多肽類ACE 抑制劑的設計合成及生物活性

周佳琪，馬春燕，李曉暉,*

（1.大連理工大學生物工程學院，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學化工學院，遼寧 大連 116024）

高血壓是一種高發性心血管疾病，全世界近10 億人患有高血壓，預計到2025 年，高血壓患病人數將達到15.6 億[1-2]。在血壓復雜調節網絡中，血管緊張素I 轉換酶（angiotensin converting enzyme, ACE,EC 3.4.15.1）作為一種關鍵酶，通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin system, RAS）和激肽釋放酶-激肽系統（kallikrein-kinin system, KKS）參與血壓調節[3-4]。在RAS 中，ACE 可催化血管緊張素I 轉化為能夠使血管收縮的血管緊張素II[5]，而在KKS 中，ACE 能夠切割緩激肽C-端的二肽殘基，導致其失去血管擴張的功能，造成血壓升高[6-7]。因此，抑制ACE 一直是治療高血壓的一種有效方法。目前市面上已有降壓藥，降壓效果強，但在服用后往往會對人體產生副作用[8-10]。然而，具備ACE 抑制功效的生物活性肽由于分子量小，易吸收，無毒副作用，安全性高等特點[11-12]，具有研發降壓藥物的潛力。

ACE 是一種鋅金屬蛋白酶，具有C-端和N-端兩個功能結構域，C-端結構域包括3 個催化活性位點S1、S1’和S2，S1 活性口袋包含Ala354、Glu384和Tyr523；S2 包含Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520；S1’包含Glu162，三個位點均具備疏水性特征[13]。大多數ACE 抑制肽都作用于其C-端結構域[14]，ACE抑制肽序列中疏水氨基酸殘基的含量，在一定程度上決定了其ACE 抑制活性[15]。ACE 的3 個活性位點有各自親和的氨基酸殘基，S1 親和Pro 和芳香族氨基酸；S1’親和Val、Ala 和Leu；S2 親和Ile[16-17]。多肽C-末端3 個氨基酸殘基的改變對ACE 抑制活性影響較大[18]。研究表明多肽C-末端第2 個氨基酸為Lys 或Arg 時對ACE 的抑制活性會有所提高[19-20]。此外，當多肽的N-端含疏水性氨基酸Ala、Leu、Ile 和Val 時，能夠促進多肽與ACE 催化活性位點的結合。

目前，合成得到的許多多肽類ACE 抑制劑已被證明具有良好的ACE 抑制活性，例如，Ashok 等[21]使用固相合成法合成了水牛初乳蛋白中的ACE 抑制肽GIPLPLI（IC50為74 μmol/L）。Mirzaei 等[13]通過固相合成4 種YR-10（YGKPVAVPAR，來源于釀酒酵母蛋白）的多肽類似物，篩選出較YR-10 ACE抑制活性更高YHR-10（YGKHVAVHAR），并進一步研究了合成肽YHR-10 的結構與功能關系，發現通過除去YR-10 N-末端的Tyr 和C-末端的Arg 得到的GA-8（GKPVAVPA），ACE 抑制活性降低了3.31倍。此外，Deng 等[22]設計了10 種抗氧化肽LWHTH（來源于海鞘組織）的多肽類似物，經過固相合成得到的多肽類似物CWHTH 不僅具備抗氧化活性，還發現其對ACE 表現出了良好的抑制作用。

雖然近年來已有大量動物源ACE 抑制肽被分離鑒定，但大量抑制肽仍具有提升ACE 抑制活性的空間。定向改造多肽不僅能夠發掘高活性多肽，也可以了解多肽性質與功能的聯系。丙氨酸掃描文庫技術是一種有價值的方法，已被廣泛應用于多肽的構效關系研究中[23]。同時，隨著生物信息學的快速發展，大量的多肽信息被儲存于數據庫中并且建立了多肽分析及活性預測工具，利用這些工具可以快速篩選生物活性肽。

本研究前期從豬血紅蛋白源多肽（Pig Hemoglobin Peptide, PHP）中篩選出了2 條ACE 抑制肽：PHP1（VVYPWT）和PHP2（TKTYFPHF），IC50分別為7.42 和5.33 μmol/L[24-25]，具備較高的ACE 抑制活性，但這2 條ACE 抑制肽的構效關系尚未明確。因此，本文以PHP1 和PHP2 作為研究母肽，利用丙氨酸掃描文庫技術結合生物活性預測工具對研究母肽進行定向改造，設計新型多肽類ACE 抑制劑，篩選高ACE 抑制活性多肽，研究多肽序列中氨基酸疏水性、帶電性及空間位阻等性質對其活性的影響，探索構效關系，同時發掘具備多種生物活性的ACE 抑制肽，為開發多功能性的多肽產品提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Fmoc-Thr（tBu）-王樹脂、Fmoc-Phe-王樹脂、Fmoc-氨基酸、Boc-氨基酸、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate, HBTU）、1-羥基苯并三唑（1-Hydroxybenzotriazole, HOBt）、N，N’-二異丙基乙胺（N,N'-Diisopropylethylamine, DIEA）、三異丙基硅烷（Triisopropylsilane, TIS） 吉爾生化（上海）有限公司；乙腈 色譜純，美國TEDIA；血管緊張素Ⅰ轉換酶（ACE，源自兔肺，酶活力≥2.0 U/mg 蛋白）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰基]-Phe-雙甘氨酸（N-[3-（2-furyl）acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine, FAPGG）

Sigma 公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-（2-hydroxyethyl） piperazin-1-yl]ethanesulfonicacid, HEPES）

阿拉丁試劑有限公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力1 kU/13.2 mg） 北京索萊寶科技有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,p-NPG） 上海源葉生物科技有限公司；總抗氧化能力試劑盒 上海碧云天試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

島津LC-20A 型高效液相色譜儀、島津LC-20AP制備型高效液相色譜儀 日本島津公司；YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×150 mm，粒度5 μm）分析色譜柱日本YMC 公司；Agilent ZORBAX SB-C18（21.2 mm×150 mm，粒度5 μm）制備色譜柱、Agilent 1260/6130 型液質聯用儀 美國Agilent 公司；HXGL-10-50B 型冷凍干燥機 上海滬析實業有限公司；Molecular Devices 多功能讀板機 美國Thermo 公司；100 mL G-2 固相合成反應管 日本Cosumosubiido 株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 多肽類似物的設計及生物信息學分析

1.2.1.1 多肽類似物的設計 利用丙氨酸掃描文庫技術結合生物活性預測工具PeptideRanker 篩選母肽PHP1 及PHP2 的可突變位點。根據氨基酸的疏水性、帶電性和空間位阻，將母肽PHP1 及PHP2 序列中部分氨基酸殘基進行替換，設計多肽類ACE 抑制劑類似物序列。

1.2.1.2 多肽類似物的生物信息學分析 多肽的理化性質預測：使用ExPASy（https://www.expasy.org/）的ProtParam 分析工具分析多肽的各項理化參數，包括理論等電點、凈電荷、疏水性殘基比率、半衰期[26]等。

多肽的生物活性、毒性預測：利用BIOPEPUWM（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/）的Bioactivity prediction 模塊中的AHTpin 平臺預測設計的多肽類似物是否具備ACE 抑制活性[27]。利用Bioware 生信分析工具（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/）的PeptideRanker 模塊預測多肽的潛在生物活性[28]。利用ToxinPred 數據庫（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/index.html）預測多肽的毒性[29]。

1.2.2 多肽的固相合成及純化

1.2.2.1 固相合成目標肽 利用固相合成法合成目標肽，多肽鏈C-末端的氨基酸（amino acid，aa）固定于王樹脂（即Fmoc-aa-王樹脂），以該氨基酸的氨基端作為合成起點，根據多肽從C-端到N-端的合成順序，通過氨基酸間的脫水縮合使下一位氨基酸偶聯到樹脂上，直到目標肽N-末端最后一個氨基酸反應完為止，實現將目標肽鏈連接到樹脂上，隨后切割樹脂，得到目標肽。具體合成步驟如下：

溶脹Fmoc-aa-王樹脂：取1 g Fmoc-aa-王樹脂，裝入固相合成器中，移取15 mL 二氯甲烷（Dichloromethane, DCM）加入其中等待15 min，使樹脂得到充分膨潤，隨后抽濾除去DCM。

脫除氨基保護基Fmoc：加入15 mL 體積分數為20%的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）攪 拌 反 應30 min 后 抽 濾，用DCM 和異丙醇反復洗滌并抽干，取出微量樹脂，通過Kaiser 法檢測樹脂顏色變化，以此來監測反應進程，若樹脂呈現藍紫色，說明Fmoc 已除去，氨基酸的氨基暴露，可進行下一步反應。

目標肽的產生：將Fmoc-氨基酸（2 eq）和縮合試劑HBTU（2 eq）、HOBt（2 eq）依次溶于DMF 中，加入到固相合成器中，加入氨基酸活化試劑DIEA（4 eq），攪拌反應1.5 h，經DCM 和異丙醇洗滌，參照Kaiser 法[30]監測反應進程，由此實現肽鏈的延長。重復上述脫除Fmoc 和肽鏈延長步驟過程，直至接入目標肽N-末端最后一個由Boc/Fmoc 保護的氨基酸，至此側鏈及N-端保護的目標肽連接到了樹脂上。若最后一個氨基酸由Fmoc 保護，則先脫除Fmoc，再進行下一步操作。

樹脂及保護基的切割：將合成完畢的肽鏈-樹脂用15 mL DCM 溶脹后抽濾，加入15 mL 三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）/TIS/H2O（體積比 95:2.5:2.5），常溫下反應1.5～2.5 h，取出反應液旋蒸干燥，倒入冰乙醚結晶，待乙醚揮發完全加入甲醇溶解樣品，旋蒸干燥后加入冰乙醚再次結晶，取沉淀減壓干燥，得到多肽粗品。

1.2.2.2 目標肽的純化 RP-HPLC 制備精制：ZORBAX SB-C18制備色譜柱，流動相A：0.1% TFA/水，B：0.1% TFA/乙腈；洗脫條件：流動相B 在0～20 min，梯度變化為30%～80%；220 nm 波長檢測，流速20.0 mL·min-1；進樣0.5 mL，柱溫30 ℃。產物經真空冷凍干燥處理后經質譜鑒定分子量。

RP-HPLC 純度分析：YMC-Pack ODS-A 分析色譜柱，流動相A：0.1% TFA/水，B：0.1% TFA/乙腈；洗脫條件：流動相B 在0～15 min，梯度變化為30%～80%；檢測波長220 nm，流速1.0 mL·min-1；進樣10 μL，柱溫30 ℃。

1.2.3 多肽的體外生物活性測定

1.2.3.1 ACE 抑制活性測定 根據文獻[31]的方法測定ACE 抑制活性。首先，FAPGG 用含有300 mmol/L NaCl 的80 mmol/L HEPES 緩沖液（pH8.3）配制成1 mmol/L 的溶液。精確稱取多肽樣品4 mg，用緩沖液配制成2000 μg/mL，稀釋到400、80、16、3.2、0.64 μg/mL 不同濃度，取這6 個濃度梯度的樣品溶液進行實驗，做3 組平行。取40 μL 樣品和50 μL FAPGG 溶液混勻，隨后加入10 μL 的ACE 溶液（0.1 U/mL），立即置于340 nm 下檢測吸光度，隨后放入培養箱，37 ℃下孵育，待反應30 min 后再次檢測吸光度。HEPES 緩沖液作為空白對照組，在同等條件下測定反應前后吸光度差值。計算對ACE 的抑制率達到50%時的多肽濃度IC50，ACE 抑制率的計算公式如下：

式中：A 為樣品組反應前后的吸光度差值；B 為空白對照組反應前后吸光度差值。

1.2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定采用優化的Xu 等[32]的方法。精確稱取多肽樣品4 mg，用PBS 緩沖液配制成2000 μg/mL，稀釋到1000、100、10、1、0.1 μg/mL 不同濃度，取這6 個濃度梯度的樣品溶液進行實驗，做3 組平行。取20 μL p-NPG 溶液（9 mmol/L）與20 μL樣品溶液混勻，37 ℃下孵育10 min，隨后加入20 μLα-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL），37 ℃下反應20 min，反應結束后立即加入150 μL Na2CO3溶液（0.1 mmol/L）終止反應，于405 nm 處測定吸光度。采用下方公式計算α-葡萄糖苷酶抑制率：

式中：A1為樣品、酶和p-NPG 混合液的吸光值；A2為緩沖液代替樣品溶液的吸光值；A0為緩沖液代替酶溶液后混合物的吸光值。

1.2.3.3 抗氧化活性測定 采用ABTS 法[22]表征多肽樣品的抗氧化活性，具體操作方法參照總抗氧化能力試劑盒的說明。儲備溶液包括ABTS 溶液和氧化劑溶液，將兩者等量混合，室溫避光存放16 h 得到ABTS 工作母液，用80%乙醇稀釋得到ABTS 工作液，于734 nm 下測定吸光度（工作液吸光值-空白對照吸光值=0.7±0.05）。用80%乙醇將多肽樣品配制成1 mg/mL 的溶液。將200 μL ABTS 工作液加入96 孔板的檢測孔中，隨后加入10 μL 樣品溶液并混勻，室溫孵育2～6 min，測定A734。蒸餾水作空白對照，Trolox 作陽性對照。ABTS 自由基清除率計算公式如下：

式中：A 為加入樣品和ABTS 的吸光值；B 為不加樣品，加入ABTS 的吸光值。

1.2.4 多肽與ACE 的分子對接 從PDB 數據庫中下載ACE-Lisinopril 復合物的晶體結構（PDB ID：1O8A），使用Pymol 軟件對其進行預處理，刪除Lisinopril 配體，去水，加氫，得到ACE 蛋白分子。使用ChemBioDrawUltra 14.0 繪制多肽分子，之后利用ChemBio 3D Ultra 14.0 對多肽進行能量最小化處理，得到多肽小分子空間構象。利用AutoDock Vina 軟件打開處理過的ACE 大分子和多肽小分子，將其分別設置為受體和配體，設置對接盒子，選擇半柔性對接方式，進行20 次對接。分析對接結合能，選取對接結果中的最佳構象，使用Pymol 軟件和Protein-Ligand Interaction Profiler 在線工具進一步分析。

1.3 數據處理

采用軟件SPSS 16.0 對實驗數據進行分析處理，數值用均值±標準差表示，每個試驗平行三次。

2 結果與分析

2.1 多肽類似物的設計

以ACE 抑制肽PHP1 和PHP2 為研究母肽，對PHP1 和PHP2 進行丙氨酸掃描，即用丙氨酸逐一替換多肽序列中的非丙氨酸殘基，構建丙氨酸掃描文庫。得到的14 種多肽片段通過PeptideRanker 進行生物活性預測，發現PHP1 序列第3、4、5 位的Tyr、Pro、Trp 和PHP2 序列第4、5、6、8 位的Tyr、Phe、Pro、Phe 分別用Ala 替換后，預測活性明顯降低，說明母肽序列中處于這些位置的原氨基酸殘基改變可能會導致其活性的降低甚至喪失。因此，本研究在設計新型多肽類ACE 抑制劑時，保留母肽序列中這些位置的氨基酸殘基，改變其他位置的氨基酸殘基，設計的19 個多肽類似物見表1。

表1 PHP1、PHP2 及其類似物的序列Table 1 Sequence of PHP1, PHP2 and their analogues

優化PHP1 第1、2、6 位氨基酸殘基：將母肽PHP1 序列中第1 和2 位Val 殘基替換為帶巰基的Cys，分別得到多肽類似物PHP1A-1 和PHP1A-2；將母肽PHP1、PHP1A-1 和PHP1A-2 序列中的C-端Thr 殘基替換為強疏水性的芳香族氨基酸Phe，分別得到PHP1A-3、PHP1A-4 和PHP1A-5；在PHP1A-3 基礎上，將序列中第1、2 位的Val 殘基，分別用空間位阻小的Gly 和Ala 替換，得到PHP1A-6 和PHP1A-7。

優化PHP2 第1、2、3、7 位氨基酸殘基：將母肽PHP2 序列中第3 位的Thr 殘基變為疏水性強的Leu，得到PHP2A-1；將PHP2A-1 中的第1 位Thr 殘基替換為疏水性強的Ile 和Ala，分別得到PHP2A-2 和PHP2A-3；在PHP2A-2 和PHP2A-3 基礎上，將序列中第2 位帶正電荷的Lys 殘基替換為不帶電荷且具有疏水性的Ala，得到PHP2A-4 和PHP2A-5；將PHP2A-5 序列第7 位帶正電荷的His 替換為不帶電荷的Leu，得到PHP2A-6；將PHP2A-3 序列第3 位的Lue 替換為Ala，第7 位的His 殘基用帶有胍基的Arg 替換，得到PHP2A-7；將PHP2A-3～PHP2A-7 中的Ala 殘基替換為側鏈更小的Gly，得到PHP2A-8～PHP2A-12。

2.2 多肽的理化性質

PHP1 和PHP2 及多肽類似物的各項理化性質如表2 所示。PHP1 系列的等電點均在5.5 左右，PHP2 系列的等電點在5.5～10 之間。總平均親水性指數（GRAVY）是多肽中氨基酸殘基親水值總和的平均值，正值越大疏水性越強，負值越大親水性越強，PHP1 及類似物都是疏水性多肽，PHP2 系列中，PHP2A-12 親水性最強，PHP2A-6 疏水性最強。脂肪族氨基酸指數（Aliphatic index）可作為多肽的熱穩定性指標，指數越高熱穩定性越高，PHP1、PHP1A-3、 PHP2A-2、 PHP2A-4、 PHP2A-6、 PHP2A-9 及PHP2A-11 的熱穩定性相對較高。非穩定性指數（Instability index）是多肽穩定性的參考數值，指數＜40 被定義為穩定性多肽，除PHP2A-11 外，其余序列均為穩定性多肽。半衰期（Half-life）預測結果表明N-端氨基酸殘基的改變對多肽在細胞內的半衰期影響較大，C-端氨基酸殘基改變對其影響較小。

PeptideRanker 預測得出的生物活性分數代表了多肽具備生物活性的可能性大小，閾值為0.5，即任何預測超過0.5 閾值的多肽都被認為具備潛在的生物活性，預測結果顯示多肽類似物均具有潛在的生物活性，且絕大多數肽具有較高的活性分數，結果見表2。此外，AHTpin 平臺預測設計的多肽類似物均具備ACE 抑制活性，ToxinPred 預測所有設計的多肽均沒有毒性。

表2 PHP1、PHP2 及其類似物的理化性質Table 2 Physicochemical properties of PHP1, PHP2 and their analogues

2.3 多肽的合成純化與體外生物活性

如表3 所示，通過多肽固相合成法合成了母肽及其類似物，并通過反相高效液相進行了分析及純化，目標多肽經純化后的純度均在95%以上。經質譜確定目的多肽分子量與理論分子量一致。

母肽PHP1、PHP2 及其多肽類似物的ACE 抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性結果如表3 所示。

表3 合成肽的生物活性Table 3 Bioactivity of synthetic peptides

ACE 抑制活性結果表明PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4、PHP2A-7 的抑制活性最高，IC50分別為3.87、3.33、2.86 和4.58 μmol/L，PHP1A-6、PHP2A-7 與母肽活性相比差異顯著（P＜0.05），PHP2A-3、PHP2A-4 與母肽活性相比差異極顯著（P＜0.01），它們的抑制活性比母肽高2～3 倍；PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1 和PHP2A-10 具有同母肽相當的抑制活性。多肽類似物改變N-端氨基酸殘基會導致抑制活性發生較大變化，Liu 等[33]指出多肽N-端氨基酸的改變會影響食物來源ACE 抑制肽的活性。在PHP1 系列設計肽中，N-端使用疏水性更弱的Cys 替換Val（PHP1A-1、PHP1A-2），衍生肽活性與母肽相比顯著降低；在PHP2 系列設計肽中，N-端Thr 和Lys 替換成疏水性更強的Ile 或Leu 或Ala得到的PHP2A-1、PHP2A-3、PHP2A-4 有較高的ACE 抑制活性。表明疏水性對不同多肽ACE 抑制活性會產生不同的影響，在多肽序列N-端含有Val、Leu、Ala、Ile 等疏水性氨基酸時，多肽與ACE 活性中心的結合效率有所增強，從而增加了對ACE 的抑制活性[34]。

PHP1 系列設計肽中，N-端氨基酸Val 用空間位阻小的Gly 或Ala 替代后具有高ACE 抑制活性；而在PHP2 系列設計肽中，N-端氨基酸Thr 或Lys 用空間位阻小的Gly 或Ala 替代后仍能夠保持良好的ACE 抑制活性，體現了多肽中氨基酸空間位阻的變化對ACE 抑制活性有影響[35]。PHP2 系列多肽帶電性與ACE 抑制活性沒有明顯的相關性。

多肽C-端氨基酸的改變也會對活性產生影響。當酪蛋白和羊奶乳清提取多肽的C-端三個氨基酸中存在Pro 時，會提高其ACE 抑制活性[36]，芳香族氨基酸Phe、Tyr、Trp 的存在也會增強多肽對ACE 的抑制作用[37]。本研究設計多肽的C-端三肽中保留了原有的Pro 或將C-端的Thr 替換為Phe 后，設計肽仍能保持與母肽相當的活性。此外，PHP2 序列中的His 替換為Leu 會降低ACE 抑制活性，PHP2A-7 中Arg 的引入對其活性產生了積極影響。本研究發現C-端第二位為His 或Arg 時對多肽的ACE 抑制活性有著非常重要的作用，原因可能是His 的咪唑環和Arg 的側鏈胍基的存在會更有利于多肽與ACE 的結合[13]。

綜上所述，多肽序列中氨基酸殘基的疏水性、空間位阻及其序列中位置對其ACE 抑制活性影響較大。

α-葡萄糖苷酶抑制活性結果顯示，母肽及其多肽類似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性與PeptideRanker預測活性接近。母肽PHP1 的α-葡萄糖苷酶抑制作用不明顯，PHP2 的抑制活性IC50為296.79 μmol/L。PHP1 系列多肽類似物抑制活性較母肽都有明顯提高，其中，PHP1A-3 和PHP1A-7 的IC50分別為3.09，9.51 μmol/L，它們具備高活性的原因分析是肽段C-端含有的Phe 增加了多肽的疏水性，因此增加了α-葡萄糖苷酶抑制活性。與PHP1A-3 比較發現，PHP1A-7的序列N-端用Ala 替代序列中的Val 后，多肽的活性降低了，這與研究發現的高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽往往是高度疏水的，多肽中的強疏水性氨基酸Val、Ile、Leu 及Phe、Pro、Ala 等疏水氨基酸殘基更易與α-葡萄糖苷酶的氨基酸殘基結合，從而發揮對α-葡萄糖苷酶抑制的結論一致[38-40]。分析認為多肽N-端疏水性強具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制作用。

研究表明，高α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽的凈電荷多為0 或+2[41]，本研究中PHP2 系列設計肽中除PHP2A-7 和PHP2A-10 外，其余凈電荷為0 或+2的多肽活性較母肽均有顯著提高，表明凈電荷可能與PHP2 系列設計肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性有關。與PHP2A-3 相比，Ala、Arg 替換Leu、His 得到的PHP2A-7 降低了多肽疏水性，可能是導致其α-葡萄糖苷酶抑制活性降低的原因；同樣的，與PHP2A-9 相比，用Gly 替換Ile 得到的PHP2A-10 抑制活性也較母肽有所降低。

多肽類似物PHP2A-6、PHP2A-11 和PHP2A-12 表現出了最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分別為5.58、2.35 和3.98 μmol/L，較母肽有極顯著性提高（P＜0.01），三種多肽類似物均具有潛在的降血糖活性。Arise 等[42]發現多肽中Leu 含量高可能會增加α-葡萄糖苷酶抑制活性，PHP2A-6、PHP2A-11 序列中含有2 個Leu 可能是其具備高活性的原因。多肽序列中氨基酸空間位阻的變化與其α-葡萄糖苷酶抑制活性沒有相關性。

綜上所述，多肽序列中氨基酸的疏水性、凈電荷及其序列中位置對其α-葡萄糖苷酶抑制活性影響較大。

抗氧化活性表明，多肽濃度為1 mg/mL 時，含有Cys 的多肽類似物PHP1A-1、PHP1A-2、PHP1A-4 和PHP1A-5 的ABTS+·清除率均較高，與母肽相比差異極顯著（P＜0.01），這是因為Cys 上的巰基使得多肽具備強的抗氧化能力[43]，本研究發現當Cys 殘基處于肽鏈N-端第1 位比在2 位時具有更好的抗氧化能力，可能是由于Cys 處于末端時，多肽巰基基團更易與自由基接觸產生反應。研究表明多肽序列中存在Leu、Pro、Phe、Ala 等疏水性氨基酸有利于提高抗氧化活性，可能是疏水性氨基酸作為供氫體與ABTS+·反應，提高了多肽的自由基清除能力[44]。PHP2A-5 和PHP2A-6 的抗氧化活性較母肽有所提高，這可能與Ala 替換了Thr、Lys，Leu 替換了His，保留了序列中的Pro、Phe，提高了多肽的疏水性有關。

2.4 ACE 抑制肽-ACE 的分子對接

ACE 抑制活性 較高的PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4 和PHP2A-7 分別與ACE 進行分子對接，對接結果經Pymol 軟件分析抑制肽與ACE 的氨基酸殘基之間形成的氫鍵情況（如圖1）。經Protein-Ligand Interaction Profiler 分析抑制肽與ACE 疏水相互作用、π-π堆積及鹽橋。

圖1 ACE 與多肽類似物的復合物模型Fig.1 The models of ACE in complex with the peptide analogues

PHP1A-6 與ACE 的Asn277（2.9 ?）、Ala354（3.2 ?）、Glu376（2.8 ?）、Glu376（2.9 ?）、Asp377（2.9 ?）、Glu384（3.0 ?）、Asp453（2.7 ?）、Lys454（3.0 ?）之間形成8 個氫鍵，其中，Ala354、Glu384在ACE 的S1 活性口袋中，PHP1A-6 進入ACE 活性口袋，C-端和N-端氨基酸殘基都與ACE 產生了氫鍵相互作用，其中N-端Gly讓出了更大的空間使得肽鏈中其余氨基酸殘基與ACE 產生了氫鍵。PHP1A-6 與ACE 的Thr166、Trp279、Glu376、Val379、His383、Phe512、Val518、Tyr523之間存在疏水相互作用。PHP1A-6 中Trp 的吲哚基與His383的咪唑環之間形成了π-π堆積作用。PHP1A-6 的C-端羧基與His383、His387之間形成了鹽橋。

PHP2A-3 與ACE 的Glu162（3.0 ?）、Gln281（3.1 ?）、Thr282（2.7 ?）、His353（3.1 ?）、Glu376（2.9 ?）、His513（2.7 ?）、Tyr523（2.7 ?）之間形成7 個氫鍵。PHP2A-3 與 Ala354、 Trp357、 Val379、 Val380、 His383、 Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之間產生疏水相互作用。PHP2A-3 中Tyr 的芳香環與His387之間形成了π-π堆積作用。

PHP2A-4 與ACE 的Glu162（2.8 ?）、Thr282（2.8?）、His353（3.2 ?）、His513（2.9 ?）、Tyr523（2.8 ?）之間形成5 個 氫 鍵。PHP2A-4 與Ala354、Asp358、Tyr360、Val379、Val380、His383、Phe391、Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之間產生疏水相互作用。PHP2A-4 中Tyr 的芳香環與His387之間形成了π-π堆積。

PHP2A-7 與ACE 的Glu162（3.1 ?）、Thr282（2.8 ?）、His353（3.1 ?）、Glu376（2.9 ?）、Asp377（3.0 ?）、His513（2.7 ?）、Tyr523（2.7 ?）之間形成7 個氫鍵。PHP2A-7 與 Trp279、 Thr282、 Ala354、 Trp357、 Val379、 Val380、His383、Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之間產生疏水相互作用。PHP2A-7 中Tyr 和Phe 的芳香環與His383、His387產生了π-π堆積作用。肽鏈中的Arg與Glu162、Glu376、Asp377作用形成了鹽橋。

PHP2A-3、PHP2A-4 及PHP2A-7 主要與S1 活性口袋中的Tyr523，S2 的His353，His513，S1’形成了氫鍵相互作用。PHP2A-3、PHP2A-4 和PHP2A-7 主要是其N-端高疏水性氨基酸殘基與ACE 之間產生了疏水相互作用，C-端氨基酸與ACE 的部分氨基酸殘基之間產生了氫鍵、肽鏈中的Tyr 和Phe 與ACE的His387形成了π-π堆積，PHP2A-7 的Arg 還與ACE之間產生了鹽橋，從而發揮較強的ACE 抑制作用，因此，證明了PHP2 系列多肽N-端氨基酸殘基疏水性強會增加對ACE 抑制活性，并且保留C-端的Phe和Pro 及引入Arg 對ACE 的抑制起到了積極的作用。

3 結論

本研究以ACE 抑制肽PHP1 和PHP2 為母肽，經丙氨酸掃描誘變結合生物活性預測篩選出了母肽序列中的可突變位點并對其進行氨基酸替換，設計了19 個新型ACE 抑制肽類似物。生物信息學分析結果顯示，多肽類似物均具備潛在的生物活性且無毒性。通過固相合成法合成了母肽及其類似物，產物經RP-HPLC 純化和分析后的純度均在95%以上。ESI-MS 鑒定目的多肽分子量與理論分子量一致。通過驗證新型多肽的體外生物活性，表明氨基酸殘基的疏水性、空間位阻及其序列中位置對ACE 抑制活性影響較大，多肽的N-端疏水性越強，ACE 抑制作用越強，當N-端氨基酸替換為空間位阻小的Gly 和Ala 時，多肽的ACE 抑制活性變強。對新型多肽分子和ACE 進行分子對接，多肽抑制劑與ACE 之間形成多個氫鍵、疏水相互作用、π-π堆積和鹽橋，增加了對ACE 的抑制作用。綜上，本研究設計的多肽類似物均具有較高的ACE 抑制活性，其中，PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4 和PHP2A-7 的ACE 抑制活性較母肽有顯著性提高（P＜0.05），PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1 和PHP2A-10 具有同母肽相當的抑制活性，其余多肽類似物的ACE 抑制活性較母肽有所降低，IC50介于10～60 μmol/L 范圍內。絕大部分多肽類似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性與母肽相比均有明顯提高，PHP1A-3、PHP1A-7、PHP2A-6、PHP2A-11 和PHP2A-12 的α-葡萄糖苷酶抑制作用最強。其中，PHP1A-3 和PHP1A-7 具備較強的ACE 抑制和α-葡萄糖苷酶抑制雙重活性，具有進一步研究價值。多肽類似物中含有Cys 的片段具有較高的ABTS+·清除率，具備潛在的抗氧化活性。