駿棗多糖的分離純化、結構表征及抗氧化活性研究

趙建成，劉慧燕，方海田

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

紅棗（Ziziphus jujubaMill）作為我國特有的“藥食兩用”植物[1]，具有4000 多年的栽培歷史，棗樹在中國的種植面積超過世界棗樹種植面積總量的95%[2]，據研究報道，棗果含有豐富的蛋白質、多糖、環核苷酸和有機酸等多種營養成分[3]，具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、補氣血[6]、調節腸道菌群[7]、降血糖[8]等多種生物活性。駿棗（Zizyphus jujubacv. Junzao），為鼠李科棗屬的果實，是我國特有的果品之一，果實色澤鮮艷、酸甜適口，平均果重22.9 g，含可溶性固形物33%，可食率96.3%，深受人們的青睞[9]。

植物多糖是一類具有多種生理功能的天然物質，由于其高效、低毒等特性，在食品中的抗氧化作用日益受到人們的重視[10]。多糖是紅棗中含量最豐富的一種生物活性物質，紅棗多糖的生物活性主要體現在抗氧化活性、抗腫瘤活性和免疫學活性等方面[11]。紅棗多糖常用的提取方法有：水提醇沉法、超聲波輔助提取法、酶解法和亞臨界輔助提取法等[12-13]。采用水提醇沉法提取紅棗多糖，具有操作簡單，安全，綠色環保等優點，是目前最常用的一種提取工藝[14]。Wang 等[15]通過水提醇沉的方法，從臨澤小棗中分離純化出LZJP3 和LZJP4 兩種多糖，其中，LZJP3 是由半乳糖的聚合物組成，LZJP4 是由木糖和葡萄糖的聚合物組成，且LZJP3 和LZJP4 對DPPH 自由基和羥自由基均具有良好的抗氧化活性。

目前，關于駿棗多糖的結構及抗氧化活性的研究很少。因此，本研究以駿棗為原料，通過水提醇沉法提取駿棗粗多糖，再對駿棗粗多糖進行分離純化，分析純化后駿棗多糖組分的結構特征及抗氧化活性。旨在為駿棗多糖產品的開發及作為潛在抗氧化劑的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

駿棗（Ziziphus jujubacv. Junzao） 寧夏杞源堂生物科技有限公司；無水乙醇、三氯乙酸、苯酚、氫氧化鈉、氯化鈉 天津市大茂化學試劑廠；30%過氧化氫 分析純，煙臺市雙雙化工有限公司；濃硫酸分析純，寧夏恒元創科貿有限公司；單糖標準品甘露糖（Man）、果糖（Fuc）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和木糖（Xyl） 色譜純，均來自上海源葉生物科技有限公司。

L550 臺式低速大容量離心機 長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；HHS-21-8 電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠；SCIENTZ-10N 冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；752N 型紫外-可見分光光度計 上海精科實業有限公司；T27 傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；NW10VF 型超純水系統 上海力康生物科技有限公司；Verios G4 掃描電子顯微鏡 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 駿棗粗多糖提取 新鮮駿棗清洗干凈后切成薄片，置于烘箱內80 ℃，9 h，用研缽搗碎，過50 目篩，駿棗粉裝瓶備用。稱取10 g 駿棗粉，采用水提醇沉法[16]，提取條件為：采用去離子沸水以20:1（m/v）液料比提取2 次，每次3 h。然后合并上清液（以6000 r/min 離心15 min），去除沉淀。上清液用旋轉蒸發儀在65 ℃真空條件減壓濃縮至原體積的四分之一，合并兩次旋蒸濾液備用。再加入4 倍體積乙醇（85%）過夜，將過夜后的粗多糖溶液離心（8000 r/min，10 min），取沉淀備用；最終所得沉淀即為駿棗粗多糖，命名為HZPC。

1.2.2 駿棗粗多糖脫色、脫蛋白 駿棗粗多糖用30%H2O2脫色后[17]，采用三氯乙酸除蛋白[18]，以m（HZPC）:m（TCA）=1:1.5 的比例，加入體積分數為5%的三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA）溶液，在4 ℃冰箱中靜置5 h，在4500 r/min 離心15 min，棄去沉淀，保留上清液。樣液濃縮至原來體積的四分之一，用蒸餾水透析（1 d）、旋蒸、凍干后備用，將脫色除蛋白后得到的駿棗粗多糖命名為HZPC-Y。

1.2.3 駿棗粗多糖的分離純化 DEAE-52 纖維素陰離子交換層析柱分離：采用楊燕敏[19]的方法對DEAE-52 纖維素進行預處理、裝柱等，將HZPC-Y（2.5 g）溶解在蒸餾水（500 mL）中，配制成5 mg/mL的多糖溶液，8000 r/min 離心5 min，取10 mL 上清液，用0.45 μm 的水系濾膜過濾后，將多糖溶液緩慢加入DEAE-52 陰離子纖維素離子交換柱（25 mm×500 mm）中，分別以0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mol/L的NaCl 洗脫液為流動相進行洗脫，流速控制為2 mL/min，自動收集器每5 min 收集1 管，每管10 mL，收集120 管。采用苯酚-硫酸法[20]，在490 nm 處測定每管洗脫液中的多糖含量，以管數為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，合并不同吸收峰的洗脫液進行減壓濃縮、透析（48 h）、冷凍干燥得初步純化的多糖組分。利用標準曲線方程計算葡萄糖的濃度。按下式計算樣品中多糖得率：

式中：C 為樣品溶液中葡萄糖濃度（mg/mL）；D 為樣品溶液稀釋倍數；f 為換算因子，0.9；m 為駿棗多糖干粉質量，g。

準確稱取初步純化多糖組分2.5 g 溶解于500 mL去離子水中，配制成5 mg/mL 的駿棗多糖溶液，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾。將樣品溶液緩慢加于葡聚糖凝膠柱中（25 mm×500 mm），用去離子水洗脫，洗脫液的流速為2 mL/min，收集洗脫液，每管4 mL，收集30 管。純化后HZPC-2 組分再經減壓濃縮、透析、凍干后進行后續實驗。

1.2.4 HZPC-2 的紫外吸收光譜和傅里葉紅外光譜分析 精密稱取HZPC-2 樣品，用超純水配制成1 mg/mL 溶液，置于比色皿中。將比色皿置于分光光度儀，進行200～400 nm 全波長掃描記錄，觀察在280 nm 附近是否存在吸收峰[21]。

取純化組分HZPC-2（2 mg）與干燥平衡（36 h）的KBr 粉末按質量比1:100 在瑪瑙研缽中充分研磨，直至制成的KBr 切片表面晶瑩通透無雜質。首先進行背景掃描干擾，在4000～500 cm-1的條件下，測定多糖中的有機官能團[22]。

1.2.5 多糖的均一性和分子量測定 用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）測定樣品的均一性和分子量。根據文獻的方法[23]進行檢測，略有修改。將純化的多糖應用于BRT105-104-102 串聯凝膠柱（8 mm×300 mm）的凝膠過濾層析柱。該柱保持在40 ℃的溫度下，以0.6 mL/min 的流速用0.05 mol/L 的氯化鈉溶液洗脫。使用不同分子量（5000、11600、23800、48600、148000，273000、409800 和667800 Da）的葡聚糖進行柱（BRT105-104-102 串聯凝膠柱）的初步校準。

1.2.6 單糖構成分析 采用離子色譜法[24]對HZPC-2 進行單糖組成測定。取HZPC-2（5.0 mg）在120 ℃的安瓿瓶中，用2 mL 三氟乙酸（TFA，3 mol/L）水解2 h，吸取酸水解溶液轉移至管中用氮吹儀吹干，加入10 mL 去離子水混勻，取40 μL 酸水解溶液定容至1000 μL 容量瓶中，12000 r/min 離心5 min。取上清進IC 分析。以H2O 和15 mmol/L 氫氧化鈉、100 mmol/L 過氧化鈉為流動相，流速控制在0.3 mL/min，進樣體積是5 μL；柱溫保持在30 ℃。最后使用電化學檢測器對水解產物進行分析。

1.2.7 掃描電子顯微鏡觀察 取適量的HZPC-2 平鋪于導電膠，并用粉塵球吹走殘余的樣品，選擇5 mA 電流分兩次噴金，每次30 s，再將樣品置于電子顯微鏡下（1×10-5Pa、20 kV）觀察其微觀結構。

1.2.8 駿棗多糖HZPC-2 的DPPH 自由基、ABTS 由基和羥自由基清除率測定

1.2.8.1 DPPH·清除率的測定 參考何坤明等[25]的方法略有修改，分別配制濃度為1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL 的駿棗多糖HZPC-2 的溶液。依次加入2.0 mL 不同質量濃度的HZPC-2 溶液與2.0 mL 0.1 mmol DPPH（乙醇溶解）搖勻，室溫下避光反應30 min，于517 nm 處測量吸光值，VC作為陽性對照。實驗重復3 次，計算DPPH 自由基清除能力。

式中，A0：無樣液反應混合物溶液吸光度；Ai：1 mL 樣品溶液+2 mL DPPH 溶液的吸光值；Aj：1 mL樣品溶液+2 mL 乙醇的吸光值。

1.2.8.2 ABTS 陽離子自由基清除率的測定 參照伍燕等[26]的方法略有修改。將ABTS 自由基儲備溶液稀釋至吸光度為0.70±0.02。再將1 mL 不同濃度（1.0～5 mg/mL）的5 個多糖樣品分別與2 mL 新鮮ABTS 溶液混勻，室溫下避光靜置6 min，于734 nm波長處測定吸光值，VC作為陽性對照。實驗重復3 次，計算ABTS 自由基清除率。

式中：A0：無樣液反應混合物溶液吸光度；Ai：1 mL 樣 品 溶 液+2 mL ABTS 溶 液 的 吸 光 值；Aj：1 mL 樣品溶液+2 mL 乙醇的吸光值。

1.2.8.3 羥自由基清除率的測定 參照Wang[27]等的方法略有修改，分別配制濃度為1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 mg/mL 的駿棗多糖HZPC-2 的溶液，首先向試管中加入1 mL 不同質量濃度的HZPC-2 溶液，其次加入2 mL 6 mmol/L 的FeSO4溶液和2 mL 6 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液，最后加入2 mL 6 mmol/L 的H2O2，充分混勻在10 mL 試管中，混合溶液于37 ℃培養30 min 后，測定在510 nm 處吸光度數值，VC作為陽性對照。實驗重復三次，計算羥自由基清除率。

式中： A0：無樣液反應混合物溶液吸光度；Ai：1 mL 樣品溶液+2 mL FeSO4+2 mL 水楊酸-乙醇溶液+2 mL H2O2混合溶液的吸光值；Aj：1 mL 樣品溶液+2 mL FeSO4+2 mL 水楊酸-乙醇溶液的吸光值。

1.3 數據處理

每組實驗均重復3 次，實驗數據使用Excel 2010匯總，繪圖采用Origin 2021 軟件。

2 結果與分析

2.1 DEAE-52 陰離子交換柱分離純化紅棗多糖的結果

采用DEAE-52 纖維素柱對駿棗粗多糖HZPC進行多糖餾分洗脫。由圖1 可直觀看出駿棗粗多糖HZPC 在490 nm 處的吸光值，出現兩個洗脫峰HZPC-1 和HZPC-2，對應的多糖得率分別為3.48%和4.13%，由于HZPC-1 的多糖得率低于HZPC-2，故收集多糖含量較高的組分HZPC-2，即被認定是駿棗多糖HZPC 的主要構成組分。并對HZPC-2 進行減壓濃縮、透析、冷凍干燥后得到初步純化組分。

圖1 HZPC 的DEAE-52 洗脫曲線Fig.1 DEAE-52 elution curve of HZPC

2.2 Sephadex G-100 葡聚糖凝膠柱層析結果

如圖2 所示，將經層析柱初步純化得到的HZPC-2 過Sephadex G-100 凝膠層析柱，得到單一對稱的洗脫峰，說明純化效果良好。收集10～20 管，并進行減壓濃縮、透析、冷凍干燥得到精制駿棗多糖組分HZPC-2 呈白色絮狀。

圖2 HZPC-2 的Sephadex G-100 洗脫曲線Fig.2 Sephadex G-100 elution curve of HZPC-2

2.3 HZPC-2 的紫外吸收光譜和傅里葉紅外光譜吸收光譜結果

如圖3-a 所示，樣品的紫外光譜在280 nm 處未出現吸收峰，表明駿棗多糖HZPC-2 中沒有蛋白質或蛋白質含量極微[28]，這進一步證實前期選用三氯乙酸脫除蛋白效果極佳。如圖3-b 所示，傅里葉紅外光譜是鑒定多糖中特征有機基團的有力技術。HZPC-2 通過FTIR 光譜進行表征，在3416 cm-1附近有一強吸收峰，在2926 cm-1附近有一弱吸收峰，分別歸因于O-H 和 C-H 伸縮振動，這兩個峰都是多糖的特征吸收峰[20]。在1748 cm-1的吸收帶，是一個糖醛酸的特征[29]，這表明HZPC-2 中有糖醛酸的存在。在1285 cm-1范圍內的峰值為糖類化合物的C-H 變角振動[30]。1616 cm-1處相對弱的吸收峰則可能與束縛水的存在有關，在1154 cm-1附近的弱吸收峰是吡喃環骨架的變角振動吸收峰，表明分子中存在C-OH 和C-O-C 結構[31]。在1080 cm-1處出現的吸收峰是半乳糖的特征吸收，這與單糖構成測定結果一致（圖4）。868 cm-1附近的峰值表明該樣品中包含α構型[32]，即具有α-糖苷鍵，是一種α-吡喃葡萄糖。在746 cm-1處存在弱吸收峰，推測可能含有吡喃環結構[33]。綜上所述，HZPC-2 可能具有α-型糖苷鍵。

圖3 HZPC-2 的紫外吸收光譜（a）和傅里葉紅外吸收光譜圖（b）Fig.3 UV (a) and FTIR (b) absorption spectra of HZPC-2

圖4 HZPC-2 單糖構成分析Fig.4 Analysis of monosaccharide composition of HZPC-2

2.4 多糖的均一性和分子量測定

通過HPGPC 測定HZPC-2 的分子質量。得到校正曲線方程為：y=-0.1937x+12.27，線性相關系數R2為0.9929。可知峰位分子質量（Mp）為2.99×104Da，均分子質量（Mw）為3.25×104Da，數均分子質量（Mn）為2.79×104Da。多分散性指數（Mw/Mn）為1.161，與1 接近，說明HZPC-2 的分子質量分布較為密集。

2.5 單糖構成分析

使用離子色譜儀測得HZPC-2 是由七種單糖組成（表1、圖4），根據絕對定量的方法，通過與16 種單糖標準品對比，測定不同單糖質量，根據單糖摩爾質量計算出摩爾比。確定HZPC-2 是由Rha、Ara、Gal、Glc、Xyl、Man、GalA 構成，摩爾比為0.05:0.34:0.29:0.15:0.08:0.02:0.06，同時，Ara 和Gal 比例最高，說明駿棗多糖HZPC-2 主要是由阿拉伯糖、半乳糖所組成。而在Ji 等[34]的研究中，木棗多糖是由Ara、Gal、Glc、Man 和Xyl 構成，摩爾比為 17.36:3.29:2.68:1.05:1.00。可以看出，在駿棗和木棗中Ara 和Gal在各自的單糖組成中所占比例均最高。同時，駿棗多糖與木棗多糖的單糖比例不盡相同，可能是由于不同品種的棗屬及提取純化的工藝不同所致。

表1 HZPC-2 單糖構成分析Table 1 Analysis of monosaccharide composition of HZPC-2

2.6 HZPC-2 的微觀結構

如圖5 所示，為HZPC-2 的掃描電鏡（SEM）照片，在100 μm 分辨率時，是多糖微觀整體輪廓圖[35]，可以觀察到組分HZPC-2 表面呈凹凸不平的溝壑且朝四面八方延伸，四周鑲嵌著形狀不規則的孔狀結構。

圖5 HZPC-2 的SEM 圖像Fig.5 SEM image of HZPC-2

2.7 HZPC-2 的抗氧化活性

如圖6A 所示，HZPC-2 對DPPH 自由基的清除率隨其濃度的升高而升高。當HZPC-2 濃度從1 增加到2 mg/mL 時，DPPH 自由基清除能力由29.37%增至41.68%，而當HZPC-2 的濃度上升至5 mg/mL 時，DPPH 自由基的清除率達到63.02%。在5 mg/mL 時，VC對DPPH 自由基的清除率可達到98.05%。楊燕敏等[36]在對紅棗多糖體外抗氧化活性評價中發現，當紅棗多糖濃度在0～1 mg/mL 范圍時，其DPPH 自由基清除率都是隨著多糖濃度的增大而增大，最大清除率達到89%，HZPC-2 的最大清除率雖然低于紅棗多糖，但二者對DPPH 自由基清除能力都呈現出相同的遞增趨勢，均表現出了較強的抗氧化活性。

圖6 HZPC-2 的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of HZPC-2

如圖6B 所示，當HZPC-2 濃度為從1 增至5 mg/mL 時，ABTS 自由基的清除率呈上升之勢。這可能是由于在高濃度下的HZPC-2 能夠將反應性自由基轉化為穩定狀態，并通過向自由基提供電子來終止自由鏈反應[37]；當濃度為5 mg/mL 時，HZPC-2 和VC對ABTS 自由基的清除率分別為56.85%和98.52%。結果表明，HZPC-2 對ABTS 自由基有一定的清除能力，并呈劑量依賴性。

羥自由基可以自由進入細胞膜，并與大多數生物分子反應，導致組織損傷。因此，清除羥自由基可有助于防止組織損傷[38]。如圖6C 所示，羥自由基的清除率隨HZPC-2 濃度的增加而增強。當HZPC-2 濃度從1 增加到5 mg/mL 時，羥自由基清除率由23.05%增至60.32%，增幅之大可能是因為HZPC-2 中具有許多可以修飾的羥基，這樣的修飾可能會賦予多糖更強的羥自由基清除活性[39]。而當濃度為5 mg/mL 時，VC對羥自由基的清除率可達98.48%。在濃度為8 mg/mL 的玉竹多糖[40]中羥自由基清除率為41.98%±2.10%，在濃度為4 mg/mL茯苓多糖[41]中，羥自由基清除率最高為45.15%，相比之下，HZPC-2 擁有更好的羥自由基清除活性。

3 結論

本研究采用水提醇沉法從駿棗中分離出主要多糖組分HZPC，再經DEAE-52 纖維素層析法和Sephadex G-100 凝膠色譜法對HZPC 純化得到主要組分HZPC-2，并對其進行結構表征及抗氧化活性的研究。結果表明，HZPC-2 為α-吡喃葡萄苷骨架的中性多糖，單糖組成和分子質量測定結果表明HZPC-2 中含有鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）和半乳糖醛酸（GalA），對應的摩爾比為0.05:0.34:0.29:0.15:0.08:0.02:0.06；HZPC-2 的分子質量約為3.25×104Da。體外抗氧化活性實驗表明，HZPC-2 對DPPH 自由基、ABTS 陽離子自由基、羥自由基都表現出良好的自由基清除活性。鑒于HZPC-2 抗氧化活性良好的優勢，可為進一步開發功能性駿棗多糖食品提供理論參考。