農業微生物細菌發酵工藝研究進展

李 恒,萬邦隆，董 蕓，孫玉翠，李洪姝

(云南云天化股份有限公司研發中心，云南 昆明 650228)

進入21世紀以來，我國大力生產有機綠色產品，推崇發展健康綠色農業。正是由于人們健康和環保意識的逐步增強，開始對食品安全、土壤安全、環境保護等加以重視。這就要求我們在促進農作物生長時，不僅要提高產量，也要注重產品質量，而且還不能造成有害物質產生和積累，不污染土壤和環境。因此迫使我們尋找一種能夠降低化肥施用量，提高農作物的產量和農產品的質量，降低農產品中有害物質含量的健康環保的物質。研究顯示,農業微生物恰好具有促進有機質腐熟、提高土壤養分、減少土壤重金屬的富集、促進農作物生長、減少病蟲害發生、提高作物品質等作用。因此，農業對農業微生物類試劑、肥料的需求將大大增加。加之，國家大力實施化肥、農藥零增長行動，促進節本增效、節能減排,保障國家糧食安全、農產品質量安全和生態環境安全，實現農業可持續發展，這為研究農業微生物提供了一個很好的發展機遇。目前，農業微生物類試劑和肥料活躍在國家生態示范區、綠色和有機農產品基地等，它們正在農業生產中取得越來越明顯的經濟效益、社會效益和生態效益。

1 農業微生物的發展及細菌發酵的意義

我國是一個農業大國，種植作物、地理環境、病蟲害發生及其復雜多樣。加之，傳統農業化肥施用量大，使用結構不合理，施用技術粗放等，使得化肥利用率低，并造成環境的污染惡化和土壤生境產力的下降。生態環境治理和農業健康可持續發展迫在眉睫，這為農業微生物的研究與應用提供了一個良好的契機。

目前，農業微生物研究工作主要包括肥效微生物、生防微生物、飼料/酶制劑微生物、環境/能源/轉化微生物等的資源開發、監測、評價、發酵工藝研究等。我國的農業微生物研究工作起步較早，但發展相對緩慢。自改革開放以來，我國農業微生物在微生物肥料、微生物飼料、微生物農藥、微生物降解和微生物活性物質等多個領域均取得了較大進步，但我國農業微生物基礎研究較弱，評價、效應監測、功能篩選與發酵工藝等技術手段不規范，缺乏監測評價模式的研究與集成，對效應評估、開發利用和支撐工藝都還有限。

農業生產中常用的微生物是細菌、放線菌、酵母和霉菌，其中使用最廣泛的是細菌。細菌是所有生物中最豐富的類型，并且是自然物質循環的主要參與者。根據其生長形態可分為：球型菌、桿型菌和螺旋型菌(包括弧型菌，螺旋菌)；根據其生活方式可分為：自養細菌和異養細菌(包括腐生和寄生細菌)；根據其需氧狀況可分為需氧型(全需氧和微需氧)和厭氧型(不完全厭氧，有氧耐受和全厭氧)細菌；根據細菌的生存溫度可以分為低溫、常溫和高溫三種類型。細菌發酵是一種生物過程，它利用細菌的特殊代謝途徑將原材料轉化為目標產物。細菌發酵有兩種：厭氧發酵和有氧發酵。發酵方式多樣，產品類別繁多，用途廣闊。發酵細菌結構簡單，并具有許多特殊的代謝途徑，它用于農業生產：直接參與有機物的腐爛和分解，促進土壤和作物養分的轉化；活化土壤中的養分，調節土壤的微環境，保持土壤的健康活力；降解土壤中的重金屬并減少有害物質的富集，保護土壤和農作物的健康狀況；拮抗有害病原菌，減少有害土壤細菌和農作物病害的發生；形成肥料效率，生物防治和降解的特定功能。

細菌的發酵過程，又是一個復雜多變的過程，每一種物質和微環境的變化都會導致不同的結果產生。因此研究細菌發酵工藝中的影響因素，優化技術，確保菌體穩定、安全、高效生產，從而為后續細菌類微生物改善土壤環境，促進安全生態農業的健康可持續發展提供依據，這對促進傳統農業產業結構轉化以及農民增收等具有積極的推動作用。

2 細菌培養基配方的優化

近些年來，我國微生物的發酵研究處于全新的發展階段，在發酵基質選擇及發酵條件優化方面都做了很多的研究。普遍通過單因素實驗、正交實驗、響應面法中的一種或幾種方法研究相應細菌菌株的最優發酵培養基，影響細菌發酵影響因子液有發酵液的配比組成、發酵液濃度等等。細菌繁殖的培養基成分主要有碳源、氮源、無機鹽、微量元素和生長因子。其中常用碳源物質有葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、牛肉膏等；常用氮源物質有蛋白胨、黃豆餅粉、玉米粉(漿)、酵母浸膏、尿素等；常用無機鹽物質有硫化酸銨、硫酸鎂、硫酸鐵、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀、碳酸鈣等；常用的微量元素為Fe、Zn、Cu等；常用生長因子物質有維生素、某些氨基酸、脂類、嘌呤、嘧啶等。很多的天然原料，如牛肉膏、麥芽湯、玉米面、豆芽汁等，含有細菌生長所需的無機鹽、微量元素以及生長因子，因此在使用此原料時不需額外添加這些物質。

對于不同的微生物，由于所需的營養不同，培養基成分也不相同。但配制的營養要求都要遵循以下的原則：①營養成分要包含微生物的生長需求。不同類型的微生物對營養成分的需求不同，應根據微生物對營養成分的需求來最佳配制。②營養成分的含量及物質配比要恰當。如果營養物質的含量太少，則無法滿足其對應微生物生長的需要；如果營養物質的含量太多，相反會抑制其微生物的繁殖。糖和鹽濃度高有抑菌作原用。營養物質的碳氮比例(營養物質中還原糖的質量分數與粗蛋白的質量分數的比值)，一般為 100∶0.5～2。③在進行培養基成分配比設計時，還要考慮到各營養成分之間的相互反應。例如，蛋白胨和酵母膏在有磷酸鹽成分和高溫條件下，會與其中的鈣作或鎂離子發生反應形成沉淀物質；在高溫條件下，還原糖還會與產蛋白質或氨基酸發生反應而形成褐色物質。④在設計營養物質配比，特別是在規模化生產發酵用的培養基時，還要注意培養基營養物質的來源和價格信息，盡可能選擇原料來源便利、價格實惠的培養基。

很多學者對細菌發酵培養基做了大量的摸索。例如，侍寶路等[1]對產細菌素乳酸菌進行研究確定其最佳發酵條件;賀曉凌等[2]研究產細菌纖維素菌優化確定了發酵條件和發酵配方;孔菲等[3]對產色素海洋細菌(Planococcussrifietoensis)發酵研究確定了最佳碳氮源;朱孔亮[4]曾用泡菜中分離得到的菌H3為出發菌株研究得出了較優培養基配方；劉大為[5]以嗜酸乳桿菌(Lactiobacillusaciadopluilus) La-1為研究對象，確定乳酸菌增殖培養基配方；等等。

在枯草芽孢桿菌方面，王亞君[6]探索了枯草芽孢桿菌(Baciillussubtilis)HL-1的優化培養基配方；陳羽[7]確定了枯草芽孢桿菌液體發酵最優培養基配方的碳源是葡萄糖，氮源是牛肉膏，無機鹽是磷酸二氫鉀，最佳含量分別為：葡萄糖 12.11 g/L、牛肉膏 23.31 g/L 和磷酸二氫鉀 2.33 g/L。此外，在巨大芽孢桿菌的發酵研究上也有報道，王金玲等[8]研究了巨大芽胞桿菌的最佳培養基質組成；韋杏花[9]在巨大芽孢桿菌基礎培養基研究中篩選得到最優營養物質為味精發酵廢液，配方為：牛肉膏 1.0 g/L、蛋白胨 1.0 g/L、味精廢液稀釋80倍、CaCO31.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、H3BO30.02 g/L。

不同芽孢桿菌，培養基配方也不盡相同。根據不同培菌的需求，進而設計不同的培養基配比。楊悅等[10]在研究植物乳桿菌時，優化發酵培養基配方為：葡萄糖 34.07 g/L、酵母浸粉 18.12 g/L、磷酸氫二鉀 2 g/L、硫酸錳 0.16 g/L、乙酸鈉 5 g/L、硫酸鎂 0.20 g/L、檸檬酸銨 1 g/L、吐溫 801 ml/L、胡蘿卜汁 50 mL/L，蒸餾水 1 L。賈玉香等[11]在對根瘤菌產胞外多糖發酵培養基配方進行優化，得到最優培養基配方為:麥芽糖 22.5 g/L、大豆蛋白胨 9.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、KH2PO40.41 g/L、NaCl 0.1 g/L。楊鏗等[12]在研究解磷芽孢桿菌YC4時發現其發酵的培養基最佳配方為：糖蜜 1.0 g/L、大豆蛋白粉 5 g/L、酵母膏 5 g/L、磷酸二氫鉀 5 g/L、硫酸鎂 1.5 g/L、氯化鈉 15 g/L、玉米漿 5 g/L。陳敏等[13]在進行解淀粉芽孢桿酵菌SC1150菌株發酵培養養條件研究時，得到培養基營養物質的最佳配比為：可溶性淀粉(碳源)0.5.%、蛋白胨和酵母粉(1∶1的氮源)1.15%、NaCl 0.1%。單因素篩選及正交試驗是最常見的培養基發酵優化的方法。例如，蠟質芽孢桿菌(Bacilluscereus)AR156、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、嗜酸乳桿菌L621及嗜熱鏈球菌S800的培養基發酵優化[14-17]。此外，對棉鈴蟲(HelicovaerpaarmigeraHubner)有較高活性的蘇云金芽孢桿菌Bt A3 22菌株的培養基進行優化過程中，篩選出了最佳培養基配方[18]。除芽孢桿菌外，很多細菌的發酵最佳培養基配方也采用了此方法[19-22]。

由此可見，不同類型的細菌培養基需求不同。最佳培養基配方需要根據需求不斷改進，以至獲得最優的培養基配方，達到實驗目的。研究應結合菌株的不同特性選擇相驗應培養基和試劑，再通過實驗研究摸索出最優培養基濃度。

3 細菌發酵條件的優化

影響細菌發酵條件有時間、溫接度、pH、接種菌齡、接種量、搖瓶裝液量、搖瓶轉速及溶氧量等，其中搖瓶裝液量和搖瓶轉速與溶氧量有直接關系。不同細菌對其發酵溫度、所需的酸堿環境、對氧的需求量、不同時期生長量均不相同。

細菌發酵條件方面，前人也做過很多的研究。趙航等[23]對葡糖醋桿菌J2-1利用單因素試驗和正交試驗，確定其發酵培養基最優組分為：葡萄糖 80 g/L、酵母粉 18 g/L、乙醇2%(體積分數)、Na2HPO4·12H2O 3 g/L、乳酸 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L；張炎等[24]副干酪乳桿菌HD1.7利用單因素試驗和正交試驗，確定其最佳發酵條件為接種量為3%，接種齡為 18 h，裝液量為 2 L/3.7 L，初始pH5.5，通氣量為 0 L/min，轉速為 400 r/min、培養溫度為 35 ℃、培養時間為 24 h；董菲菲等[25]通過單因素實驗考察溫度、pH、攪拌轉速、通氣量和不同流速的玉米漿對鹽沼鹽桿菌的影響，發現最佳發酵條件為：溫度 37 ℃、轉速 250 r/min、通氣量 13 m3/min；卜春亞等[26]確定了草莓根的腐病菌拮抗細菌GF-162最佳發酵條件；王聰等[27]對菌株AZ16星箭頭菌(Sagittulastellate)進行研究，確定了其最佳發酵條件為：鹽度2.5%、接種量5.0%、pH7.5、溫度 33 ℃。

不同類型的芽孢桿菌最佳培養條件也不相同。王金玲[28]對巨大芽孢桿菌研究顯示，其最佳生長條件為：250 mL 三角瓶的裝液量為 20 mL 、pH8.0、菌種接種量3%、搖床轉速 250 r/min、溫度 30 ℃、培養時間 22 h;梁曉輝等[29]研究結果顯示解磷巨大芽孢桿菌JL-1培養的最佳條件為：溫度25～30 ℃，pH 6.0～7.0，接種量5%;屈俊廷等[30]優化了解淀粉芽的孢桿菌Y-S-Y12菌株的發酵條件，確定其最佳條件為：時間 72 h，溫度28～33 ℃，搖床轉速 150 r/min，初始pH 6.0；車曉曦等[31]對解基淀粉芽孢桿菌的發酵研究得出其最優發酵條件，最佳培養溫度為 31 ℃、最佳培養轉速為 180 r/min、最佳發酵時間為 26 h、最佳發酵初始pH值為6.02、最佳接種量為1%。利用Placke響tt-Burman設計及響應面法確立產Macrola ctin A抗生素海洋解淀粉芽孢桿菌的最佳發酵條件，其初始pH值為6.0，最適培養溫度為 29.9 ℃，最適裝液量為52.3%，最佳搖床轉速為 1130 r/min，接菌量為10%，最佳培養時間為 7 d[32]。而蠟質芽孢桿菌(Bacilluscereus)DLSL2的最佳培養條件的溫度為 30 ℃、初始pH值為7.0[33]。

培養溫度、培養時間及pH值是細菌發酵的重要條件。例如，解淀粉芽孢桿菌15-1-1的最佳生長培養條件為：培養溫度 32 ℃、培養時間 36 h、初始pH值7.0[34]；解淀粉芽孢桿菌11568的最佳培養條件為：pH7.5、溫度 40.9 ℃、時間 2 d[35]；解淀粉酵芽孢桿菌MH71的最適發酵條件為培養溫度 30 ℃、發酵起始pH7.0、發酵時間為 3 d[36]；解淀發粉芽孢桿菌HF-01的最適生長條件為：溫度 28℃，初始時間 48 h、pH值6.0～6.5[37]。可見，不同種的解淀粉芽淀孢桿菌，其最適培養條件也不同。

此外，利用單因素試驗和正交試驗對生防菌株FS6的培養基成分和培養條件進行研究，確定其最優發酵條件[38]；也研究了發酵溫度、搖床轉效速和培養時間對發酵液抑菌效果的影響[39]；還研究了溶藻細菌R2的最佳化培養條件，最佳培養溫度為 31.8℃、最適pH為7.21、搖床最佳轉速為 180 r/min、最佳裝液量為60%、最佳接菌量為10%[40]；還研究了內生細菌YBSH106的最適培養條件，最適pH為7.0、最佳培養溫度為 28 ℃、最佳培養時間為 3 d，最佳接菌量為4%，揺床最佳轉速為 200 r/min[41]。魏嬌洋等[42]通過比較發酵液的生物菌量，得出內生解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamynloliquefaciens)X-278最佳發酵培養條件。嗜酸乳桿菌細菌素LaXctobacillin XH1的最佳發酵條件為培養基初始pH6.5、培養溫度 35 ℃、接種量為2.5%和培養時間 28 h[43]。

通過對微生物K-6-9的始液體發酵條件的探討研究，確定其最佳發酵條件為：發酵液初始pH7.0、250 mL 三角瓶裝液 50 mL、接菌量2%、培養溫度 37 ℃、搖床轉速 180 r/min、培養時間 18 h[44]。也研究了湘2-3菌的發酵條件，得出最佳發酵時間為 1 d，最佳發酵溫度為 28 ℃，最適菌齡在 18 h～22 h，最佳接菌量為4%，搖床最適轉速為 210 r/min，瓶子最優溶氧量為 100 mL/150 mL[45]。通過對煙草內生細菌B-001菌株的發酵條件研究顯示：最佳通氣量為 100 L/h，搖床最適轉速為 220 r/min，最佳培養溫度為 30 ℃，培養基的起始pH為8.0，最優培養時間為 2.5 d[46]。可見，轉速和時間也影響著細菌發酵條件的變化，應根據生產需求時時進行改進和優化。

綜合來看，微生物培養條件的優化調整要根據具體的菌種決定，但在發酵過程中要嚴格按要求進行操作，發酵條件優化調整有：①不同菌株對溫度的敏感性和耐受度不同，發酵中應嚴格控制好溫度。②pH的調節一般通過添加酸堿或氨養水來調節，但是通過流加營養液的方式來調控更加便利，既調節了pH，又給菌株提供了新鮮充足的營養液。③溶氧量：三角瓶可以通過調節轉速和瓶子的裝液量來進行調節，若要高溶氧量，可以減少裝瓶量和調高轉速來實現；若要低溶氧量可以增加裝瓶量和降低搖床轉速來實現。通常裝液量最好不要超過瓶子體積的一半。發酵罐可以通過調節其進氣量、罐壓和攪拌轉速來調節溶氧量，不同發酵時期要嚴格控制好三者的參數。④接種量根據菌株的繁殖速度和裝瓶液的多少來加減。一般接種量在10%以內，根據搖瓶和發酵條件來添加。

4 農用微生物菌肥發酵自工藝的優化

目前，直接來自要于農田的農用微生物菌肥主要涉及煙桿、畜禽糞便、菌糠等方面。萇豹[47]以單因素實驗方法研究，將實驗室的固氮菌N1、解鉀菌K3、解磷菌FL和新篩選到的12株菌與菌糠一起進行半固態發酵，制備出了菌糠微生物菌肥；這種半固態發酵的最優發酵條件為：氮源為蛋白胨(濃度為0.2%)、無機鹽為磷酸氫二鉀裝(濃度為0.2%)、裝液量70%、裝載量為 400 g/L，固體顆粒蛋直徑60目、初始pH值7.0、溫度 30 ℃、轉速 200 r/min。周熠等[48]研究將濕料煙桿和雞糞按質量1∶1比例混合均勻，然后分別加入1%的高溫蛋白酶發產生菌Lys-068、耐熱芽孢桿菌酶Lys-768和生防菌哈茨木霉菌劑ACCC3028再次混合均勻，進行固態發酵，可以大大縮短發酵周期。楊曉磊等[49]研究發現將有機原料與味精下腳料調酸輔料混合均勻，間歇性發酵60 d，就可獲得標準的有機肥料產品。王琦源[50]在資源化利用畜禽糞便研究中，發現其最優發酵工藝為：碳氮比30 ∶1、含水率70%、接菌量0.35%、4 d翻堆一次；15 d后需加入1%含氮、磷、鉀元素的有益菌液，之后每天翻堆，5 d后發酵完成。王健博[51]對堆肥參數進行優化，確定了最佳的發酵參數為：復合菌劑比例為1.5∶2∶1.5∶2，接菌量為1.255%，初始含水率為50%～60%，初始碳氫比為27∶1，堆肥翻堆天數為 3 d，結果表明此法秸能夠大大的縮短試驗中豬糞秸稈混合物的堆肥的腐熟時間。

一定比例的菌劑加入到有機肥中，能夠促進有機的腐熟期，大大縮短有機肥的發酵周期，減少生產時間投入，減少秸稈和畜禽糞便對土壤和環境的污染，能使廢棄的有機資源得到合理利用，變廢為寶，形成集化環保生產模式。加之菌劑對農作物病害的拮抗作用和菌劑在土壤中的修復降解等功效，形成特定功能的生物有機肥。有效保護了耕地土壤健康, 提高微生物有機肥的競爭力，增強農業可持續發展能力，同時也有力地促進現代化農業的進程。

5 展望

農業微生物始終貫穿著整個農業的生產過程。例如，獲取農業微生物基因的抗逆育種、植物病原微生物流行與防治、微生物農藥、土壤微生態環境調控治理、微生物肥料、污染退化環境微生物防治、微生物發酵食品、能源微生物等。其中，以種類、數量最多的細菌類農業微生物資源給農業生產帶來的效應尤為顯著。

農業微生物中功能性細菌作為一種新型資源，在減少化肥、降低環境污染、提高農作物品質、保護環境等方面具有重要意義。但在生產中的效果還不是很穩定，研究還不是很成熟，限制了它的進一步推廣和普及。這是由于微生物菌劑的作用受許多條件的制約影響，如菌種的活性、發酵基質的選擇、配比和發酵條件的不優化，限制了微生物菌劑中功能性細菌在農業及環境中的應用效果。因此對細菌發酵基質和發酵條件最優化還需根據特定情況進一步進行探討研究。