、葉比值為1∶(1.60～5.97)∶(10.51～33.92)。

表1 馬藍重要農藝性狀及主要活性成分含量多重比較

2.3 馬藍主要農藝性狀及主要成分的變異系數分析

由表2可知，不同居群的農藝性狀及主要成分含量存在明顯差異，變異系數由大到小依次為葉鮮重>莖干重>葉干重>莖鮮重>莖靛藍>根鮮重>二級分枝數>根干重>株鮮重>株干重>一級分枝數>根靛藍>根靛玉紅>葉寬>莖粗>葉長>株高>葉靛藍>莖靛玉紅>葉靛玉紅。葉鮮重、莖干重、葉干重、莖鮮重、莖靛藍、根鮮重、二級分枝數、根干重、株鮮重、株干重、一級分枝數、根靛藍、根靛玉紅、葉寬、莖粗的變異系數較大，均大于30%。葉長、株高、葉靛藍、莖靛玉紅、葉靛玉紅的變異系數較小，均小于25%，屬于較穩定的性狀，說明這些性狀不易受環境因子影響，主要由自身遺傳特性決定。

表2 馬藍主要農藝性狀及主要成分含量的變異系數分析

2.4 馬藍主要農藝性狀及主要成分的相關分析

由表3可知，株高與葉長呈極顯著正相關，與一級分枝數呈極顯著負相關；莖粗與莖鮮重、株鮮重、莖干重、株干重呈極顯著正相關，與根干重呈顯著正相關，與一級分枝數呈顯著負相關；葉長與葉寬呈極顯著正相關，與莖靛藍呈顯著正相關，與一級分枝數呈極顯著負相關，與二級分枝數、根鮮重呈顯著負相關；葉寬與一級分枝數、二級分枝數、根鮮重呈顯著負相關；一級分枝數與二級分枝數呈顯著正相關；二級分枝數與根鮮重、根干重、莖干重、株干重呈顯著正相關；根鮮重與莖鮮重、株鮮重、根干重、莖干重、株干重極呈顯著正相關，與葉靛藍呈顯著正相關；莖鮮重與株鮮重、根干重、莖干重、株干重極呈顯著正相關，與葉靛藍呈顯著正相關；葉鮮重與株鮮重、葉干重、莖靛玉紅、莖靛藍呈極顯著正相關，與根靛玉紅呈顯著正相關；株鮮重與根干重、莖干重、株干重呈極顯著正相關，與葉干重、葉靛藍呈顯著正相關；根干重與莖干重、株干重、葉靛藍呈極顯著正相關，與根靛藍呈顯著負相關；莖干重與株干重呈極顯著正相關，與葉靛藍呈顯著正相關；葉干重與莖靛藍呈極顯著正相關，與根靛玉紅、莖靛玉紅呈顯著正相關；株干重與葉靛藍呈顯著正相關；根靛玉紅與莖靛藍呈顯著正相關；莖靛玉紅與莖靛藍呈顯著正相關；根靛藍與莖靛藍呈顯著負相關。

表3 馬藍主要農藝性狀及主要成分含量的相關分析

續表3 Continued table 3

2.5 馬藍主要農藝性狀及主要成分的主成分分析

由表4可知，有4個主成分對馬藍的農藝性狀及主要成分含量影響最大，累計貢獻率達88.83%，表明可用4個主成分對其進行綜合評價。第1主成分的特征值為7.884，貢獻率為39.421。決定第1主成分的主要性狀包括莖干重、株干重、莖鮮重、根干重、株鮮重，屬于產量因子1。第2主成分的特征值為6.090，貢獻率為30.450%。決定第2主成分的主要性狀包括葉干重、葉鮮重，屬于產量因子2。第3主成分的特征值為2.449，貢獻率為12.245%。決定第3主成分的主要性狀是一級分枝數、根靛藍、根靛玉紅，屬于生長與品質因子。第4主成分的特征值為1.343，貢獻率為6.717%。決定第4主成分的主要是一級分枝數，屬于生長因子。

表4 馬藍主要農藝性狀及主要成分含量的主成分分析

續表4 Continued table 4

3 討 論

本研究結果表明，各馬藍居群根、莖、葉干重占株干重比值分別為12.37%～22.26%、52.03%～70.58%、9.16～35.60%，與侯惠嬋等[20]研究結果類似。株干重JP4最高達114.18 g，與JP2、JP3差異不顯著，二者均顯著高于JP1。從產量來說，馬藍居群JP4最優。藥用植物優良種質資源的選育不僅要考慮產量，亦要側重主要藥用成分含量[17]。本研究馬藍各部位的靛藍、靛玉紅含量排序呈葉>莖>根的規律，與羅丹冬等[9]和林文津[22]研究結果類似。馬藍整株靛玉紅含量JP3和JP4分別為5582.88和4748.99 mg，二者比JP1分別高224.60%和176.11%，比JP2分別高78.17%和51.56%；馬藍整株靛藍含量 JP3和JP4分別為34465.50和34065.56 mg，二者比JP1分別高242.58%和238.60%，比JP2分別高113.38%和110.91%。因此JP3與JP4馬藍綜合表現較好，可重點推廣栽培。

在篩選優良品種時，變異系數越大，表明遺傳多樣性越豐富，育種潛力越大[23]。本研究馬藍14個重要農藝性狀變異范圍為20.41%～61.33%，植株各部位2個主要活性成分含量的變異范圍為12.01%～56.37%，表明4個馬藍居群存在表型差異，具備優良種質選育的潛力。葉鮮重、莖干重、葉干重等15個主要性狀的變異系數較大，均大于30%。因此，選育馬藍優良品種，應優先考慮莖葉鮮干重大的品種。

利用各性狀的相關性和主成分排序對于選擇性育種的親本選擇具有積極作用[24]。前人對續斷[25]、人參[26]等研究表明，藥用植物農藝性狀間存在顯著的相關性，與化學有效成分的含量也存在相關性。本研究葉干重與葉鮮重、莖靛藍含量呈極顯著正相關，與株鮮重、根靛藍含量、莖靛藍含量呈顯著正相關，與梁晴等[25]、沈亮等[26]的研究結果類似。主成分分析結果顯示，14個重要農藝性狀和6個活性成分可歸納為4個主成分，累計貢獻率達88.833%，其中PC1載荷較高的指標為莖干重、株干重、莖鮮重、根干重、株鮮重，屬于產量因子1；PC2載荷較高的指標為葉干重、葉鮮重，屬于產量因子2。表明在影響馬藍質量的性狀中，產量因子對馬藍性狀選擇的可靠性要高于其它因子，與曾吳靜等[27]研究結果相似。該研究通過對金平4個馬藍居群的農藝性狀及主要活性成分進行多重比較、相關性分析和主成分分析，為馬藍優良品種選育提供參考。

4 結 論

4個馬藍居群各部位靛玉紅、靛藍含量排序均為葉>莖>根。莖粗與株鮮、干重呈極顯著正相關，與一級分枝數顯著負相關；二級分枝數與株干重顯著正相關；葉靛藍含量與根干重呈極顯著正相關，與株鮮、干重、呈顯著正相關，與根靛藍含量呈顯著負相關。通過主成分分析提出4個主成分，累計貢獻率為88.83%。在選育優良馬藍品種時，要重點考慮莖葉鮮干重大的品種。3號和4號馬藍居群是農藝性狀好且靛藍及靛玉紅含量較高的優質馬藍資源，可為馬藍的優良品種選育及種植推廣提供原料。