PI3K/AKT/mTOR信號通路參與脊髓損傷后神經元自噬的研究進展

孫瑞欣 ，趙帥帥 ，申宇哲，梁家興 ，楊彥玲△

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）通常會導致永久性的功能損害，其主要表現為炎癥加重、膠質瘢痕和神經元死亡。脊髓的原發性機械損傷會引發炎性細胞浸潤和小膠質細胞激活等繼發性損傷［1］。研究顯示，世界各地的SCI 發病率為百萬分之三到萬分之二［2］，粗略估計我國每年大約有1萬人發生SCI［3］。目前，SCI 尚缺乏有效的治療方法。研究表明，抑制SCI 后大鼠神經細胞凋亡以及促進自噬減少自噬小體的積累均可減少SCI后神經元損傷并促進運動功能的恢復［4］。SCI 后產生的炎癥相關細胞因子Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）和白細胞介素（interleukin，IL）-6是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信號通路的重要上游調節因子。PI3K/AKT/mTOR 信號通路是細胞響應胰島素、胰島素樣生長因子1、成纖維細胞生長因子和表皮生長因子等細胞外刺激的主要細胞信號樞紐，參與細胞的營養吸收、合成代謝等多種過程，在細胞的存活、增殖、生長、代謝、轉移和血管生成等方面起著至關重要的作用［5］。目前，靶向調節PI3K/AKT/mTOR 信號通路對研究和治療SCI有較好的前景。本文綜述了PI3K/AKT/mTOR 信號通路在神經元自噬過程中的作用機制及其對SCI 的調控作用，以期為相關研究提供新思路。

1 自噬

1.1 自噬概述 生物體需要通過不斷合成和降解物質來維持自身內環境的穩態，其中自噬發揮了重要的作用，它是一種細胞利用溶酶體將自身物質降解，使之得以循環利用的現象。根據被降解的細胞內容物運輸到溶酶體方式的不同，自噬分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）［6］。巨自噬是主要的自噬形式，主要包括以下4個步驟：隔離膜或吞噬泡形成，吞入一部分細胞質形成自噬體（雙層膜細胞器），外層自噬體膜和溶酶體融合，在自噬溶酶體內溶酶體酶降解自噬體內膜和細胞器［6-8］。巨自噬流（autophagic flux）是以上4個步驟在細胞內不斷變化的一個動態過程，其中任何一個環節有偏差均會影響細胞的狀態，它不僅參與細胞代謝，還與蛋白代謝和蛋白毒性密切相關，適當的自噬會保護細胞，防止代謝應激和氧化損傷，但自噬過度可能導致代謝應激、細胞成分降解，甚至細胞死亡［9］。微自噬是由溶酶體膜內陷，直接吞噬細胞質內容物后進行分裂降解的現象。CMA是一種選擇性的自噬，它需要分子伴侶的協助才能完成跨溶酶體膜的轉運。

1.2 神經元自噬標志物 自噬相關蛋白（autophagy-related protein，Atg）參與調節自噬的誘導、起始、延伸以及自噬體的降解等過程。哺乳動物Beclin1基因與酵母Atg6基因同源，在3-磷酸磷脂酰肌醇單磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P）的生成過程中起重要作用，而PI3P 可以募集其他Atg 并結合到早期隔離膜或吞噬泡上，表明Beclin1在自噬和溶酶體的轉運中起重要作用［10］。PI3P 的作用是與Ⅲ類PI3K結合，參與自噬早期的前雙層膜形成，從而啟動自噬［11］。目前，研究最廣泛的自噬分子標志物為Atg8/微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein1 light chain 3，LC3），在自噬進展的過程中起重要作用，當自噬被誘導時，胞質可溶的LC3-Ⅰ與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）結合后，在自噬體膜上轉化為LC3-Ⅱ；在自噬溶酶體的形成過程中，LC3-Ⅱ逐漸被降解清除，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ與自噬體的數量呈正相關，常被視為自噬形成的標志，也可以用來監測自噬的進程［9,12］。選擇性自噬體膜受體蛋白（sequestosome-1，SQSTM1）也叫p62 蛋白，它在所有組織中均有表達并且廣泛分布于細胞質、細胞核、線粒體、自噬體和溶酶體中，可識別泛素化的錯誤折疊蛋白和受損的細胞器，當這些泛素化的錯誤折疊蛋白和受損的細胞器被p62 識別后，通過LC3-Ⅱ的招募，和p62 一起被轉運至自噬溶酶體并降解［4，13］。因此，可以通過p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ來判斷自噬溶酶體的活性和自噬通量的強度［12，14］。

2 PI3K/AKT/mTOR信號通路

近年來研究發現，通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路可以激活神經元自噬，促進SCI后神經元的修復［15］。PI3K分子可被生長因子激活而磷酸化。目前，根據結構、功能和底物偏好不同，PI3K可分為3類：Ⅰ類 PI3K 接受酪氨酸激酶（receptor tyrosinekinase，RTK）和G 蛋白偶聯受體（guanosine-binding protein coupled receptor，GPCR）的信號后，可催化磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol bisphosphate，PIP2）生成磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol trisphosphate，PIP3），然后PIP3 進一步激活AKT（又稱蛋白激酶 B；protein kinase B，PKB）［16-17］，PI3K/AKT通路特指Ⅰ類PI3K；Ⅱ類PI3K可能影響葡萄糖轉運、細胞遷移、膜轉運調節、胰島素信號傳導和受體 內 化 ，還 可 磷 酸 化 磷 脂 酰 肌 醇（phosphatidylinositol，PI），但不磷酸化 PIP2；Ⅲ類PI3K目前己知的只有一種，被認為可以控制溶酶體成熟、自噬流和胞質分裂等多種膜轉運功能，激活Ⅲ類PI3K可以促進自噬，能使PI磷酸化為PI3P［5，16，18］。

磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue，PTEN）是 PI3K 的拮抗劑，可以將PIP3脫磷酸化變為PIP2，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的啟動［19］。AKT 是一種細胞內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其PH結構域為存在于多種信號轉導蛋白和細胞骨架蛋白中的大約由120個氨基酸組成的功能性區域，可以與Ⅰ類PI3K 產生的PIP2 和PIP3 相互作用，使AKT 從胞質轉移到胞膜并被激活，啟動PI3K/AKT/mTOR 通路，進而激活mTOR，抑制自噬［18,20］。PI3K/AKT/mTOR途徑是mTOR活化和發揮功能的主要途徑之一［21-22］。mTOR 通過與 mTOR 復合物（mTOR Complex，mTORC）1 和 mTORC2 的關鍵組分如雷帕霉素靶向蛋白調節相關蛋白（regulatoryassociated protein of mammalian target of rapamycin，Raptor）、雷帕霉素不敏感伴隨物（rapamycininsensitive companion of mTOR，Rictor）、哺乳動物致死性 SEC13 蛋白 8（mammalian lethal SEC13 protein 8，mLST8）和哺乳動物應激激活的蛋白激酶反應蛋白 1（mammalian stress-activated protein kinase interacting protein，mSIN1）作用，催化 S6 激酶（S6 kinase beta-1，S6K1）、真核細胞起始因子4E（eIF4E）結合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4E-BP1）和自噬啟動蛋白1（unc-51-like kinase 1，ULK1）等多個靶標的磷酸化，從而調節蛋白合成、營養代謝、生長因子信號傳導、細胞生長和遷移以及自噬調節等，其中ULK1 還可以和其互作蛋白Atg13 和Atg101 等形成自噬調節復合物［23-24］。mTORC1 可調節蛋白質合成和細胞的生長、增殖、代謝以及應激反應，mTORC1 中富含AKT的底物，當PI3K/AKT被激活時，mTORC1活化，通過磷酸化下游效應因子S6K1 和4E-BP1 來促進蛋白質、脂質和核苷酸的合成代謝過程，同時，通過ULK1抑制分解代謝程序，使自噬調節復合物失活，從而抑制自噬；mTORC2 可以調節細胞凋亡和肌動蛋白細胞骨架的重新排列，它通過mSIN1 和AKT 形成一個正反饋環路，即AKT 的部分激活促進mTORC2 的激活，而mTORC2 磷酸化并完全激活AKT，被激活的AKT 可以通過磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1）將AKT 的第308 位的蘇氨酸磷酸化，促進細胞存活［23，25-26］。

3 PI3K/AKT/mTOR 信號通路與自噬在SCI 修復中的作用

PI3K/AKT/mTOR 信號通路是一個經典的自噬激活途徑。研究顯示，褪黑素（melatonin，MT）通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路，在急性SCI 后第7天降低了凋亡激活蛋白（活性Caspase-3 和活性Caspase-9）的表達和凋亡神經元的數量，而增加了自噬激活蛋白（LC3 和Beclin-1）的表達和神經元的數量，在大鼠SCI 后第7 天開始改善運動功能障礙［27］。然而，過度的自噬可能會導致神經元死亡。研究發現，當自噬過度時，可通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路來抑制過度自噬，從而促進神經元的存活［28］。

3.1 對自噬流的調節 由于繼發性損傷是SCI后加重的主要因素，自噬在繼發性損傷過程中的作用也各不相同，但越來越多的證據表明自噬在SCI 中的作用大多是有益的［29］。由于自噬功能的實現取決于自噬流，在大多數SCI 中的自噬流受到抑制的情況下，自噬有可能導致神經元死亡并加劇炎癥反應、氧化應激和微循環障礙［30］。Li 等［31］研究發現，SCI 模型大鼠在經過姜黃素治療后，膠質瘢痕形成和炎癥反應減輕，脊髓髓鞘形成改善，并且姜黃素可以促進SCI 后自噬流的誘導，抑制AKT/mTOR 信號通路的激活，這表明姜黃素可以通過抑制AKT/mTOR 途徑來誘導自噬，促進自噬流量恢復，從而促進SCI后的運動功能恢復，減少神經元凋亡。有研究對SCI 模型兔行減壓手術后發現，兔的運動功能有恢復趨勢，并且逆轉了SCI 引起的p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR蛋白的上調，AKT/mTOR通過調節自噬流，促進了自噬體膜上LC3 Ⅱ的生成，并在自噬溶酶體形成后促進了LC3-Ⅱ和p62 降解，從而恢復了自噬流以減輕神經元凋亡，促進了SCI后的恢復［32］。

3.2 調節內質網應激 目前，對內質網的研究也是一大重點，SCI后導致的持續的內質網應激超過未折疊蛋白反應的補償，往往會對神經元產生不利影響。內質網應激和自噬之間存在著一定的關系。Wang等［33］用神經生長因子（nerve growth factor，NGF）誘導PC12 細胞建立SCI 模型，發現4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）可 以 通 過 PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制內質網應激，從而負向調控自噬；當內質網應激抑制該通路時，NGF 誘導的PC12細胞機械損傷早期會增加細胞自噬和減少細胞凋亡，證實了通過該通路抑制內質網應激可增加自噬，這為SCI的治療提供了新的思路。

3.3 抑制神經元凋亡 神經元凋亡可導致瘢痕形成、組織損傷和運動功能障礙等。Li等［27］研究顯示，MT可增加自噬激活蛋白的表達，降低SCI后神經元凋亡激活蛋白的表達水平，改善SCI后第7天大鼠的運動功能，MT 可通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路增強神經元自噬，抑制細胞凋亡來改善運動功能障礙。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）鋅指蛋白反義鏈 1（ZNFX1-antisence 1，ZFAS1）是一種競爭性內源性RNA，可與共享的非編碼小分子RNA（microRNAs，miRNAs）結合，從而調節信使 RNA（mRNAs）的表達。Chen 等［34］發現，在SCI 小鼠的脊髓組織中ZFAS1表達上調，而miR-1953 表達下調；PTEN 是 miR-1953 的一個潛在靶點，miR-1953 可以通過靶向 PTEN 的 3'UTR 負調控PTEN的表達；與SCI小鼠相比，敲除ZFAS1的SCI小鼠miR-1953 表達水平升高，運動功能改善，促炎因子水平降低，脊髓神經元的凋亡減少；與僅敲除ZFAS1的 SCI 小鼠相比，同時抑制 miR-1953 或同時過表達PTEN后，消除了敲除ZFAS1對SCI小鼠脊髓神經元凋亡和炎癥的抑制作用；該研究認為ZFAS1可通過與miR-1953 結合，調節PTEN/PI3K/AKT 通路，抑制脊髓神經元的凋亡，并促進SCI的恢復。另有研究發現，機械損傷后脊髓神經元中的AKT 快速增加，mTOR 的磷酸化水平快速上調，從而抑制了PI3K/AKT/mTOR 信號轉導通路，增加了自噬水平，使線粒體膜電位降低，細胞凋亡減少，表明PI3K/AKT/mTOR 信號通路還可以通過調控自噬來調節SCI后的線粒體凋亡，從而促進神經恢復［15］。

3.4 抗炎癥反應 自噬過程中的LC3、Beclin-1 蛋白以及凋亡反應中的Caspases家族、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和B淋巴細胞瘤-2 家族（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白通過 PI3K/AKT/mTOR 信號通路參與炎癥反應［35］。Zhang 等［36］對SCI 后SD 大鼠尾靜脈注射外周巨噬細胞衍生的外泌體（peripheral macrophages-derived exosomes，PM-Exos）發現，PM-Exos 組脊髓功能和恢復情況優于注射相同劑量磷酸鹽緩沖溶液的對照組，并且其機制的關鍵因素是通過下調PI3K/AKT/mTOR 信號通路來激活和促進小膠質細胞自噬，從而增加抗炎型小膠質細胞極化，刺激局部小膠質細胞的抗炎特性，發揮對SCI的保護作用。

3.5 促進髓鞘再形成 SCI后運動和生理功能障礙的一大原因是軸突脫髓鞘，導致軸突延長障礙并且備用回路減少，而少突膠質細胞最突出的生理功能是在神經元周圍形成緊密的髓鞘。因此，少突膠質細胞的變性是SCI脫髓鞘和軸突功能障礙的主要因素 。 Ding 等［37］研 究 證 實 ，神 經 調 節 蛋 白 -1（neuregulin，Nrg1）可以通過激活反應性星形膠質細胞表面的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）從而增強細胞內信號級聯轉導的PI3K/AKT/mTOR 通路功能，促進髓鞘和少突膠質細胞相關基因的表達，從而將反應性星形膠質細胞轉化為少突膠質細胞樣細胞，促進SCI 的修復。Liu等［38］研究證實，雷帕霉素干預SCI小鼠后自噬增強，促使 SCI 后 Beclin-1、LC3 表達升高，p62 表達降低，并增加了脊髓白質的完整性，減少了膠質瘢痕的形成和脊髓組織的損失，增加了SCI 后小鼠軸突和雪旺細胞相關髓鞘的數量，使小鼠運動功能得到改善，并降低了小鼠體質量，雷帕霉素可以通過抑制mTOR和增強自噬來減輕SCI后的炎癥反應，促進少突膠質細胞的恢復和髓鞘的形成，限制軸突變性。

3.6 促進軸突再生 Chen 等［39］研究發現，SCI 急性期至亞急性期星形膠質細胞PI3K/AKT/mTOR 通路被激活并可能參與了膠質瘢痕的形成；SCI 后PTEN的過表達下調了硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）的表達水平，改善了損傷部位的軸突再生，腺病毒載體過表達PTEN 可減輕膠質細胞增生，減少脊髓中神經膠質瘢痕的形成，改善 SCI 后的運動功能。Yin 等［40］證實，miR-29a 可降低PTEN表達，促進AKT磷酸化，提高軸突的生長能力，過表達miR-29a 則可增加AKT 和通路下游次級結合蛋白S6 磷酸化，促進軸突再生相關關鍵標記蛋白neurofiament-200 的表達，從而促進損傷中心的軸突再生和突觸形成，并最終促進運動功能的恢復。

4 小結

目前，自噬在SCI 后繼發性損傷的作用機制仍缺乏廣泛的研究。自噬在神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞中均發揮了重要作用。SCI 后PI3K/AKT/mTOR 信號通路被過度激活，導致自噬受到抑制，加重了錯誤折疊蛋白和炎性因子等的蓄積，而且神經元損傷后的自我修復能力非常微弱。PI3K/AKT/mTOR 作為自噬的經典信號通路之一，可以調節神經元生長和分化的信號并啟動自噬相關基因，抑制該通路可以增加Beclin1蛋白等的表達，從而激活神經元自噬，調節神經元分化與增殖、減輕炎癥和抑制神經元凋亡，促進脊髓損傷后神經元修復，從而能在一定程度上減輕病情。