超高效液相色譜-熒光法測(cè)定蜂蜜中百里香酚的殘留量

錢振杰，曾 羲,*，陳 敬，趙 悅，游淑珠，何詠欣，馮家望

（1.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 511400；2.拱北海關(guān)技術(shù)中心，廣東 珠海 519000）

百里香酚（Thymol）又名麝香草酚，是香芹酚（Carvacrol）的同分異構(gòu)體，普遍存在于百里香屬植物及其提取精油中[1]，具有抗菌、消炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等功效[2-4]，是一種低毒的天然單萜酚[5]。百里酚的抑螨率高、對(duì)蜂群傷害率低，可有效防控蜂巢瓦螨[6]，在養(yǎng)蜂業(yè)廣泛使用。歐盟認(rèn)為百里香酚屬于無(wú)毒性獸藥[7]，美國(guó)、加拿大和澳洲還未規(guī)定其最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL）。日本將百里香酚納入寄生蟲(chóng)驅(qū)蟲(chóng)劑管理，規(guī)定蜂蜜中百里香酚的限量值為30 mg/kg[8]。此外，由于百里香酚具有強(qiáng)烈的辛辣氣味，人類對(duì)其味覺(jué)閾值介于1.1～1.3 mg/kg 之間[9]，為避免過(guò)量百里香酚殘留改變蜂蜜自身風(fēng)味，瑞士規(guī)定蜂蜜中百里香酚的最大殘留量為0.8 mg/kg[10]。國(guó)內(nèi)尚無(wú)針對(duì)蜂蜜中百里香酚的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)蜂蜜等產(chǎn)品中百里香酚殘留檢測(cè)方法的報(bào)道較少。我國(guó)是蜂產(chǎn)品生產(chǎn)第一大國(guó)[11]，為了保障市場(chǎng)銷售產(chǎn)品的質(zhì)量安全，促進(jìn)蜂產(chǎn)品出口貿(mào)易的順利進(jìn)行，建立一種能夠簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確測(cè)定蜂蜜中百里香酚的分析方法十分必要。

目前，針對(duì)百里香酚的分析方法主要有電化學(xué)法[12-14]、氣相色譜法[15-18]、液相色譜法[19-21]等。其中，電化學(xué)法尚處于理論研究階段，應(yīng)用范圍有限；氣相色譜法使用的火焰離子化檢測(cè)器靈敏度較低[22]，需要配合預(yù)濃縮[23]，或配套價(jià)格昂貴的質(zhì)譜檢測(cè)器[24]、普及率低的頂空進(jìn)樣器[25]等特殊設(shè)備才能獲得滿意的測(cè)定效果；而且由于蜂蜜中葡萄糖、果糖[26]占60%～80%，使用氣相色譜常用的有機(jī)溶劑提取時(shí)，基質(zhì)中的糖類易析出造成沉淀、結(jié)塊，降低提取效率，影響了氣相法的普及。液相法使用的含水提取劑和流動(dòng)相與蜂蜜高糖基質(zhì)的兼容性更高，但也受限于二極管陣列檢測(cè)器（Diode array detector，DAD）的低靈敏度[27]，仍需要借助質(zhì)譜[28]或特殊前處理方式[29]才能到達(dá)足夠的靈敏度。熒光檢測(cè)器（Fluorescence detector，F(xiàn)LD）因具有選擇性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，已被報(bào)道用于百里香酚殘留的測(cè)定[30]。但是，現(xiàn)有文獻(xiàn)中對(duì)前處理和分離條件的優(yōu)化討論有限，未充分考慮到復(fù)雜基質(zhì)中強(qiáng)保留物質(zhì)（如：微量蛋白、蜂蠟等）的洗脫，關(guān)鍵是不能區(qū)分常見(jiàn)酚類異構(gòu)體（如：香芹酚等）的干擾，難以實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中百里香酚的高通量準(zhǔn)確定性、定量分析。本研究擬采用超高效液相色譜-熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)蜂蜜中百里香酚殘留進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化前處理方法、色譜分離與檢測(cè)條件，建立一種簡(jiǎn)單、可靠，技術(shù)指標(biāo)能夠滿足出口蜂蜜中百里香酚殘留量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，為蜂蜜中百里香酚殘留量的監(jiān)控提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂蜜（雪脂蓮蜜、椴樹(shù)蜜、玄參蜜、洋槐蜜和百花蜜） 市場(chǎng)購(gòu)買獲得；百里香酚 標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.69%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；丹皮酚、丁香酚、異丁香酚和香芹酚 純度大于99.0%，上海阿拉丁公司；乙腈、甲醇 色譜純，美國(guó)Thermo 公司；甲酸 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

Acquity UPLC 超高超效液相色譜儀（配備DAD及FLD）、Oasis PRiME HLB 凈化柱（3 mL，60 mg）美國(guó)Waters 公司；QuEChERS dSPE 凈化管（含600 mg MgSO4，100 mg PSA，40 mg C18） 上海CNW公司；ME203E 分析天平 感量0.001 g，瑞士梅特勒-托利多公司；CP225 D 分析天平 感量為0.01 mg，德國(guó)Sartorius 公司；2600TH 超聲清洗器 上海安譜公司；Allegra X-30R 高速離心機(jī) 德國(guó)貝克曼公司；MS 3 渦旋振蕩器 德國(guó)IKA 公司；Milli-Q Academic 超純水制備儀 美國(guó)密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取20.0 mg（精確至0.1 mg）百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解、混勻并定容至10 mL 容量瓶，得到濃度為2.00 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再準(zhǔn)確量取0.250 mL 百里香酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋并定容至50 mL，得到濃度為10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4 ℃冰箱中避光保存，臨用時(shí)準(zhǔn)確量取百里香酚標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用40%乙腈水溶液稀釋，依次配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、3.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取蜂蜜樣品2.5 g（精確到0.001 g）于25 mL 具塞比色管中，加入乙腈-水（v/v=40:60）溶液定容，振蕩5 min 后，用8000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.45 μm 有機(jī)相濾膜，供上機(jī)測(cè)定。

1.2.3 凈化方法

1.2.3.1 凈化柱凈化 依次用3 mL 乙腈和3 mL水對(duì)PRiME HLB 柱進(jìn)行活化，取1.2.2 步驟中所得上清液3 mL 上柱，用3 mL 水進(jìn)行淋洗，棄去全部淋出液，抽干。然后用3 mL 乙腈進(jìn)行洗脫。將洗脫液在40 ℃下氮吹至近干，加入40%乙腈-水溶液溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL，取上清液過(guò)0.45 μm 有機(jī)相濾膜，供上機(jī)測(cè)定[31]。

1.2.3.2 凈化管凈化 取1.2.2 步驟中所得上清液5 mL，置于QuEChERS dSPE 凈化管中渦旋混合3 min，在4 ℃條件下，8000 r/min 離心5 min。上清液過(guò)0.45 μm 有機(jī)相濾膜，供上機(jī)測(cè)定[32]。

1.2.4 儀器條件 Thermo Accucore aQ 液相色譜柱（150 mm×2.1 mm×2.6 μm）；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B 為乙腈，洗脫梯度為0～6.5 min，60%A；6.5～7.0 min，60%～10% A；7.0～9.0 min，10% A；9.0～9.1 min，10%～60% A；9.1～12.0 min，60% A；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；DAD測(cè)定波長(zhǎng)為274 nm；FLD 激發(fā)波長(zhǎng)為274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為297 nm。

1.2.5 測(cè)定 分別吸取百里香酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及樣品提取液注入液相色譜，在1.2.4 條件下測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣中百里香酚的濃度，根據(jù)保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)沃特世Empower 3.0 軟件采集，導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)后采用SPSS 25 統(tǒng)計(jì)軟件與Excel 2016 軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)圖形繪制與分析（單變量，一般線性模型；置信值95%，P＜0.05 為顯著性差異）。前處理和分析條件優(yōu)化中的回收率的計(jì)算均采用3 個(gè)平行樣品取平均值計(jì)算，精密度選擇低、中、高3 個(gè)濃度，每個(gè)濃度梯度取連續(xù)采集6 次數(shù)據(jù)的峰面積進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 在空白蜂蜜樣品中加入10.0 mg/kg 百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品，采用水、甲醇、乙腈及乙腈-水（v/v=40:60）等4 種提取溶劑進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)表明，乙腈-水的回收率最高，達(dá)97.2%；甲醇的回收率為92.7%，乙腈和水的回收率分別為63.1%和58.0%。使用SPSS 25 軟件對(duì)提取溶劑種類及回收率情況進(jìn)行顯著性分析，4 種提取溶劑之間具有顯著性差異（P＜0.05）。此外，甲醇提取液會(huì)帶入較多的干擾雜質(zhì)影響后續(xù)色譜分離效果。經(jīng)綜合考慮，最終選擇乙腈-水作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的回收率（n=3）Fig.1 Recoveries of different solvents for thymol (n=3)

2.1.2 凈化方式的選擇 在空白蜂蜜樣品中加入10.0 mg/kg 百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品，并測(cè)定回收率，液液萃取法（LLE）、PRiME HLB 固相萃取（SPE）和QuEChERS 法等3 種凈化方式的回收結(jié)果見(jiàn)圖2。使用SPSS 25 軟件進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明Qu EChERS 法與其他兩組方式存在顯著性差異（P＜0.05），LLE 法與SPE 法之間不存在顯著性差異（P＞0.05）且平均回收率明顯優(yōu)于QuEChERS 法。但是SPE 法需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的操作，效率較低且需消耗大量有機(jī)溶劑。綜合考慮實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便性和提取凈化效率，最終采用乙腈-水（v/v=40:60）液液萃取的直接凈化方式。

圖2 不同凈化方式的回收率（n=3）Fig.2 Recoveries of different purification methods for thymol (n=3)

2.2 分離條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 蜂蜜中除百里酚香外還可能含有丹皮酚、丁香酚、異丁香酚和香芹酚等其他天然驅(qū)蟲(chóng)效果的精油成份[33]，其中香芹酚和百里香酚為同分異構(gòu)體。因此，需要充分考慮其他天然酚類對(duì)百里香酚測(cè)定的影響，以避免實(shí)際樣品檢測(cè)中出現(xiàn)定性不準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)考察了五氟苯基（PFP）柱、普通C18柱、親水作用（hilic）柱和極性封端（aQ）柱對(duì)百里香酚及其干擾物的分離效果，以提高百里香酚分析檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，aQ 柱對(duì)5 種酚類物質(zhì)的分離效果最佳，且對(duì)香芹酚和百里香酚的選擇性不同，峰型尖銳，有利于對(duì)百里香酚的定性定量測(cè)定，故選用aQ 柱作為百里香酚測(cè)定的色譜柱。

圖3 4 種色譜柱對(duì)酚類混合物（1.0 μg/mL）的分離色譜圖Fig.3 Chromatograms of 4 kinds of chromatographic column for mixed phenolic compounds at 1.0 μg/mL

2.2.2 流動(dòng)相的選擇 本研究選取甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水等4 種流動(dòng)相考察其對(duì)天然酚類化合物的識(shí)別和分離能力（見(jiàn)圖4）。結(jié)果表明，不同有機(jī)相對(duì)5 種酚類物質(zhì)的分離效果影響較大，選用乙腈作為流動(dòng)相對(duì)香芹酚和百里香酚的分離效果明顯優(yōu)于使用甲醇的流動(dòng)相。

圖4 4 種流動(dòng)相對(duì)酚類混合物（1.0 μg/mL）的分離色譜圖Fig.4 Chromatograms of 4 kinds of mobile phase for mixed phenolic compounds at 1.0 μg/mL

此外，實(shí)際樣品測(cè)試中還發(fā)現(xiàn)不同類型蜂蜜中百里香酚的保留時(shí)間會(huì)因基質(zhì)pH 不同出現(xiàn)漂移，在流動(dòng)相內(nèi)加酸可有效降低此現(xiàn)象的發(fā)生。但百里香酚的熒光響應(yīng)強(qiáng)度隨酸濃度的增加出現(xiàn)降低。本研究使用不同甲酸比例的水溶液做流動(dòng)相A，評(píng)估百里香酚保留時(shí)間及不同酸濃度下峰面積相對(duì)于不加酸時(shí)峰面積的變化率，結(jié)果如圖5 所示。當(dāng)甲酸含量在0%～0.2%時(shí)峰面積變化緩慢，當(dāng)甲酸含量大于0.2%時(shí)百里香酚峰面積降低明顯加快，因此在流動(dòng)相中選擇加入0.2%以下的甲酸，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸濃度亦能保證百里香酚保留時(shí)間的穩(wěn)定性。綜合考慮分離效果、提取溶劑和實(shí)驗(yàn)操作穩(wěn)定性，最終選擇0.1%甲酸水-乙腈作為本研究的流動(dòng)相。

圖5 不同甲酸濃度下百里香酚（1.0 μg/mL）峰面積和保留時(shí)間的變化Fig.5 Changes in peak area and retention time of thymol(1.0 μg/mL) at different concentrations of formic acid

2.2.3 有機(jī)相比例的確定 在實(shí)際蜂蜜樣品分析測(cè)定中，最大的干擾來(lái)自于百里香酚的同分異構(gòu)體香芹酚，流動(dòng)相比例對(duì)香芹酚和百里香酚的分離度起著重要作用。實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相中乙腈和水的比例進(jìn)一步考察了香芹酚和百里香酚的分離度，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，隨著流動(dòng)相中乙腈比例的增加，香芹酚和百里香酚分離度逐漸降低，當(dāng)乙腈濃度達(dá)45%時(shí)，兩者恰好達(dá)到基線分離（R=1.5）。為確保同分異構(gòu)體的分離效果和結(jié)果的準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)最終選擇40%的乙腈濃度作為流動(dòng)相起始比例。

圖6 不同比例乙腈下香芹酚和百里香酚的分離度Fig.6 Resolution of carvacrol and thymol in the presence of different concentrations of acetonitrile

2.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將百里香酚制成1.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用DAD 確定百里香酚的最大吸收波長(zhǎng)為220 nm，第二吸收波長(zhǎng)為274 nm，結(jié)果如圖7 所示；使用FLD 對(duì)其最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行優(yōu)化，得到百里香酚熒光檢測(cè)的最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為274 nm 和297 nm，結(jié)果如圖8 所示。

圖7 百里香酚的紫外吸收光譜Fig.7 UV absorption spectrum of thymol

圖8 百里香酚的熒光激發(fā)-發(fā)射光譜Fig.8 Fluorescence excitation-emission spectrum of thymol

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、范圍和定量限 實(shí)驗(yàn)以百里香酚響應(yīng)值的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以百里香酚溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到百里香酚的線性范圍、線性回歸方程和決定系數(shù)；以儀器3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的百里香酚濃度作為儀器檢出限，以10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的百里香酚濃度作為儀器定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，百里香酚在0.01～3.00 μg/mL 線性范圍內(nèi)決定系數(shù)（R2）達(dá)0.9999，線性關(guān)系良好，方法的LOD 和LOQ 分別為0.03 mg/kg和0.10 mg/kg。

表1 百里香酚的線性范圍、線性回歸方程、決定系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear range, linear equation, correlation coefficients,limit of detection (LOD) and limit of quantitation(LOQ) of thymol

2.3.2 回收率與精密度 實(shí)驗(yàn)選取雪脂蓮蜜、椴樹(shù)蜜、玄參蜜、洋槐蜜和百花蜜等5 種代表性蜂蜜空白樣品作為基質(zhì)，在本方法定量限、日本最大殘留限量及瑞士標(biāo)準(zhǔn)要求等3 個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為0.1、0.8、30 mg/kg，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在5 種蜂蜜樣品基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率為87.4%～106.9%，方法精密度為0.7%～7.3%。

表2 百里香酚的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs) of thymol (n=6)

2.3.3 實(shí)際樣品分析 利用所建立的方法對(duì)市場(chǎng)上銷售的48 批次蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中包含養(yǎng)殖場(chǎng)原料蜂蜜15 個(gè)、混合花種蜂蜜13 個(gè)、單一花種蜂蜜20 個(gè)。結(jié)果顯示，僅有1 個(gè)百花蜜樣品檢出百里香酚殘留，濃度為0.20 mg/kg，其典型色譜圖如圖9 所示。

圖9 陽(yáng)性樣品的色譜圖Fig.9 Chromatogram of positive sample

3 結(jié)論

本研究建立了一種蜂蜜中百里香酚殘留量的高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)方法，對(duì)提取溶劑、凈化方式和分析條件進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的穩(wěn)健性進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。該方法的定量限為0.10 mg/kg，百里香酚在0.10～30.0 mg/kg 添加水平下，回收率為87.4%～106.9%，方法精密度為0.7%～7.3%，目標(biāo)峰可與其同分異構(gòu)干擾物達(dá)到基線分離。通過(guò)對(duì)市售蜂蜜產(chǎn)品的測(cè)試，僅一個(gè)批次樣品檢出微量百里香酚殘留，說(shuō)明國(guó)內(nèi)市場(chǎng)蜂蜜樣品中百里香酚殘留水平很低。本方法操作簡(jiǎn)單、選擇性好，抗干擾性強(qiáng)，可滿足日常工作中對(duì)蜂蜜中百里香酚殘留量測(cè)定的需要，能為我國(guó)蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供技術(shù)補(bǔ)充，有利于促進(jìn)出口和保障國(guó)民身體健康。