冷藏鰹魚優勢腐敗產胺菌分離鑒定及其致腐產胺能力分析

劉洋帆，王 迪，李春生，相 歡，陳勝軍，楊賢慶，李來好，鄧建朝,*

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部水產品加工重點實驗室，國家水產品加工技術研發中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.大連工業大學海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034）

鰹魚（Katsuwonus pelamis）屬于鯖科鰹屬，主要分布在太平洋、印度洋、大西洋熱帶和亞熱帶海域，其營養價值豐富，常用來做成生魚片、罐頭、木魚花等食品，暢銷日本、歐洲等地[1]。鰹魚肉質蛋白含量高，脂肪含量低，富含多不飽和脂肪酸，方便人體吸收和利用[2]。然而鰹魚在運輸、加工和貯藏過程中極易受到微生物的影響，引起腐敗變質與生物胺的積累，使鰹魚營養價值降低并影響其質量安全[3]。

鰹魚腐敗變質是一系列復雜的過程，其中微生物是引起魚肉腐敗變質的主要原因之一，部分微生物在水產品中生長占優勢并可加速水產品腐敗變質進程，這類微生物稱為優勢腐敗菌[4]。優勢腐敗菌可以產生大量的腐敗代謝產物，還可分解脂肪和蛋白質并產生難聞異味加速水產品腐敗變質，其腐敗活性較其他微生物強[5]。魚類及魚類制品中富含豐富的蛋白質，微生物產生的氨基酸脫羧酶可將魚肉中游離的氨基酸轉化為生物胺[6]。生物胺是一類含氮化合物，常存在于動植物體和食品中，同時生物胺具有穩定性，普通加熱及冷凍等加工方式無法破壞分解[7]。據研究表明，人體攝入過量生物胺會引發嘔吐、頭疼、蕁麻疹等過敏性中毒反應[8]，國內外常有因攝入過量生物胺而導致中毒的案例，其中組胺的毒性最大，因此我國在GB 2733-2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》[9]中規定青皮紅肉海水魚的組胺含量不得超過400 mg/kg，而其他海水魚類則不超過200 mg/kg。Jskelinen 等[10]研究發現，在冷藏鮭魚中的優勢腐敗菌是發光桿菌屬，假單胞菌屬是黃鰭金槍魚的優勢腐敗菌。Lakshmanan 等[11]研究了冷藏魚蝦中產胺菌的生成情況，結果發現氣單胞菌屬和假單胞菌屬是魚蝦的主要產胺菌。Kuley 等[12]的研究發現，檸檬酸桿菌不僅可使魚腐敗變質還可產生生物胺。魚肉中由于腐敗菌和產胺菌的存在，不僅會降低魚本身營養價值還會對消費者身體健康造成危害。

針對以上問題，本研究篩選并探究鰹魚中的優勢腐敗產胺菌，實驗采用普通平板計數瓊脂培養基與改良的Niven’s 生物胺篩選培養基對低溫貯藏的鰹魚進行優勢腐敗產胺菌的篩選，并利用16S rDNA 分子技術對菌株進行鑒定并構建系統發育樹。將分離得到的3 株優勢腐敗產胺菌接回無菌魚肉中并在4 ℃下貯藏，對比實驗組的菌落總數、TVB-N 值和生物胺含量，同時對腐敗代謝產物產量因子YTVB-N/CFU進行計算，比較3 株菌的致腐產胺能力。本研究通過比較鰹魚中優勢菌株的致腐產胺能力，為把控鰹魚貯藏加工流通過程中的品質保證提供理論數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰹魚 廣州市灃洋食品有限公司，4 ℃低溫冷藏條件下運回實驗室；水浸鰹魚罐頭 日本Hagoromo公司，水浸鰹魚罐頭在加工過程中經過高溫滅菌處理，為無菌狀態；平板計數瓊脂培養基（plate count agar, PCA）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（trypticase soy agar, TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（trypticase soy broth，TSB） 廣東環凱微生物科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技有限公司；PCR 產物磁珠法純化試劑盒 上海碩美生物科技有限公司；瓊脂糖 廈門太陽馬生物工程有限公司；乙腈、甲酸、二氯甲烷 麥克林生化科技公司；0.22 μm 一次性針頭過濾器 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；7 種生物胺的標準品（組胺、尸胺、腐胺、酪胺、色胺、苯乙胺和1，7-二氨基庚烷，純度≥98%） 美國Sigma-Aldrich 公司；改良的Niven’s 生物胺篩選培養基（1 L）：準確稱取5 g 蛋白胨、5 g 酵母粉、質量分數各0.2%游離氨基酸（L-組氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸、L-鳥氨酸鹽酸鹽、L-苯丙氨酸和賴氨酸）、20 g 瓊脂 廣東環凱微生物科技有限公司；5 g 氯化鈉、1 g 碳酸鈣 麥克林生化科技公司；0.06 g 溴甲酚紫 上海源葉生物科技有限公司；使用1 mol/L 鹽酸調pH 至5.1，121 ℃高壓滅菌15 min。

SQ510C 立式壓力蒸汽滅菌器 日本Yamato公司；SPX 智能型生化培養箱 寧波江南儀器廠；IN612C 低溫培養箱 日本Yamato 公司；CEBO-24高通量組織研磨儀 上海測博生物有限公司；TDZ5-WS 離心機 長沙湘儀儀器有限公司；DYY-8C 電泳儀 北京六一儀器廠；9700 PCR 儀、3730XL 測序儀美國應用生物系統公司；TQ-S Micro 超高效液相色譜串聯質譜儀 美國Waters 公司；Milli-Q 純水系統 美國Millipore 公司；KjeltecTM2300 全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯集團公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鰹魚優勢腐敗產胺菌的篩選 稱取25 g 冷藏鰹魚肉，加入225 mL 無菌生理鹽水，拍打混合均勻后取1 mL 液體，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液進行梯度稀釋，吸取1 mL 稀釋液涂布于PCA 培養基上，25 ℃恒溫培養24 h，挑取不同單菌落，分離純化2～3 代，將菌株接種在Niven’s 生物胺篩選培養基上，選取顏色變化明顯的菌株，分離純化2～3 代，25 ℃培養24 h后放于4 ℃冰箱備用[13]。

1.2.2 菌株的鑒定與系統發育樹的構建 提取基因組DNA 對細菌進行16S 擴增，以27F（5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′）和1492（5′-TACGGCTACC TTGTTACGACTT-3′）作為引物進行擴增目的基因，PCR 擴增：96 ℃預變性5 min，96 ℃持續變性20 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進行35 個循環，最后72 ℃延伸10 min。擴增后的產物進行1.0%瓊脂糖凝膠檢測，觀察條帶性狀，最后將純化后PCR 產物測序，測序結果進行NCBI-BLAST 比對，選取數株同源性較高的菌株，使用MEGA 5 軟件構建鰹魚優勢腐敗菌的系統發育樹。

1.2.3 優勢腐敗產胺菌致腐能力的分析

1.2.3.1 菌懸液的制備與菌株的接種 從純化后的平板上挑取菌落接到TSB 中，25 ℃培養18～20 h。將電子秤、無菌稱量皿和稱量勺等工具放于超凈臺中紫外滅菌30 min 以上，在無菌操作臺中稱取100 g鰹魚肉放于無菌袋中，分別接熒光假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌魚肉中，在無菌操作臺中封好無菌袋4 ℃下貯藏，空白實驗組是未接種菌株的無菌魚肉，每天進行取樣測定實驗組的菌落總數、TVB-N 值和生物胺含量。

1.2.3.2 腐敗菌生長情況的測定 稱取5 g 魚肉于45 mL 生理鹽水中，拍打混合均勻后吸取100 μL 均質樣液，使用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液進行逐級稀釋，稀釋后的菌液涂布于TSA 上，25 ℃培養48 h 后計數。

1.2.3.3 TVB-N 的測定 參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準—食品中揮發性鹽基氮的測定》[14]，使用凱氏定氮法對樣品進行TVB-N 值測定。

1.2.3.4 腐敗菌腐敗能力的分析 參照許振偉等[15]的方法中腐敗代謝產物產量因子YTVB-N/CFU的計算公式：

式中：（TVB-N）0、（TVB-N）i—初始點、貯藏期終點的TVB-N 值（mg N/100 g）；N0、Ni—初始點、貯藏期終點的菌落數（CFU/g）。

1.2.4 優勢腐敗產胺菌產胺能力的分析 稱取2 g魚肉于50 mL 離心管中并放入2 顆鋼球，加入5 mL 0.2%酸化乙腈和100 μL 內標液（1，7-二氨基庚烷）混合均勻，研磨10 min 后，以4000 r/min 轉速離心10 min，取上清液，重復以上操作，收集上清液定容至10 mL 后進行氮吹，加入1 mL 復溶液和3 mL 二氯甲烷，渦旋1 min 后以10000 r/min 轉速離心10 min，取上清液過0.22 μm 的濾膜，用超高效液相色譜串聯質譜儀檢測生物胺，并使用1，7-二氨基庚烷作為內標物質計算生物胺含量[16]。

1.3 數據處理

使用MEGA 11 軟件（MEGA 有限公司）構建系統發育樹，數據處理結果均以“平均值±標準偏差”表示，數據統計分析使用IBM SPSS Statistics 25 軟件，采用Microsoft Office Excel 2019 軟件處理實驗數據，使用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA 分析結果

從PCA 和Niven’s 生物胺篩選培養基中挑取顏色變化較為明顯的單菌落，隨機分離篩選出8 株菌，將篩選出的菌株分別編號為T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7 和T8，對這8 株菌進行16S 全長序列PCR擴增，利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測16S rDNA擴增產物，電泳圖譜見圖1。由圖可知，擴增后的8 株菌在1000 和2000 bp 之間出現清晰的熒光條帶，并且無拖尾現象，可用于后續測序使用。

圖1 8 種菌株的16S rDNA 電泳圖譜Fig.1 16S rDNA electrophoresis map of 8 strains

2.2 菌株的鑒定與系統發育樹的構建

考慮到優勢腐敗產胺菌在冷藏鰹魚中仍會生長繁殖，因此預實驗把8 株菌放于4 ℃培養箱中觀察其生長變化，最后發現有3 株菌具有嗜冷性，這3 株菌的編號分別為T4、T6 和T7，將3 株菌擴增后的16S rDNA 序列與NCBI 數據庫進行比對后，將3 株菌的測序結果用MEGA 11 軟件構建成系統發育樹，如圖2 所示，發育樹顯示T4 屬于假單胞菌屬，且與熒光假單胞菌親源關系最近相似性為100%，T6 屬于檸檬酸桿菌屬且弗式檸檬酸桿菌相似性達99%，T7 屬于氣單胞菌屬與嗜水氣單胞菌親源關系最近，其相似性為99%。假單胞菌是食品中常見的嗜冷性致腐菌，Xie 等[17]研究了熒光假單胞菌對鮭魚的致腐能力分析，研究表明熒光假單胞菌會導致鮭魚中腐敗產物累積。弗式檸檬酸桿菌也被證實是一種致病致腐的有害微生物[18]，聶芳紅等[19]發現凍羅非魚片大腸菌群主要為弗氏檸檬酸桿菌。嗜水氣單胞菌是一種食源性病原體，經研究證實嗜水氣單胞菌會對人類健康造成危害[20]，Bo 等[21]研究發現海產品中致腐和致病性革蘭氏陰性菌主要有嗜水氣單胞菌、鮑曼不動桿菌、假單胞菌和腸桿菌等26 種菌。據系統發育樹可看出實驗最終篩選出來的3 株菌分別是熒光假單胞菌、弗式檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌，這3 株菌均為革蘭氏陰性菌，能夠在低溫下可繼續生長，是水產品常見的腐敗菌。

圖2 3 種菌株16S rDNA 序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences from 3 strains

2.3 鰹魚優勢腐敗產胺菌致腐能力的分析

2.3.1 菌落總數變化分析 微生物生長繁殖是引起鰹魚腐敗變質的主要原因，使用優勢腐敗菌在魚肉中的生長情況可作為衡量菌株致腐能力的指標之一。3 組接種優勢腐敗產胺菌的菌落總數變化如圖3 所示，接種熒光假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌的初始菌落總數分別為5.73、5.58 lg CFU/g和5.75 lg CFU/g，由于空白對照組是未接入任何菌的無菌魚肉，其菌落總數值為0。在4 ℃貯藏期間，優勢腐敗菌利用魚肉中的營養物質生長繁殖，隨著氧氣和營養成分的消耗，會造成腐敗代謝產物的累積。從圖中可看出，隨著貯藏時間的增加，3 組接種優勢腐敗產胺菌的菌落總數值也逐漸增加，說明這3 株菌在4 ℃的貯藏條件下在魚肉中仍可生長并對其造成影響。在貯藏前5 d 中，接種嗜水氣單胞菌組的生長情況比接種熒光假單胞菌組和弗式檸檬酸桿菌組生長較快，在貯藏期后期3 組菌的菌落總數值相差不大。在第8 d 貯藏結束時，接種熒光假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌組的菌落總數分別增長到8.36、8.27 和8.13 lg CFU/g，結果表明3 株優勢腐敗產胺菌在冷藏鰹魚中的生長狀況良好。

圖3 鰹魚接種3 種優勢腐敗產胺菌的菌落總數變化Fig.3 Changes in colony counts of 3 dominant spoilage biogenic amine-producing bacteria inoculated to skipjack tuna

2.3.2 TVB-N 值的變化分析 TVB-N 是評價水產品新鮮程度的一個重要指標，在水產品貯藏期間，其體內蛋白質等含氮物質在微生物和酶的作用下，分解成胺和氨類等鹽基氮類物質，TVB-N 值越高，代表魚肉中蛋白質降解程度越嚴重[22]。由圖4 可知，接種3 組優勢腐敗產胺菌的TVB-N 值在鰹魚貯藏期間逐漸增加，在貯藏初期，接種熒光加單胞菌組、弗式檸檬酸桿菌組和嗜水氣單胞菌組的TVB-N 值分別為6.71、6.22 和6.67 mg/100 g。空白對照組的TVB-N值也隨著貯藏時間的增加，有小幅度的增長，可能是魚肉在無菌袋中進行了氧化分解，但和另外3 組實驗組相比值很低。從圖中看出，接種嗜水氣單胞菌組的TVB-N 值在3 組樣品中增長最快，這可能是因為在貯藏前期嗜水氣單胞菌的菌落總數增長較快，使得其TVB-N 值也相對較高。GB/T 18108-2019《鮮海水魚通則》[23]中規定海產品中的TVB-N 值≤30 mg/100 g，接種弗式檸檬酸桿菌組和嗜水氣單胞菌組在貯藏結束時TVB-N 值分別達到了30.30 和31.29 mg/100 g，2 組TVB-N 值均超過了國標限量，接種熒光假單胞菌組TVB-N 值最終達到28.21 mg/100 g，結果表明嗜水氣單胞菌在鰹魚中TVB-N 的產量大于弗氏檸檬酸桿菌和熒光假單胞菌。Wang 等[24]在嗜水氣單胞菌、杰氏假單胞菌和腐敗希瓦氏菌對無菌草魚片的致腐能力研究中發現嗜水氣單胞菌產生的TVB-N 值最高。嗜水氣單胞菌是水產品中常見的人-獸-魚共患的致病菌，對水產業造成了較大的經濟損失[25]，由實驗研究可得出，嗜水氣單胞菌對鰹魚還具有一定的致腐性，可以加快魚肉的腐敗變質過程。

圖4 鰹魚接種3 種優勢腐敗產胺菌的TVB-N 值變化Fig.4 Changes in TVB-N values of 3 dominant spoilage biogenic amine-producing bacteria inoculated to skipjack tuna

2.3.3 腐敗代謝產物產量因子的分析 腐敗代謝物產量因子YTVB-N/CFU即貨架期終點時單位數量腐敗菌產生的腐敗代謝產物量[26]，不同的腐敗菌生長和代謝情況不同，結合菌落總數和TVB-N 值計算出YTVB-N/CFU可對優勢腐敗菌的致腐能力進行綜合比較。許多研究者使用YTVB-N/CFU值來比較腐敗菌的致腐能力，于淑池等[27]比較冷藏卵形鯧鲹優勢腐敗菌的致腐能力，Xie 等[17]比較熒光假單胞菌在不同溫度下對鮭魚致腐能力的強弱。本實驗以YTVB-N/CFU為鰹魚中優勢腐敗產胺菌的致腐能力評價指標，結果如表1 所示。接種3 組優勢腐敗產胺菌中嗜水氣單胞菌組的YTVB-N/CFU是最高，為1.48×10-7mg/CFU，其次是弗氏檸檬酸桿菌組和熒光假單胞菌組，YTVB-N/CFU值 分 別 為1.20×10-7mg/CFU 和8.39×10-8mg/CFU，嗜水氣單胞菌組YTVB-N/CFU值是熒光假單胞菌組的1.76 倍，是弗式檸檬酸桿菌組的1.23 倍，由表中計算結果可得優勢腐敗產胺菌對鰹魚的致腐能力為嗜水氣單胞菌＞弗氏檸檬酸桿菌＞熒光假單胞菌。

表1 鰹魚接種3 種優勢腐敗產胺菌致腐因子的比較Table 1 Comparison of yield factors in skipjack tuna inoculated with 3 dominant spoilage biogenic amine-producing bacteria

2.4 鰹魚優勢腐敗產胺菌產胺能力的分析

鰹魚含有豐富的營養物質，適合優勢腐敗產胺菌快速生長繁殖，在產胺菌和氨基酸脫羧酶的共同作用下造成生物胺積累[28]，魚肉中游離的組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸會脫羧形成組胺、尸胺和腐胺，通?？梢杂蒙锇泛縼砗饬眶~類產品的質量安全及其腐敗程度[29]。本實驗使用超高效液相色譜串聯質譜的方法檢測實驗組生物胺的含量，結果如表2 所示。由表可知，3 組接菌樣品的組胺、尸胺和腐胺含量隨著貯藏時間顯著增加（P＜0.05），接種嗜水氣單胞菌的組胺含量上升最快，在貯藏結束時，組胺含量達到261.22 mg/kg，其次是熒光假單胞菌組，貯藏結束時其組胺含量為196.23 mg/kg。貯藏結束時，接種熒光假單胞菌組、弗氏檸檬酸桿菌組和嗜水氣單胞菌組的尸胺含量分別為65.35、55.49 和69.99 mg/kg，腐胺的含量也分別達到57.22、55.39 和54.81 mg/kg。將4 組樣品的總生物胺含量進行匯總，結果如圖5所示，由圖中可明顯看出接種嗜水氣單胞菌組的總生物胺含量最高，其次是熒光假單胞菌組，最后是弗式檸檬酸桿菌組，由于酪胺和苯乙胺的含量相對較少，在圖中無法明顯看出。由生物胺檢測結果綜合比較來看，在鰹魚中嗜水氣單胞菌的產胺能力強于熒光假單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌。組胺是紅肉魚中常見的生物胺，并且影響魚肉質量與安全，Kim 等[30]研究發現從太平洋鯖魚中分離出的假單胞菌、發光菌、氣單胞菌3 種產胺菌均能在冷藏溫度生長并生成組胺，說明許多產胺菌在低溫條件下仍能生長。尸胺和腐胺常見于腐敗水產品中，雖然毒性較組胺低，但也會對人體造成一系列不良反應并且同時可增強組胺的毒性，尸胺與腐胺與魚肉腐敗密切相關，通常情況下魚肉腐敗程度越高其生物胺的含量越高，說明優勢腐敗產胺菌的致腐能力和產胺能力可能也存在相關性。

表2 鰹魚接種3 種優勢腐敗產胺菌的生物胺含量Table 2 Biogenic amines content of 3 dominant spoilage biogenic amine-producing bacteria inoculated to skipjack tuna

圖5 貯藏第8 天4 組樣品的總生物胺含量Fig.5 Total biogenic amine content of the four groups of samples on the 8th day storage

3 結論

本實驗使用PCA 和Niven’s 生物胺篩選培養基篩選鰹魚中優勢腐敗產胺菌，研究篩選到8 株菌，經過預實驗最終挑選出3 株優勢腐敗產胺菌，通過16S rDNA 鑒定結果顯示3 株菌分別是熒光假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌和嗜水氣單胞菌。將3 株菌接種到無菌鰹魚罐頭中，分析比較4 ℃下優勢腐敗產胺菌對鰹魚的致腐能力和產胺能力。通過測定菌落總數、TVB-N 值和計算比較YTVB-N/CFU得出，嗜水氣單胞菌對鰹魚的致腐能力強于弗氏檸檬酸桿菌和熒光假單胞菌，通過檢測不同接菌樣品的生物胺含量顯示嗜水氣單胞菌在鰹魚中產胺能力最強，綜合分析比較可得，嗜水氣單胞菌對鰹魚的致腐產胺能力大于弗氏檸檬酸桿菌和熒光假單胞菌。本研究進一步了解鰹魚中優勢腐敗產胺菌，并分析比較出對鰹魚品質影響最大的是嗜水氣單胞菌，為比較鰹魚中優勢腐敗產胺菌的致腐產胺能力提供數據理論依據。