綠藻多糖研究進展

◎ 劉文晶，劉 山，王菲菲

（齊魯醫藥學院，山東 淄博 255300）

褐藻、紅藻、藍藻和綠藻是海洋中常見的藻類，許多海藻可以食用，且營養價值高，例如人們常食用的海帶屬于褐藻類，石花菜、角叉菜屬于紅藻類，滸苔、石莼屬于綠藻類。褐藻、紅藻利用率較高，例如卡拉膠褐藻膠等，綠藻研究相對較少。近年來，海邊經常發生“綠潮”現象，主要是綠藻門的石莼泛濫，它可作為飼料、食品和藥物開發的原料[1]。由于綠藻多糖結構往往比較復雜，大多數為酸性多糖，在結構研究方面研究相對緩慢，但隨著檢測技術的進步，結構解析方面也有了較大進步，本文就近年來綠藻多糖的研究進展情況進行綜述。

1 綠藻多糖提取方法

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是多糖提取最經典的方法，多糖是多羥基化合物，極性較大，所以用極性大的蒸餾水作為溶劑提取綠藻里面的多糖是常用方法。一般先將綠藻沖洗干凈，去除雜質，烘干后磨碎得干燥藻粉。將藻粉與蒸餾水按照一定比例混合，用常溫或者一定溫度蒸餾水進行提取，將多糖溶液濃縮后，用95%的乙醇進行醇沉處理，此方法需計算好料液比、提取時間、提取次數和提取溫度等。曹素建等[2]從石莼綠藻類中，按照藻粉與超純水1∶50的料液比，100 ℃熱水提取粗多糖，得率為5.75%。

1.2 酸/堿提取法

酸/堿提取法的基本原理是，弱酸或弱堿溶液可以破壞植物細胞壁，使細胞內多糖成分盡可能多的被提取出來，但要注意的是要選擇適合的pH值來進行提取，pH值過大或過小都存在破壞多糖糖苷鍵的風險。付雙超等人[3]確定滇刺棗多糖的最優提取條件為檸檬酸調節pH值到1.5、溫度90 ℃、時間80 min，此時多糖提取率為13.62%。王姝垚等[4]采用0.5 mol·L-1NaOH溶液提取腸滸苔綠藻多糖，提取溫度為100 ℃，提取時間為2 h，粗多糖得率為6.4%。

1.3 超聲波提取法

超聲波提取法主要是通過改變超聲儀器的功率達到震碎細胞壁的效果，使細胞內多糖溶出，該方法要注意提取時間，防止超聲過度，使多糖糖鏈發生斷裂。彭傳友等[5]采用超聲波提取法提取枇杷葉多糖，結果表明液料比為33 mL·g-1、功率320 W，溫度60 ℃、提取時間32 min時為最優提取條件，最優得率為5.78%。此法不用添加額外試劑，相對安全可靠，為枇杷葉多糖的提取提供了最優方案。

1.4 酶解提取法

酶解法提取多糖可以使用一種提取酶，也可以多種提取酶聯合使用，原理是用酶破壞植物的細胞壁和細胞膜，使細胞質中的多糖充分溶解出來，提高粗多糖的得率。杜涓等[6]采用纖維素酶提取玉米芯多糖，將玉米芯酶解20 h后，酶解法提取分離后的樣品與不加纖維素提取酶的樣品對比，發現具有相同的多糖官能團，掃描電鏡實驗結果顯示酶解后的多糖表面變得粗糙，立體結構發生了一定變化。酶解后多糖體外抗氧化活性得到了增強，主要原因是酶解的過程中也破壞了原來多糖的結構，使多糖有一定降解，體外抗氧化活性得到了增強。黃斌[7]在提取海洋綠藻滸苔多糖時，用酶法提取比其他方式多糖得率要高。

2 綠藻多糖分離純化方法

2.1 除雜

綠藻粗多糖提取之后往往摻雜色素和蛋白質等雜質，首先需要將色素去除，可以采用活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法等，吸附色素的同時也會損失一部分多糖，也可以使用過氧化氫法等化學方法去除色素，但實驗室最簡單的方式是采用透析袋透析法。這種方法是將粗多糖用少量蒸餾水溶解，置于透析袋中，外部大量純水，透析袋內色素會滲透到外部環境中，但由于多糖粒徑較大無法透過透析袋薄膜，截留在內部，實現脫色目的，此方法要注意透析袋孔徑，防止多糖的外溢。綠藻提取后的多糖有時會攜帶蛋白質大分子，除蛋白的方式很多，有生物法、物理法和化學法。曹澤虹等[8]采用不同化學方法對駿棗多糖進行脫蛋白處理，發現三氟乙酸法脫蛋白效果最好，樣本損失率最小。

2.2 分離純化

常用的多糖分離方法有多級醇沉法、電泳法等，對于綠藻多糖最常用的是柱層析法。離子交換色譜原理是多糖分子和色譜柱內部填料發生電吸附作用，被離子色譜柱吸附下來，再通過不同濃度的鹽溶液作為流動相，使填料與多糖發生解吸附作用，不同濃度的流動相可以使不同類型的多糖分子解離下來，實現分離目的。凝膠柱層析法是運用分子排阻原理實現多糖的分離，填料一般是葡聚糖凝膠、丙烯葡聚糖凝膠，原理是小分子量多糖分子在填料的孔徑內游走路徑長，流出的時間長，大分子量多糖分子進入填料孔徑內受阻力大，不易進入孔徑，比較容易流出，流出時間短。HE等[9]采用Q-Sepharose Fast Flow強陰離子色譜柱及Sephacryl S-400凝膠色譜柱對小枝剛毛藻粗多糖進行了分離純化，得到半乳-阿拉伯聚糖OHSS2，并用高效凝膠滲透色譜法測定其分子量，呈現單一對稱單峰，表明多糖純度較高，分離效果較好。

3 綠藻多樣結構研究

綠藻多糖往往是酸性多糖，在解析結構時具有其特殊性，多糖和其他生物大分子類似，具有一級、二級等多級結構，一級結構研究是綠藻多糖研究的基礎，隨著分析儀器和分析方法的進步，對多糖的結構研究有了進一步進展。高級結構解析包括二級、三級、四級結構研究，主要研究其空間構象。

3.1 一級結構

目前多糖的一級結構解析較為成熟，一級結構解析主要集中在單糖組成、相對分子量、糖殘基鏈接方式、取代基鏈接位點和單糖的構型等。相對分子量可通過低壓凝膠滲透色譜法、高效凝膠滲透色譜法、電泳法和質譜法等進行檢測，常采取高效凝膠滲透色譜法測定多糖的分子量，根據液相圖譜的出峰時間和不同多糖標準品的分子量做線性回歸曲線，根據樣品出峰時間即可算出多糖的相對分子量。單糖組成分析常采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色譜法，即把多糖降解后的單糖，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生上發色基團，與標準單糖標準品出峰時間進行對比，確定其單糖組成。甲基化結合氣質聯用技術是近年來多糖糖殘基解析的常用方式，基本原理是多糖的游離羥基被甲基取代，進行酸降解，降解樣品經過還原、乙酰化得到甲基化的糖醇乙酸酯，結合氣質聯用技術分析，與標準數據庫進行對比，即可得出糖殘基之間的鏈接方式。值得注意的是，綠藻多糖多為硫酸多糖，還要把脫硫前后的樣品進行甲基化對照實驗以確定硫酸根的鏈接位置。LI等[10]從一種礁膜綠藻中用熱水提取分離得到粗多糖，進一步通過陰離子交換柱和凝膠排阻色譜柱分離得到純品多糖PF2，主要的糖殘基為→3)-α-L-Rhap-(1→和→2)-α-L-Rhap-(1→,分支部分位于→3)-α-L-Rhap-(1→的C-2位置上，硫酸根基團位于→2)-α-L-Rhap-(1→的C-3位置上。

3.2 高級結構

多糖作為一種生物大分子，分子量比較大，且海藻多糖往往含有酸性基團，空間結構更為復雜。由于空間結構對生物活性影響較大，所以多糖高級結構解析十分重要，主要包括二級、三級、四級結構研究，研究方法有核磁共振法、X-射線衍射技術、圓二色譜法、糖芯片技術和分子模擬技術等方法。DAYAL等[11]利用X射線衍射技術分析了細菌纖維素結構表征，得到總輪廓、結晶度、晶體尺寸等相關參數。

4 綠藻多糖活性研究

近年來，綠藻多糖的活性一直是多糖研究的熱點，包括抗凝血、抗炎、抗腫瘤、調節血糖和免疫調節等活性研究。CAO等[12]從礁膜綠藻中提取出一種多糖，命名為MS-1，經測定，MS-1在體內外均表現出較強的抗凝血活性，并顯著降低血小板聚集能力。通過血栓的濕重和長度，以及電誘導頸動脈血栓形成的血栓閉塞時間來評估，MS-1在體外和體內均表現出很強的抗血栓活性。這些結果提示，MS-1可能是一種很有前途的預防和治療血栓栓塞性疾病的海洋藥物。QIN等[13]從綠藻線形硬毛藻中提取得到一種硫酸鼠李多糖，對人胰島胰樣多肽的（Human Islet Amyloid Polypeptide，hIAPP）聚集具有抑制作用，可使hIAPP聚集形態改變，證明該多糖能有效抑制hIAPP聚集，具有較強的抗糖尿病活性。綠藻多糖，不僅可以用于醫學研究，在食品、化工方面也有重要應用，比如石莼聚糖可以作為優良的食品添加劑，滸苔多糖可以作為果凍里面的凝膠，綠藻多糖還可以作為有機肥料或者動物飼料。

5 結語

綠藻多糖是一種非常特殊的天然大分子，目前還沒有被深度開發利用，目前集中在結構研究和活性研究，在醫藥、養殖、化工和食品方面有了一定應用。綠藻由于結構復雜，結構解析比較煩瑣，尤其是高級結構的解析難度較大，結構與生物活性的構效關系還不夠明朗。為更好地研究多糖的結構，可將其進行寡糖制備，通過確定寡糖的結構，進而推斷多糖結構。綠藻多糖的活性研究取得了較大進步，但其分子量巨大，分子難以進入細胞內部，因此其作用機制還需要進一步研究。