骨關節炎細胞自噬機制的相關藥物研究進展

袁長深，李哲，韋曉蕓，容偉明，官巖兵，梅其杰，段戡

(1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院骨三科，南寧 530023； 2.廣西中醫藥大學，南寧 530000)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種以軟骨細胞減少、軟骨下硬化和滑膜炎為特征的退行性關節疾病，衰老、肥胖、關節損傷及遺傳等是OA發生的主要風險因素[1]。隨著老齡化社會的加劇及肥胖癥患者的不斷增加，OA發病率正逐年上升[2-3]。OA防治已成為全世界亟須解決的公共衛生問題和社會問題。目前藥物治療僅能改善疾病癥狀，尚無有效方法阻止OA進程，一些國家將OA防治作為區域衛生政策的優先事項對待，甚至建議通過修訂有關OA臨床和公共政策加以重視[4]。因此，深入研究OA發病機制對于探索新的治療靶點至關重要。

OA發病原因尚不明確，其主要病理表現為軟骨細胞凋亡和細胞外基質丟失；維持軟骨正常的生理結構和功能是治療OA的關鍵。自噬作為一種重要的細胞穩態機制，可通過清除受損和功能失調的細胞器和大分子維持OA軟骨內環境的穩定。自噬通過增強體內平衡機制，可有效減緩OA軟骨退變和降低OA風險[5]。因此，使用藥物增強OA自噬、延緩OA進程成為OA治療的新的研究熱點。目前有關OA自噬的研究尚處于起步階段，關于藥物調控OA自噬的研究報道很少?，F對OA細胞自噬機制的相關藥物研究進展予以綜述，以期為OA自噬研究提供新思路。

1 OA自噬的機制

自噬是細胞“回爐重造”的過程，通過將部分受損或老化的細胞質及細胞器隔離到一個雙層膜囊泡后轉運至一個可降解的細胞器中，分解產生代謝物并回收利用，以滿足細胞自身代謝需要和某些細胞器的更新[6]。

unc-51樣激酶1、Beclin1和微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)在正常人和小鼠關節軟骨中均有表達[7]，且正常成人軟骨中的適度自噬不僅能夠控制軟骨細胞的成熟速度，還能夠對軟骨細胞生命周期的末期階段進行調節[8]。在OA退變的初始階段，受到分解代謝、氧水平及營養水平等變化的影響，自噬會應激性增加。短暫增加的自噬只是作為一種適應性補償反應，對軟骨健康起積極作用；而隨著OA病情的不斷加重，應激性增加的自噬難以繼續代償，導致OA退變進一步加重[9]。OA中晚期，軟骨中LC3、Beclin1、unc-51樣激酶1、自噬相關基因5表達下降，細胞凋亡增加，細胞外基質合成減少[7]。由于自噬水平下調，軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白(collagen type Ⅱ，Col Ⅱ)、聚集蛋白聚糖基因和相關蛋白表達下降，基質金屬蛋白酶13、帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解聚蛋白樣金屬蛋白酶5基因表達上調，OA進展加速[7,10]。通過活細胞熒光示蹤技術也發現，軟骨細胞自噬受到抑制后，引起大量Col Ⅱ前體在內質網蓄積，導致軟骨基質中Col Ⅱ纖維結構形成缺失，說明軟骨細胞自噬調控Col Ⅱ分泌，影響軟骨基質正常結構[11]。自噬參與OA發病，影響OA發展進程，是維持軟骨細胞健康狀態的重要機制。因此，從軟骨細胞自噬著手，通過激活軟骨細胞自噬活性，可有效逆轉自噬失代償狀態，為防治OA退變提供了一種有效方式。

2 調控OA自噬的相關藥物

目前使用傳統藥物治療只能改善OA癥狀，并不能有效截斷或逆轉OA病程進展。隨著對自噬的深入研究發現，在適當時間激活自噬能有效延緩OA退變，因此針對OA自噬的相關藥物研究陸續開展，并獲得了一定的治療效果。

2.1中藥復方 中藥復方通過藥物多靶點發揮作用治療OA，但存在干擾因素多、作用機制復雜、研究難度較大等特點。近年來，使用中藥復方調控自噬治療OA的研究不斷增加，為OA自噬作用機制提供一定的理論依據。

2.1.1四妙散 四妙散是治療OA濕熱阻絡、寒濕痹阻證的經典方劑。目前研究多為臨床觀察，對其作用機制的研究甚少。既往認為，四妙散治療OA的作用可能與降低炎癥因子有關[12]。研究表明，四妙散可能通過激活自噬抑制軟骨細胞凋亡，發揮對OA的防治作用。沈金明等[13]通過前交叉韌帶切斷術建立膝OA大鼠模型，發現模型組軟骨細胞凋亡相關蛋白Fas相關死亡結構域蛋白、胱天蛋白酶3的表達水平較正常組升高，自噬相關蛋白LC3表達降低；而使用四妙散干預后，Fas相關死亡結構域蛋白、胱天蛋白酶3表達顯著降低，LC3表達升高，表明四妙散通過激活軟骨細胞自噬延緩膝OA退變，這為研究四妙散對OA的作用機制提供了新的參考點。

2.1.2右歸丸、右歸飲 右歸丸、右歸飲是治療陽虛寒凝型OA的代表方，療效確切，可降低血清中炎癥因子的表達[14-15]、減緩軟骨組織Col Ⅱ丟失[16]或抑制Wnt信號通路[17]、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)/核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路[18]。

右歸丸、右歸飲治療OA的作用機制可能與自噬關系密切。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬的主要負調控因子，而Beclin1在軟骨中低表達，研究認為，mTOR和Beclin1可能是治療OA的新靶點。顏春魯等[19]使用改良Hulth法建立動物模型，在手術造模6周后使用低、中、高劑量的右歸丸干預8周發現，軟骨細胞中PI3K、磷酸化的Akt和磷酸化的mTOR等蛋白的表達明顯降低，自噬相關因子Beclin1表達升高，且高劑量組效果佳，提示右歸丸可能通過調控自噬對OA發揮作用。同時，OA中炎癥因子和基質金屬蛋白酶大量表達，其與自噬通路激活的相關性尚不明確。為明確自噬與炎癥因子的關系，黃楊等[20]直接從滑膜入手研究OA，結果發現，右歸飲也可抑制OA中mTOR的表達，并增強Beclin1的表達，降低血清炎癥因子[白細胞介素(interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子-α等]水平，緩解OA模型炎性浸潤，減少軟骨破壞。

右歸丸、右歸飲治療OA的具體作用機制尚不明確，但動物研究均顯示，高劑量右歸丸、右歸飲治療組的OA治療效果最佳[14-19]。因此，藥物劑量可能是右歸丸、右歸飲有效治療OA的關鍵，但其最低有效治療劑量尚不清楚，可能成為未來研究的關注點。

2.1.3新風膠囊 新風膠囊具有抗炎鎮痛的作用，可有效改善OA患者癥狀、提升OA患者生活質量，可能與增強膝OA患者外周血B、T淋巴細胞衰減因子表達、降低T細胞活化、減輕炎癥和氧化應激損傷有關[21]；此外，通過抑制NF-κB信號通路降低炎癥反應可能也是其作用機制[22]。動物實驗發現，與膝OA模型對照組相比，在使用臨床患者10倍用量的新風膠囊劑量灌胃1個月后，新風膠囊組膝OA大鼠免疫球蛋白G1、免疫球蛋白G2α、腫瘤壞死因子-α表達降低，IL-4及自噬相關基因表達升高，軟骨細胞形態、細胞器、線粒體等趨于正常[23]，說明新風膠囊可抑制OA炎癥、調節自噬水平，可防治OA。

2.1.4桃仁膝康丸 桃仁膝康丸具有祛風濕、止痹痛、補肝腎的功效，可有效緩解OA早期癥狀，通過提高超氧化物歧化酶活性降低血清丙二醛及一氧化氮水平，減輕氧自由基對軟骨的損傷，緩解炎癥反應，從而有效激發軟骨細胞功能恢復及軟骨再生，達到保護軟骨的目的[24]。鑒于氧化應激與自噬關系，有學者嘗試從自噬探討其作用機制。秦娜等[25]通過采用改良Hulth法制造動物模型，使用桃仁膝康丸干預OA大鼠模型12周，結果顯示，桃仁膝康丸組OA大鼠模型軟骨中unc-51樣激酶1、LC3-Ⅱ和Beclin1等自噬標志蛋白的表達明顯升高；而桃仁膝康丸+自噬抑制劑3-甲基丙烯酸甲酯組unc-51樣激酶1、Beclin1和LC3-Ⅱ表達部分抑制，提示桃仁膝康丸可通過激活OA自噬延緩或阻止OA軟骨退變。上述研究揭示了桃仁膝康丸的分子機制，為桃仁膝康丸的臨床應用提供了基礎藥理學依據，但自噬的調節過程復雜，桃仁膝康丸激活OA自噬的機制仍需深入研究。

2.2中藥提取物 與中藥復方相比，中藥提取物在OA自噬中的作用更易理解，因此對中藥提取物在OA自噬中作用的研究相對較多。中藥有效成分調控OA自噬試驗的不斷開展有助于闡明中藥提取物調控OA自噬的作用機制。

2.2.1姜黃素 姜黃素是治療OA的有效藥物，能改善視覺模擬評分及西安大略和麥克馬斯特大學骨關節炎指數量表評分，且副作用低[26]。姜黃素通過影響炎癥、凋亡和氧化途徑作用于OA，主要與抑制NF-κB信號通路[27]、釋放核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體[28]、下調間充質溶解素表達[29]、阻斷線粒體依賴的凋亡途徑[30]、激活促進沉默信息調節因子2相關酶1、抑制內質網應激[31]、激活酪氨酸蛋白激酶2/信號轉導及轉錄活化因子3信號通路[32]有關。另有報道認為，姜黃素與外泌體關系密切[33]。

自噬是姜黃素治療OA不可或缺的機制之一。體外實驗表明，IL-1β干預的軟骨細胞活力下降；姜黃素干預后，IL-1β對軟骨細胞生長的抑制作用改善，其可激活促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調節激酶1/2通路，上調胞外信號調節激酶1/2、LC3-Ⅱ及Beclin1的表達，以誘導細胞自噬[34]。動物研究顯示，姜黃素可提高動物模型中自噬相關標志物LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin1的表達，抑制mTOR(Ser2448)和Akt(Ser473)的磷酸化，證實姜黃素可通過Akt/mTOR途徑調控OA軟骨細胞自噬，減少軟骨細胞凋亡[35]。姜黃素治療OA的生物利用度較低，限制了其臨床應用[36]。未來應深入探索姜黃素治療OA的作用機制，明確其最佳使用方式及治療劑量，以廣泛應用于臨床。

2.2.2青藤堿 青藤堿具有消炎、鎮痛、免疫抑制等作用，廣泛用于OA治療，但其具體作用機制尚不明確。有報道稱，青藤堿可激活核轉錄因子紅系2相關因子2/血紅素加氧酶1信號通路，抑制小鼠軟骨細胞NF-κB活性[37]；并可能通過激活miR-223-3p抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體信號轉導[38]。為進一步探明青藤堿治療OA的機制，鄭潔等[39]成功建立OA模型后，對低、中、高劑量青藤堿組分別注射10次低、中、高劑量鹽酸青藤堿注射液，結果顯示，中、高劑量青藤堿組LC3-Ⅱ和Beclin1表達顯著高于模型組及低劑量青藤堿組，且PI3K、Akt和mTOR等表達下調，提示中、高劑量的青藤堿可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路調控OA關節軟骨自噬。

2.2.3冬蟲夏草素 冬蟲夏草素是中藥蛹蟲草中分離出的一種天然核苷類似物，具有促進細胞分化和抗凋亡等功能，在防治OA中起重要作用。既往認為，冬蟲夏草素通過抗炎作用保護關節軟骨[40]。夏晨[41]的研究發現，冬蟲夏草素能有效逆轉OA軟骨損傷，與激活自噬、抑制軟骨機制降解密切相關，為冬蟲夏草素防治OA提供了重要的理論依據。

2.2.4芍藥苷 芍藥苷具有抗炎、抗氧化、免疫調節等作用，可能通過抑制凋亡和炎癥防治OA[42-43]。自噬也是芍藥苷的重要機制之一，姚旭等[44]將人軟骨細胞C28/I2進行培養，經IL-1β誘導軟骨炎癥時，細胞內LC3-Ⅱ和Beclin1表達下降。經芍藥苷處理后，LC3-Ⅱ和Beclin1的表達增加，磷酸化PI3K和磷酸化Akt表達降低；而3-甲基丙烯酸甲酯可部分拮抗磷酸化PI3K和磷酸化Akt蛋白的降低，提示芍藥苷通過抑制PI3K/Akt通路促進軟骨細胞自噬，減輕軟骨細胞損傷。

2.2.5其他中藥提取物 Liu等[45]認為，黃芪甲苷可通過激活軟骨細胞自噬活性逆轉IL-1β對細胞增殖的抑制，并促進細胞凋亡；黃芩苷通過miR-766-3p/重組人線粒體凋亡誘導因子1軸激活自噬，上調Beclin1表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，從而減輕IL-1β誘導的OA軟骨細胞凋亡和細胞外基質降解[46]。Jiang等[47]研究發現，雙氫青蒿素可能通過抑制NF-κB途徑激活自噬。

2.3現代醫學藥物 現代醫學使用藥物調控OA的歷史悠久，但通過自噬研究藥物對OA的療效仍處于初步階段。減輕藥物毒性可能是未來通過提高不同藥物誘導軟骨細胞自噬的能力，進而提高藥物的生物利用度的研究方向，將為未來臨床應用提供堅實的理論基礎。

2.3.1氨基葡萄糖 氨基葡萄糖是關節軟骨的天然組成成分，也是軟骨細胞的營養素，存在于關節軟骨及關節滑液中。人體內氨基葡萄糖缺乏的嚴重程度與年齡呈正相關，故認為合理補充氨基葡萄糖(1 500 mg/d)可改善OA癥狀[48]，并可有效預防早期、中期膝OA的發生；長期服藥(超過3年)可顯著降低關節結構變化的進展[49]，從而治療OA。

氨基葡萄糖治療OA的有效性可能與激活OA軟骨細胞自噬密切相關。自噬初始階段存在代謝和饑餓應激狀態[50]。Caramés等[51]在體外實驗中使用氨基葡萄糖(0.1～10 mmol/L)處理人正常軟骨細胞，發現LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈劑量依賴性增加，表明氨基葡萄糖可激活正常人軟骨細胞的自噬；而在體內實驗中，饑餓狀態或腹腔注射氨基葡萄糖均能激活綠色熒光蛋白-LC3轉基因小鼠的自噬，小鼠軟骨中綠色熒光蛋白-LC3信號隨食物限制和腹腔注射氨基葡萄糖而顯著增加，但腹腔注射氨基葡萄糖小鼠的自噬水平明顯升高，表明氨基葡萄糖是體內外自噬的有效激活劑。

氨基葡萄糖對軟骨細胞自噬具有時間依賴性的雙重作用，即短期內氨基葡萄糖可激活自噬(稱為短期反應)，但長期使用可抑制自噬反應(稱為長期反應)，臨床上存在氨基葡萄糖劑量差異導致治療效果截然不同[52-54]，說明氨基葡萄糖有效劑量及治療時間可能是其治療OA的關鍵[55]。氨基葡萄糖治療OA的Meta分析表明，氨基葡萄糖治療OA有效，但其療效異質性尚不明確[56]。

2.3.2糖皮質激素 對于重度疼痛或治療后疼痛無緩解甚至持續加重的OA患者，建議關節腔內注射糖皮質激素，以短期緩解疼痛，但不宜多次注射[57]。長期、反復或大劑量使用糖皮質激素可因自噬誘導過度而導致細胞活力降低，從而改變軟骨代謝，加速軟骨細胞凋亡，加重OA病情。

自噬可能是糖皮質激素治療OA的重要機制之一。體外實驗發現，1 μmol/L或40 μmol/L地塞米松處理N1511軟骨細胞24～48 h，N1511軟骨細胞的存活率無明顯變化，而200 μmol/L和1 μmol/L地塞米松能明顯降低N1511軟骨細胞的存活率；使用100～400 μmol/L的3-甲基丙烯酸甲酯可明顯改善200 μmol/L或1 μmol/L地塞米松引起的N1511軟骨細胞活力降低，表明地塞米松可通過自噬降低N1511軟骨細胞活力[58]。為明確上述機制，Liu等[59]進行深入研究發現，地塞米松作用于軟骨細胞6 h后，軟骨細胞自噬能力增強，24 h后達到最大值，而地塞米松持續暴露導致軟骨細胞自噬活性下調，說明短期糖皮質激素治療可激活自噬，但長期糖皮質激素治療的效果較差，這可能與GC誘發細胞衰老[60]、導致細胞功能失調、誘發細胞凋亡相關。因此，糖皮質激素與自噬作用及自噬調控可能是未來防治糖皮質激素長期治療副作用的重點研究方向。

2.3.3雷帕霉素 mTOR是自噬的負性調控因子，在自噬過程、多種分子作用機制及信號調控通路中起關鍵作用，而雷帕霉素是mTOR敏感性最高的抑制劑之一。體外實驗顯示，經雷帕霉素(100 nmol/L)預處理1 h后使用IL-18處理24 h的軟骨細胞自噬相關蛋白7的水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯提高，而p62水平降低；此外，凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白表達和胱天蛋白酶3/9的活性降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達增加，表明雷帕霉素可通過恢復被抑制的自噬活性有效防止IL-18誘導的軟骨細胞凋亡[61]。

體內實驗證實，連續10周腹腔注射雷帕霉素OA模型小鼠的軟骨細胞數量明顯增加，mTOR復合物1下游靶點核糖體蛋白S6的磷酸化水平降低；LC3抗體染色顯示，雷帕霉素處理后，LC3表達增加，軟骨自噬明顯激活，表明雷帕霉素可通過激活自噬降低實驗小鼠OA的嚴重程度[62]，這為進一步研究雷帕霉素調控OA自噬提供了理論依據。

2.3.4帕瑞昔布 帕瑞昔布是新型非甾體抗炎藥，副作用少、針對性強，不僅具有傳統非甾體抗炎藥消炎鎮痛的作用，還能夠有效保護關節軟骨，目前帕瑞昔布多用于鎮痛，但對其在OA中作用機制的研究甚少。有學者試圖探究帕瑞昔布能否通過自噬對OA起作用，通過Hulth法造模，對治療組連續12周腹腔注射帕瑞昔布，結果顯示，治療組OA軟骨的損傷明顯減輕、Mankin評分降低、自噬相關蛋白Beclin1表達量升高，提示帕瑞昔布可能通過增強軟骨細胞自噬延緩OA退變[63]。這為新型非甾體抗炎藥的使用提供了新思路。

2.3.5其他 二甲雙胍通過升高AMP活化的蛋白激酶α磷酸化水平上調沉默信息調節因子1的表達，增加自噬對OA的保護作用[64]。飛燕草素可通過激活自噬保護氧化應激時的軟骨細胞損傷[65]；而花青素則可通過激活自噬減輕過氧化氫誘導的大鼠軟骨細胞損傷[66]。此外，多種藥物可通過調控自噬作用于OA。

3 小 結

目前OA的發病機制尚不明確，藥物治療主要以對癥治療為主，而自噬在OA防治中起重要作用。利用藥物調控自噬可有效延緩OA發展進程，這可能成為防治OA的新方法，亦可能是未來防治OA的有效途徑。目前藥物調控OA自噬的研究多集中于動物研究階段；臨床研究仍以單中心研究為主，缺乏評估藥物療效的多中心、大樣本隨機對照研究，因此進行多中心、大樣本隨機對照研究，減少樣本異質性，精準調控自噬可能是未來的研究方向。