益生菌改善牛乳蛋白過敏性的研究進展

曹 婷，趙麗娜，陳慶學，岳瑩雪，呂秀莉，平麗筠，李柏良，霍貴成

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛乳蛋白過敏是一種常見的過敏性疾病，通常伴隨著不良免疫反應。牛奶是嬰兒首先接受的外來抗原，是3 歲以下兒童的主要過敏食物，這也解釋了嬰幼兒牛乳蛋白過敏高發病率的原因。據研究，高達7.5%的兒童對牛奶過敏。越來越多的證據表明益生菌對改善牛乳蛋白過敏具有良好的效果。因此，益生菌對過敏癥狀的潛在預防和治療效果引起了人們的廣泛關注。大量研究表明益生菌可以通過調節腸道菌群的平衡在宿主免疫系統的發育和調節中發揮作用，從而改變過敏性疾病的發病風險[1]。本文從過敏原和誘導機理的角度介紹牛乳過敏，闡述益生菌對改善過敏的最新研究，最后總結當下低致敏性產品的研究現狀。

1 牛乳蛋白過敏概述

牛奶蛋白過敏（Cow milk protein allergy，CMPA）是牛乳蛋白誘導機體免疫系統發生不同程度的過敏反應。牛乳蛋白是嬰兒生長發育所需重要的營養物質，它被聯合國糧食與農業組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）、世界衛生組織（World Health Organization，WHO）認為是八大過敏原之一，其中，主要的過敏原是酪蛋白和乳清蛋白。過敏現象的出現與人體產生的免疫球蛋白E（IgE）過多有關，當IgE 無法正常調控時產生以下的過敏反應，如特應性皮炎[2]、過敏性濕疹、過敏性哮喘和過敏性鼻炎等，這也是嬰幼兒時期的常見問題[3-4]。

1.1 過敏原

牛乳中含有引起過敏的蛋白質約30 種[5]，其基本理化特性如表1 所示。以牛乳為主的乳源中含有的酪蛋白和乳清蛋白在成分、含量以及結構上都與母乳有很大的差異（在牛乳中的酪蛋白:乳清蛋白=8:2；在母乳中的酪蛋白:乳清蛋白=4:6[8]），并且存在一些可以被人體免疫系統識別的構象表位和線性表位（圖1）。因此，當乳蛋白進入人體后免疫系統可以識別其抗原表位，從而引發過敏反應。基于這個原因，已經對IgE 及IgG 結合區域進行了大量研究，甚至通過丙氨酸掃描分析法確定了致敏蛋白關鍵的氨基酸殘基[9]。為牛乳蛋白脫敏技術的研究提供了一定的理論依據。

表1 牛乳過敏原基本信息[6-7]Table 1 Basic information of milk allergen[6-7]

圖1 過敏表位結構[10]Fig.1 Allergic epitope structure[10]

1.2 牛乳蛋白過敏誘導機理

目前，CMPA 主要分為IgE 介導和非IgE 介導兩種，誘導機理如表2 所示。

表2 牛乳蛋白誘導機制的區別Table 2 Differences in milk protein induction mechanism

IgE 介導的Ⅰ型急性超敏反應是常見的免疫反應，一般在攝入蛋白1 h 內發生過敏反應。這種超敏反應發展的第一步是牛奶蛋白過敏原通過腸道粘膜呈現給免疫細胞誘導致敏然后進行記憶誘導，隨后接觸牛奶蛋白過敏原發生即時反應[11]，其致敏機制已經有深入的研究[12-14]（圖2）。

圖2 IgE 介導的牛乳蛋白過敏機制[12-14]Fig.2 IgE-mediated mechanism of bovine milk protein allergy[12-14]

IgE 介導的CMPA 通常始于抗原呈遞細胞對蛋白抗原的內化和加工。隨后Th 細胞被活化，以Th2途徑為主，分泌IL-4 和IL-13 細胞因子誘導漿細胞產生IgE，會與血液中肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面高親和力的Fc 受體特異性結合，從而產生組胺等物質作用于細胞組織使機體處于致敏的狀態[14]。當相同過敏蛋白再次進入處于致敏狀態的機體時，就促發了激發效應階段，多個過敏原與吸附于肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的兩個或兩個以上相鄰的IgE 結合發生交聯反應，使肥大細胞等效應器細胞被激活，并在細胞內進行一系列酶促反應，從而激活致敏的肥大細胞和嗜堿性粒細胞使其脫顆粒，進而釋放組胺、白三烯等生物活性介質，作用于血管，使血管擴張、通透性增加；作用于腺體，使腺體分泌增多；作用于平滑肌，使平滑肌收縮，從而導致皮膚及呼吸道的不適[15]。

非IgE 介導的CMPA 多表現在攝入乳蛋白后的幾個小時到幾天后，故常被稱為“遲發型超敏反應”。Savino 等[16]研究表明輕度至中度非IgE 介導的CMPA 患者的IL-4 和IL-13 平均值增加，IL-5和IL-10 平均值降低。白細胞介素5（IL-5）主要被認為是一種Th2 細胞因子，它通過激活嗜酸性粒細胞引起過敏反應。研究顯示IL-5 的值較低，這可能與非IgE 介導的食物過敏有關。目前的研究表明，Th2 分泌的IL-5 可能由于嗜酸性粒細胞的積累和激活而導致非IgE 細胞介導的過敏[10]。

2 益生菌改善牛乳過敏

由于益生菌所獨有的生物學特點和腸道黏膜免疫反應的特異性，使腸道益生菌療法作為一種改善牛乳過敏的新療法日益受到重視。益生菌調節腸道菌群豐度及結構、增強腸粘膜屏障功能、保持Th1/Th2和Treg/Th17 平衡，增強機體免疫能力，表現出抗牛乳過敏的作用如表3 所示。

表3 益生菌對牛乳過敏的改善作用Table 3 Improvement effect of probiotics on milk allergy

2.1 調節腸道菌群

腸道是人體最大的免疫器官，人體和腸道菌群間進行著活躍的代謝過程，并共同決定人的健康狀態。腸道微生物群被廣泛認為是健康和疾病之間的重要調解者，特別是對早期宿主免疫系統的發育和成熟起著重要作用[25]。益生菌能夠改變腸道菌群豐度，調節菌群結構，潛在地降低CMPA 的風險。

牛乳過敏者與正常人的腸道菌群有部分差異。Esber 等[17]研究鼠李糖乳桿菌LA305、唾液乳桿菌LA307 和長雙歧桿菌嬰兒亞種LA308 三種益生菌對過敏性小鼠腸道菌群的影響如表4 所示。Bunyavanich 等[26]研究表明腸道菌群組成的不同可以改變食物過敏的易感性和抗性，進一步揭示生命早期的腸道菌群可能是影響CMPA 機制和過程的關鍵因素。在一項對226 名牛奶過敏兒童的研究中，研究人員發現3～6 個月嬰兒的腸道微生物特征與8 歲時牛奶過敏的消除有關，特別是3～6 個月的嬰兒期是形成CMPA 過程的一個特殊的發育時間窗口[27]。兒童腸道微生物群中梭狀芽胞桿菌和厚壁菌門的富集有助于在8 歲時減輕CMPA，而腸桿菌和擬桿菌門的增加導致嚴重的過敏反應[28]。

表4 不同益生菌對腸道菌群豐度的影響[17]Table 4 Different probiotics on the intestinal flora abundance[17]

因此，腸道菌群的平衡對CMPA 產生至關重要的影響。腸道菌群可能通過調節Ⅱ型免疫、影響免疫調節和耐受、調節嗜堿性粒細胞數量、促進腸道屏障功能等途徑影響食物過敏易感性[29]。并且，腸道菌群在促進腸道免疫系統的成熟和觸發宿主免疫和防御反應的介質的傳遞、調節Th 細胞平衡和口服耐受性的獲得、維持腸道上皮細胞的完整性等方面發揮著重要作用。

2.2 提高腸道免疫

2.2.1 促進sIgA 增加，增強腸粘膜屏障功能 研究發現腸內益生菌不僅可以改善防御屏障，而且對增強嬰幼兒腸道免疫力有刺激作用[30]。嬰幼兒的免疫系統發育相對未成熟，因此腸道抵御過敏蛋白的能力也相對較差。在腸道上層的細胞表面有一層菌膜屏障，具有免疫保護作用，維持腸道微生態；當嬰幼兒腸道菌群失調時，有害菌會造成腸黏膜通透性改變，導致致敏性蛋白進入體內，引起過敏反應，而益生菌定植后，能夠在腸黏膜上形成一層保護膜，不僅修復并增強腸黏膜的屏障功能，還調節了菌群平衡，促進了免疫屏障的穩固[31]。

益生菌通過促進分泌性免疫球蛋白（slgA）的分泌，減少過敏原從腸道進入血液。在腸道黏液層，slgA 可通過與細菌胞壁抗原決定簇結合包裹異物來減緩過敏的發生[32]。陳毅秋[18]發現給小鼠灌胃鼠李糖乳桿菌GG（LGG）后，LGG 在腸道定植的同時增強了B 細胞的活化，調節B 細胞分泌免疫球蛋白，顯著提高了小鼠腸道黏膜sIgA 的分泌量，從而調節了小鼠黏膜免疫系統，以此提高了機體免疫水平。雙歧桿菌能夠刺激機體產生sIgA 的細胞增殖，從而使得sIgA 水平上升。Rigo-adrover 等[19]為探究哺乳期補充益生菌短雙歧桿菌（Bifidobacterium brevis）M-16V 對腸道和免疫系統成熟的影響，自新生小鼠出生后的第6～18 d 對其補充益生菌并進行每日評估。結果發現短雙歧桿菌M-16V 增強了小鼠腸道內IgA 的合成，促進了早期黏膜免疫的發展。通過飼喂小鼠益生菌（嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌），然后對小鼠免疫器官的重量、脾淋巴細胞的轉化、脾細胞抗體的生成、腸黏膜sIgA 含量研究發現，攝入一定劑量的益生菌，可增強小鼠特異性及非特異性免疫功能[20]。

2.2.2 減少Th2 極化，保持Th1/Th2 平衡 當致敏蛋白質進入人體內后，引起過敏反應的程度與體內淋巴細胞的免疫調控密切相關。有研究證實嬰幼兒牛乳蛋白過敏反應與不同亞型的T 細胞調節體系的失衡有關，早先發現Th2 占優勢的Th1/Th2 細胞失衡是牛乳蛋白過敏的一個重要因素[33]。益生菌調節Th1/Th2 平衡過程（見圖3）。益生菌可通過增進Th1 型免疫反應，調控因過敏而反應過度的Th2 型免疫反應，從而減緩過敏癥狀[34]。Fu 等[21]研究發現植物乳桿菌ZDY2013 和鼠李糖乳桿菌GG 口服可抑制過敏反應，其原因主要是通過誘導Th1 或調節性T 細胞分化抑制Th2 的反應，調節Th1/Th2 的免疫平衡；顯著增加了緊密連接蛋白的相對表達，增強腸道屏障功能；調節過敏引起的腸道菌群的改變。Shandilya等[22]在乳清蛋白致敏小鼠后喂養選育后的嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌，發現益生菌組小鼠脾臟細胞培養上清中產生的Th1 特異性輔助因子增加（包括IFN-γ，IL-12 和IL-10），Th2 特異性細胞因子IL-4 下降，這表明益生菌的調節作用使血清中Th2 特異性免疫應答向Th1 傾斜，抑制了血清中IgE 的產生，從而減輕小鼠對乳清蛋白的過敏反應。這說明益生菌可通過上調Th1 細胞因子表達，下調Th2 細胞因子表達，來調節Th1/Th2 的免疫平衡來抑制過敏。

圖3 益生菌調節Th1/Th2 平衡過程[35]Fig.3 Probiotics regulate the process of Th1/Th2 balance[35]

2.2.3 誘導Foxp3+Treg，保持Treg/Th17 的平衡近年來越來越多的研究表明Treg/Th17 的失衡也是導致過敏性疾病的關鍵因素之一。不同轉錄因子的轉錄水平決定了Treg/Th17 的平衡。Treg 細胞的Foxp3 的表達水平在維持腸道穩態，對抗過敏反應和抗原特異性Treg 的產生中發揮著至關重要的作用。在β-乳球蛋白（BLG）致敏小鼠模型中，補充副干酪乳桿菌L9 或長雙歧桿菌BBMN68 可以刺激樹突細胞（如CD11c+CD103+DCs）的表達和誘導T 細胞轉換Foxp3+ Treg 進而抑制CMPA[23-24]。

Esber 等[17]研究表明，鼠李糖乳桿菌LA305，唾液乳桿菌LA307 和長雙歧桿菌嬰兒亞種LA308 三種益生菌誘導Treg 細胞，可能與腸道菌群產生免疫調節代謝產物，特別是乙酸、丙酸和丁酸有關[36]，腸道微生物產生的主要代謝物是短鏈脂肪酸（SCFAs）[37]。SCFAs 通過誘導保護性的黏膜Treg 細胞反應和增強腸道屏障的完整性來抑制食物過敏[38]。研究表明SCFAs 通過作用于IECs 上的受體GPR43 和GPR109a，增強CD103+DCs 中視黃醛脫氫酶（retinal dehydrogenase，RALDH）的活性和增加抗原特異性Foxp3+Treg 細胞數目[39]。例如，SCFAs（如丁酸）可以通過識別DCs 上的GPR109a 受體促進Treg 細胞的產生（缺乏GPR109a 的小鼠的Treg 細胞數量則會降低），這表明在DCs 中SCFAs-GPR109a 軸在食物過敏原的免疫耐受中起著關鍵作用[40]。SCFAs 也可以直接調節T 細胞優先分化成Treg 細胞，其機制可能是由于SCFAs 通過識別GPR109a 或GPR43 來增加Foxp3位點的組蛋白H3 乙酰化[41-42]。在短鏈脂肪酸中，丁酸是維持腸道免疫穩態所必需的，并在免疫耐受中發揮關鍵作用，在過敏性疾病中具有強烈的抗炎作用。另外，丁酸鹽參與了食物免疫耐受性的形成，特別是在嬰兒出生后的頭1000 d[43]。SCFA在預防過敏中的作用，發現丁酸鹽水平最高的兒童對食物過敏原過敏的風險降低[44]。近來有研究表明，益生菌胞外多糖對過敏機體內T 細胞分化與樹突狀細胞活化也具有調節作用。益生菌胞外多糖介導T 細胞轉化為Foxp3+Treg 細胞，通過分泌調節性細胞因子來逆轉特異性Th2 偏倚的免疫反應[45]。

益生菌可以調節腸道菌群、提高腸道免疫，有利于維持腸道健康。直接食用益生菌制劑具有一定的風險且不易于人們接受。利用奶及奶制品作為益生菌的載體，進而開發低致敏性產品是食用益生菌的有效途徑。

3 益生菌在低致敏性牛乳開發中的應用

3.1 配方奶粉

大多數患有CMPA 的兒童年齡小于1 歲，在沒有母乳的情況下可能需要低過敏性配方奶粉[46]。而添加LGG 的以酪蛋白水解物為基礎的嬰兒配方奶粉可以刺激CMPA 患兒的免疫耐受，并減少CMPA的發生率[47]。為了消除牛乳蛋白的致敏性，理應開發最適合嬰兒生長發育的低致敏性產品。

低致敏性產品的選擇取決于兩個主要因素，即營養充足性和過敏原性。采用益生菌降低配方奶粉的過敏原性是一種有效方法。Guest 等[48]選擇940 位對廣泛水解配方粉過敏的嬰兒，通過臨床試驗進一步證明，喂養添加鼠李糖乳桿菌的水解配方粉，24 個月后，77%的嬰兒患腸道疾病、濕疹和哮喘癥狀顯著減輕[48]。Nocerino 等[49]也證明喂養添加鼠李糖乳桿菌水解配方粉的嬰兒縮短了免疫耐受的獲得時間[49]，這可能是由于鼠李糖乳桿菌增強了腸上皮細胞的增殖分化、緊密連接蛋白的形成，從而減緩牛乳過敏患兒的過敏進程。然而，目前根據歐洲兒科胃腸病學和營養學會（ESPGHAN）評估，由于配方粉中所含益生菌的真正安全性尚未得到充分驗證，還未應用到商業生產低致敏配方粉中，有待進一步對其安全性進行研究。

3.2 發酵乳制品

發酵是最古老的食品加工技術之一。發酵乳制品的特點是具有更好的消化率和降敏性[50]。最近研究表明，CMPA 兒童可以耐受酸奶，這表明發酵的牛奶也可以作為CMPA 患者的食品。益生菌發酵生產的酸奶中，乳清蛋白的過敏性顯著降低，β-乳球蛋白的致敏性顯著降低，酪蛋白的致敏特性也由于牛奶發酵的干酪乳桿菌而降低[51]。不同益生菌對乳蛋白抗原性的降低效率不同，這為開發用于CMPA 管理的新型發酵乳提供了可能性。Anggraini 等[52]研究保加利亞菌是降低水牛和山羊酪蛋白過敏原的最佳菌種。保加利亞嗜熱鏈球菌感染12～18 h。發酵后，乳清過敏原在脫脂牛奶和乳清提取物中均有輕微降解。結果表明在各種酪蛋白源中山羊酪蛋白的致敏性顯著降低。Biscola 等[53]研究巴西手工成熟奶酪，手工奶酪可以作為蛋白水解益生菌的來源，具有成為新型低過敏性乳制品的潛力。其中糞腸桿菌VB43對牛奶酪蛋白具有較好的水解活性，能夠廣泛水解αS1-CN、αS2-CN 和β-CN。Nath 等[54]研究用液態乳蛋白濃縮物（LMPC）經嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌水解和胰蛋白酶酶解后制備具有低致敏性的生物活性肽。由于微生物水解，酪蛋白對抗體Rb 抗酪蛋白的抗原性降低。隨著0.016 g·L-1胰蛋白酶處理LMPC經發酵后未見致敏性。

發酵是開發低致敏性產品有效的技術途徑，它具有條件溫和、工藝簡單、可行性強的優勢。因此，研究生產低致敏性產品既能保證過敏人群的安全食用，也為我國低致敏性產品的開發提供關鍵技術。

4 結語

益生菌通過調節腸道微生物，保持Th1/Th2 和Treg/Th17 的平衡進而預防或改善兒童牛乳蛋白過敏，達到對微生物-免疫軸的適當調整，因而成為近年來預防牛乳蛋白過敏的熱點。目前對于腸道菌群調節牛乳蛋白過敏的機制以及益生菌緩解牛乳蛋白過敏的研究都處于初步階段，深入探究益生菌調節腸道菌群、提高腸道免疫的途徑；尋找益生菌作用于機體腸道內的靶點；利用復合益生菌的聯合降敏作為緩解CMAP 有效手段，為進一步改善CMAP 提供了可能。探索高質量且易于人體腸道吸收的低過敏性乳制品是未來開發相關低致敏產品目標。