響應面法優化南極磷蝦蛋白肽脫色工藝

劉小芳，黃岳磊,，冷凱良,3,*，李福后，丁 奇，苗鈞魁，于 源

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業農村部極地漁業可持續利用重點實驗室，山東青島 266071；2.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇連云港 222005；3.青島海洋科學與技術試點國家實驗室，海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東青島 266200；4.青島南極維康生物科技有限公司，山東青島 266112）

南極磷蝦（Euphausia superba）是南大洋海洋浮游動物中一個重要類群，生物量約達6.5～10 億噸，是目前資源極其豐富而開發利用程度很低的單種可捕生物資源[1-2]。南極磷蝦含有豐富的蛋白質[3-4]，被認為是地球上最大的動物性蛋白資源庫[5-6]。近年來相關研究證明，南極磷蝦蛋白肽具有良好的生理活性，包括抗氧化[7-8]、改善骨質疏松[9-10]、降血壓[11]、緩解疲勞[12]、調節血糖[13]、改善皮膚光老化[14]等。鑒于其豐富的資源量和良好的營養功能，南極磷蝦蛋白肽的生產開發引起行業關注。目前關于南極磷蝦蛋白肽制備的研究集中在酶解工藝優化方面，主要涉及最適酶的篩選、酶解條件優化等[15-17]。然而在酶解過程中，水溶性色素也會被同時提取，導致獲得的南極磷蝦蛋白肽呈棕黃色甚至褐色，引起感官不適，限制產品的后續開發和深度應用。因此，針對酶解獲得的南極磷蝦蛋白肽進行脫色處理十分必要，但目前尚未見相關研究報道。

海洋動物蛋白及其水解物的脫色處理主要采用化學法和物理法。化學脫色法由于需要引入氧化型或還原型化學試劑，易引起脫色液中各組分理化性質的改變，且存在一定程度的安全隱患；物理脫色法主要通過吸附作用達到效果，對脫色液的性質影響較小，安全性更高[18]。活性炭吸附法是工業化生產中常用的物理脫色法，具有吸附效果好、對樣品影響小、成本低廉、操作簡便等優點，目前已在魷魚皮膠原蛋白[18]、鱈魚皮膠原蛋白肽[19]、鱘魚皮膠原蛋白肽[20]、鱈魚肉酶解液[21]、魚籽多肽[22]等海洋動物蛋白及其水解物的脫色處理中得到良好應用。綜上，本研究采用活性炭吸附法對南極磷蝦蛋白肽進行脫色處理，研究活性炭類型對脫色效果的影響，通過單因素實驗和響應面試驗對活性炭用量、pH、脫色溫度、脫色時間等工藝條件進行優化，旨在為優質南極磷蝦蛋白肽產品開發提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂南極磷蝦粉 青島南極維康生物科技有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，200000 U/mL）丹麥諾維信生物技術有限公司；粉末活性炭、顆粒活性炭 國藥集團化學試劑有限公司；Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；鹽酸分析純，西隴科學股份有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等試劑 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

SHA-B 型恒溫振蕩器、HH-4 型數顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司；ST3100 型pH計 奧豪斯儀器（常州）有限公司；LXJ-IIB 型離心機上海安亭科學儀器廠；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；CTFD-10P 型冷凍干燥機 青島永合創信電子科技有限公司；UV1-102II 型紫外/可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；L-8900 型全自動氨基酸分析儀 日立科學儀器（北京）有限公司；LC-20AD 型液相色譜儀日本島津株式會社；BSA224S-CW 型電子分析天平賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦蛋白肽脫色處理工藝 采用堿性蛋白酶酶解制備南極磷蝦蛋白肽[16,23]：稱取適量脫脂南極磷蝦粉，按照料液比1:6 （g/mL）添加pH7.5 的0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液，混勻，根據脫脂南極磷蝦粉質量加入2% （v/m）的堿性蛋白酶，55 ℃酶解4 h后于95 ℃加熱滅酶20 min，冷卻至室溫，5000 r/min離心20 min，收集上清液，即得南極磷蝦蛋白肽溶液。獲得的南極磷蝦蛋白肽溶液在相應實驗條件下進行脫色處理后，冷卻至室溫，8000 r/min 離心15 min，收集上清液，測定相關評價指標。

1.2.2 活性炭類型的篩選 參考文獻方法對比研究不同類型活性炭在南極磷蝦蛋白肽脫色處理中的效果差異[18,22,24-25]。在溶液pH2.0、4.0、6.0 條件下，分別添加2.0% （m/v）、5.0% （m/v）、10.0% （m/v）的粉末活性炭或顆粒活性炭，50 ℃水浴振蕩脫色處理1.0 h，冷卻至室溫，8000 r/min 離心15 min，收集上清液，以脫色率為評價指標，確定適宜采用的活性炭類型。

1.2.3 單因素實驗 進行活性炭用量、pH、脫色溫度、脫色時間的單因素優化：固定pH6.0、脫色溫度50 ℃，脫色時間1.0 h，考察活性炭用量0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0% （m/v）對脫色效果的影響；固定活性炭用量2.0% （m/v）、脫色溫度50 ℃、脫色時間1.0 h，考察pH1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 對脫色效果的影響；固定活性炭用量2.0% （m/v）、pH6.0、脫色時間1.0 h，考察脫色溫度30、40、50、60、70 ℃對脫色效果的影響；固定活性炭用量2.0% （m/v）、pH6.0、脫色溫度50 ℃，考察脫色時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 對脫色效果的影響；以脫色率和蛋白保留率為評價指標，確定各單因素的最佳條件。

1.2.4 響應面試驗 根據單因素實驗結果，采用Box-Behnken 實驗設計方法對活性炭用量、pH、脫色時間進行三因素三水平設計，見表1。以脫色率為響應值，采用Design Expert V8.0.6 對實驗數據進行回歸分析，確定最佳脫色工藝條件。

表1 Box-Behnken 實驗設計因素水平Table 1 Experimental factor levels in the Box-Behnken design

1.2.5 脫色率的測定 將南極磷蝦蛋白肽溶液在380～700 nm 光譜范圍內進行全波長掃描，確定多肽溶液中色素的特征吸收波長。在特定吸收波長下測定多肽溶液脫色前后吸光值，并按照以下公式計算脫色率[20,22]：

1.2.6 蛋白保留率的測定 按試劑盒說明書的規定測定脫色處理前后溶液中的蛋白含量。蛋白保留率按照以下公式計算[20,22]：

1.2.7 脫色處理前后南極磷蝦蛋白肽的組成分析按照響應面試驗確定的最優工藝條件對南極磷蝦蛋白肽溶液進行脫色處理，處理前后的蛋白肽溶液分別經真空冷凍干燥后進行組成分析：蛋白質含量按照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》的規定執行；灰分含量按照GB 5009.4-2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》的規定執行；鹽分含量按照SC/T 3011-2001《水產品中鹽分的測定》的規定執行；水分含量按照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》的規定執行；氨基酸組成按照GB 5009.124-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》的規定執行；分子量分布按照GB 31645-2018《食品安全國家標準 膠原蛋白肽》中附錄A 的規定執行。

1.3 數據處理

實驗數據采用“平均值±標準偏差”的形式表示，采用IBM SPSS 20.0、Excel 2016、Origin 2018、Design Expert V8.0.6 等軟件進行數據處理和圖表繪制。采用獨立樣品t檢驗進行兩兩比較，采用單因素方差分析進行組間多重比較，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦蛋白肽溶液色素特征吸收波長

南極磷蝦蛋白肽溶液在380～700 nm 波長范圍內的吸收光譜見圖1。結果顯示，溶液在400 nm 波長處具有明顯的吸收峰，因此，確定南極磷蝦蛋白肽溶液中色素的特征吸收波長為400 nm。

圖1 南極磷蝦蛋白肽溶液的可見吸光光譜Fig.1 The absorption spectrum of the Antarctic krill peptides solution

2.2 活性炭類型的篩選確定

不同類型活性炭對南極磷蝦蛋白肽脫色效果的影響見表2。結果顯示，粉末活性炭和顆粒活性炭都能達到一定的脫色效果，但在相同的活性炭用量和pH 條件下，粉末活性炭的脫色效果均極顯著優于顆粒活性炭（P＜0.01），推測這跟粉末活性炭與色素接觸時的比表面積更大、不易達到吸附平衡有關，該研究結果與已有報道保持一致[18,24,26]。因此，確定粉末活性炭為本研究中最適宜采用的吸附劑。

表2 不同類型活性炭對南極磷蝦蛋白肽脫色率的影響Table 2 Effect of different types of activated carbon on decolorization rate of Antarctic krill peptides

2.3 單因素實驗結果

活性炭用量對南極磷蝦蛋白肽脫色效果的影響見圖2。活性炭用量在0.5%～5.0%范圍時，脫色率隨著活性炭用量的增加而逐漸升高，活性炭用量對樣品脫色效果影響顯著（P＜0.05）。各實驗組的蛋白保留率隨著活性炭用量的增加而逐漸降低，當活性炭用量在0.5%～3.0%范圍時，蛋白保留率均在90%以上；當活性炭用量增加至5.0%時，蛋白保留率下降至83.91%±1.38%。這可能是因為粉末活性炭具有多孔結構，可以有效吸附色素分子，適當地增加活性炭用量，能夠有效提高脫色效果[18,22,27]，但當活性炭用量過大時，被吸附損失的蛋白肽也會顯著增多，導致蛋白保留率明顯降低[20,24,27]。因此，確定活性炭用量3.0%為最佳實驗條件。

圖2 活性炭用量對脫色率和蛋白保留率的影響Fig.2 Influence of dosage of activated carbon on decolorization rate and protein retention rate

pH 對南極磷蝦蛋白肽脫色效果的影響見圖3。pH 在1.0～2.0 范圍時，脫色率隨著pH 的增加而有所提高；當pH 為2.0 時，脫色率達到最高；而后隨著pH的增加，脫色率不斷下降；pH 對樣品脫色效果影響顯著（P＜0.05）。粉末活性炭在酸性條件下呈現更強的吸附色素能力，這是因為活性炭吸附色素的過程需要H+的參與，適當提高樣品中H+的濃度，可以提高脫色率，這與已有的研究報道結果一致[18-22,25,27-28]。在pH1.0～6.0 范圍內進行脫色處理，各實驗組的蛋白保留率均在90%以上，無顯著差異（P＞0.05）。因此，確定pH2.0 為最佳實驗條件。

圖3 pH 對脫色率和蛋白保留率的影響Fig.3 Influence of pH on decolorization rate and protein retention rate

脫色溫度對南極磷蝦蛋白肽脫色效果的影響見圖4。脫色溫度在30～50 ℃范圍時，脫色率隨著脫色溫度的升高而有所提高；脫色溫度在50～60 ℃范圍時，脫色率增幅較小，趨于穩定；當脫色溫度大于60 ℃后，脫色率則出現下降。在一定溫度范圍內，脫色溫度的升高可使樣品體系中的熱運動加劇，增加了活性炭和色素分子間的碰撞結合機率，脫色效果得到提高；當脫色溫度繼續升高時，活性炭與色素分子間的吸附和解析達到平衡，脫色效果趨于穩定；但當脫色溫度超過一定值后，活性炭與色素分子的解析機率明顯增加，脫色效果出現下降[20,22,29-30]。在30～70 ℃溫度范圍內進行脫色處理，各實驗組的蛋白保留率均在90%以上，無顯著差異（P＞0.05）。考慮到酶解時采用的處理溫度為55 ℃，在實際生產中酶解和脫色工藝切換時料液會有小幅度的降溫，而再次加熱或冷卻料液會增加生產成本，因此確定脫色溫度50 ℃為最佳實驗條件，在響應面優化時也將脫色溫度固定為50 ℃不再作進一步考察。

圖4 脫色溫度對脫色率和蛋白保留率的影響Fig.4 Influence of decolorization temperature on decolorization rate and protein retention rate

脫色時間對南極磷蝦蛋白肽脫色效果的影響見圖5。在0.5～1.0 h 的脫色時間范圍時，隨著時間增加，脫色率不斷提高；當脫色時間為1.0 h 時，脫色率達到最高；而后隨著脫色時間的延長，脫色率有所下降。延長脫色時間，有助于活性炭與色素分子的充分接觸，從而提高吸附效果；但處理時間過長，也增加了活性炭與色素分子解析的機率，脫色效果降低[19,22,28]。在0.5～1.5 h 時間范圍內進行脫色處理，各實驗組的蛋白保留率均在90%以上，無顯著差異（P＞0.05）；而后隨著脫色時間的延長，蛋白保留率不斷降低。綜合考慮脫色效果和蛋白保留率，確定脫色時間1.0 h為最佳實驗條件。

圖5 脫色時間對脫色率和蛋白保留率的影響Fig.5 Influence of decolorization time on decolorization rate and protein retention rate

2.4 響應面試驗結果

根據單因素實驗結果，固定脫色溫度50 ℃，依據Box-Behnken 實驗設計原理，對活性炭用量（A）、pH（B）、脫色時間（C）進行三因素三水平響應面優化，實驗結果見表3。對響應面實驗數據進行二次多元回歸擬合，得到脫色率（Y）與自變量A、B、C 的回歸方程為：Y=77.45+9.24A-3.66B+0.13C+0.34AB+0.79AC+0.32BC-1.89A2-2.80B2-1.88C2。

表3 Box-Behnken 實驗設計與結果Table 3 Box-Behnken experimental design and result

對模型擬合結果進行方差分析，結果見表4。由表4 可知，模型項P＜0.0001，表明該回歸模型極顯著，失擬項P=0.4656＞0.05，表明失擬項不顯著，說明該模型與數據擬合程度較高。在本實驗中，A、B、A2、B2、C2對脫色率影響極顯著（P＜0.01），C 與交互項對脫色率影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對南極磷蝦蛋白肽脫色率的影響程度為：A＞B＞C，即活性炭用量＞pH＞脫色時間。此外，該回歸模型的R2=0.9956，且R2Adj=0.9898，表明該模型擬合度和可信度均較高。以上分析表明，該模型可應用于南極磷蝦蛋白肽脫色條件的分析和預測。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

活性炭用量、pH、脫色時間3 個因素之間交互作用對南極磷蝦蛋白肽脫色率的影響見圖6、圖7和圖8。活性炭用量與pH、活性炭用量與脫色時間、pH 與脫色時間兩兩之間的交互作用對脫色率影響均不顯著，這與方差分析結果一致。響應面圖中曲面的變化幅度可直接反映各因素對響應值的影響程度[17]，由圖6、圖7 可知，隨著活性炭用量的增加，脫色率逐漸增加，增幅明顯；由圖6、圖8 可知，隨著pH 的增加，脫色率呈先增加后減小趨勢，變化幅度較小；由圖7、圖8 可知，隨著脫色時間的增加，脫色率呈先增加后減小趨勢，變化幅度較小；綜上可知，活性炭用量對脫色率的影響程度要大于pH 和脫色時間，這也與方差分析結果一致。

圖6 活性炭用量與pH 的交互作用對南極磷蝦蛋白肽脫色率的影響Fig.6 Interaction effect of dosage of activated carbon and pH on decolorization rate of Antarctic krill peptides

圖7 活性炭用量與脫色時間的交互作用對南極磷蝦蛋白肽脫色率的影響Fig.7 Interaction effect of dosage of activated carbon and decolorization time on decolorization rate of Antarctic krill peptides

圖8 pH 與脫色時間的交互作用對南極磷蝦蛋白肽脫色率的影響Fig.8 Interaction effect of pH and decolorization time on decolorization rate of Antarctic krill peptides

經Design Expert V8.0.6 軟件分析得到南極磷蝦蛋白肽脫色的最佳條件為：活性炭用量4.0%、pH1.42、脫色時間1.1 h，在此條件下模型預測的脫色率為85.86%。為方便實際操作，將最佳脫色條件調整為：活性炭用量4.0%、pH1.5、脫色時間1.0 h，在此條件下進行三次驗證實驗，脫色率為82.19%±0.20%，與理論值接近，證明該模型可靠。同時，在最佳脫色工藝條件下，蛋白保留率為90.93%±2.28%，表明優化后的工藝可行。

2.5 脫色前后南極磷蝦蛋白肽的組成分析

脫色處理前后南極磷蝦蛋白肽的組成分析結果見表5、表6。脫色處理后樣品的蛋白質含量由80.57%±0.40%降低至71.18%±0.19%（P＜0.01），而鹽分、灰分含量極顯著提高（P＜0.01），這可能與脫色處理導致的蛋白損失、調節最佳工藝條件時酸堿的引入以及脫色吸附劑殘留等原因有關。脫色處理前后南極磷蝦蛋白肽的必需氨基酸含量分別占總氨基酸含量的39.29%±0.12%和39.41%±0.34%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值分別為64.72%±0.34%和65.05%±0.92%；脫色處理前后南極磷蝦蛋白肽的分子量均主要分布在189～6500 Da 范圍，占比分別為86.06%±1.16%和86.79%±1.19%；綜上可知，采用優化工藝對南極磷蝦蛋白肽進行脫色處理，樣品氨基酸組成中必需氨基酸與非必需氨基酸的占比以及樣品的分子量分布均未發生顯著變化（P＞0.05）。脫色后獲得的南極磷蝦蛋白肽，氨基酸組成基本符合聯合國糧農組織/世界衛生組織規定的優質蛋白標準（必需氨基酸占氨基酸總量的40%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為60%），分子量分布符合生物活性肽分子量分布范圍[31]，具有良好的營養價值。需要關注的是，脫色后獲得的南極磷蝦蛋白肽，色澤得到改善，但仍存在鹽分含量較高的問題，這不僅會影響蛋白肽的口感和功能，也會給消費者健康帶來一定的潛在風險[23,32]，如何去除樣品中過量的鹽分應進一步研究。

表5 脫色前后南極磷蝦蛋白肽的組成Table 5 The compositions of Antarctic krill peptides before and after decolorization

表6 脫色前后南極磷蝦蛋白肽的分子量分布Table 6 The molecular weight distribution of Antarctic krill peptides before and after decolorization

3 結論

活性炭吸附法能夠有效實現南極磷蝦蛋白肽中色素的脫除，粉末活性炭的脫色效果優于顆粒活性炭；當脫色溫度為50 ℃時，經響應面優化得到最佳脫色工藝條件為：活性炭用量4.0%、pH1.5、脫色時間1.0 h；在此條件下，脫色率達到82.19%±0.20%。采用優化工藝脫色處理后，樣品氨基酸組成中必需氨基酸與非必需氨基酸的占比以及樣品的分子量分布均無明顯變化。考慮到脫色后獲得的南極磷蝦蛋白肽鹽分含量較高，后續研究需關注樣品的脫鹽處理，以進一步提升產品品質。本研究對于南極磷蝦蛋白產品開發和規模化生產具有重要參考價值。