魚油對順鉑損傷HEK293 細胞及A549細胞的影響

杜月梅，劉云帆，秦 菲,*，高麗萍

（1.北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023；2.生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

順鉑（cis-dichlorodiamineplatinum （Ⅱ），CDDP）在1978 年被美國食品藥品監督管理局批準用于臨床，是目前臨床上常用的強效抗癌藥，常作為治療頭頸部癌、睪丸癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌、胃癌、食道癌和骨肉瘤的首選藥[1-6]，具有極其顯著的抗癌效果。CDDP 進入細胞后，細胞中的低氯離子可促進順鉑水解，形成水合順鉑[7]，該物質活性很高，容易與DNA 發生加成反應，引發交叉聯結，進而破壞DNA 的結構功能，同時導致細胞凋亡[8]。此外，CDDP 中的Pt2+離子，易與細胞中酶、蛋白質中的巰基（-SH）相結合，從而使酶和蛋白質失活，進而導致細胞或人體組織損傷[9]。有報道稱，每24 h 就有65%～98%的CDDP 與血液中蛋白結合，造成了許多毒副作用，其中為劑量限制性的腎毒性是最常見及最嚴重的毒副反應[10]。CDDP 進入細胞后需經腎臟排出體外，長時間的蓄積在腎臟中，最終對腎小管以及腎臟造成不可逆的損傷[11]。眾多的研究也證明CDDP對腎小管上皮細胞具有顯著的毒性作用[12-13]，連燕娜等[5]的研究也證明CDDP 對人胚腎細胞HEK293 細胞有明顯的毒性作用。本課題組之前的研究結果顯示，線粒體損傷和氧化應激是CDDP 導致腎毒性的原因之一[14]，而CDDP 可直接損傷線粒體并且其中所含有的親核氨基也能與水分子結合，形成大量自由基，從而造成線粒體損傷，最終導致細胞凋亡[15]。CDDP 腎毒性包括可逆的急性腎功能損傷和不可逆慢性腎功能衰竭[16]，許多患者為此痛苦不堪。因此，減輕CDDP 腎毒性迫在眉睫。

魚油是魚體內全部油脂類物質的總稱，富含二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等長鏈多不飽和脂肪酸。大量研究證明，DHA 和EPA 具有預防心腦血管疾病、調節血脂、促進大腦神經系統發育，預防老年癡呆、保護視力、抗抑郁、降血脂、抗衰老[17-23]等一系列功效。也有資料顯示，EPA 和DHA 還有增加化療療效，減低耐藥作用。除此之外，魚油中的ω-3多不飽和脂肪酸可調控機體的免疫功能及炎癥反應，并在體內氧化供能[24]。Barbosa 等[25]研究表明，潰瘍性結腸炎病人在每天補充4.5 g 魚油后，可使血漿氧化應激狀態有所好轉；白冬[26]發現持續攝入鰹魚魚油42 d 后，D-半乳糖小鼠體內MDA 含量明顯降低、GSH、SOD 等抗氧化酶的活性升高；Cazzola 等[27]認為老年男性每天補充高劑量EPA （1.35、2.7 g 或4.05 g）有發生脂質過氧化的危險；此外，也有研究學者[28-29]提出補充魚油對機體抗氧化能力無任何影響。

目前，魚油對CDDP 所致的腎毒性及對CDDP的抗癌作用的影響均未見報道，且魚油在抗腫瘤方面鮮少有人研究。因此，本研究采取體外培養細胞的方法研究探討了魚油對CDDP 所致人胚腎細胞HEK293細胞損傷的保護作用及機制，并對CDDP 殺傷人肺腺癌細胞A549 的影響進行了研究，為其提高CDDP的化療效果及臨床應用提供實驗依據，并為化療過程中魚油類輔助品的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肺腺癌細胞（A549）和人胚腎細胞（HEK293）

均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院基礎學院細胞中心；無菌生理鹽水溶解的CDDP 注射用粉劑 購自齊魯制藥公司；魚油軟膠囊，規格：每粒1500 mg（提供900 mg 總ω-3 脂肪酸；540 mg EPA、360 mg DHA 和其他不飽和脂肪酸）美國GNC 公司生產；胎牛血清 購自美國Hyclone公司；DMEM-H 和DMEM/F12（1:1）培養基、0.25%胰酶、含有100 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的雙抗 均購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；CCK-8（cell counting kit-8，CCK-8）毒性檢測試劑盒購自美國Sigma 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒北京鼎國昌盛生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

TE2000-M 倒置顯微鏡 日本Nikon 公司；MQX-200 微孔板分光光度計 美國Bio-Tek 公司；WFZ UV-4802H 紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；3K15 臺式高速冷凍離心機 德國Sigma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 在37 ℃，CO2體積分數為5%，飽和濕度的孵育培養箱中，HEK293 細胞和A549 細胞分別用含15%和10%胎牛血清的DMEM-H 和DMEM/F12（1:1）培養基（均含1%的雙抗）培養，待細胞匯合度至80%～90%時，用胰酶消化，按1:3 比例進行傳代，每隔1 d 換1 次培養基，每2～3 d 傳代1 次，取對數生長期細胞進行下一步實驗[4-6,13,16]。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞活力

1.2.2.1 CCK-8 法檢測CDDP 對HEK293 細胞和A549細胞的毒性 將100 μL 濃度為1×105個/mL 的細胞接種到96 孔板中，待細胞生長到匯合狀態，棄去原培養基，加入100 μL 含不同終濃度CDDP 的培養基。處理A549 細胞時，CDDP 終濃度分別為0、5、10、15、20、25 和30 mg/L；處理HEK293 細胞時，CDDP 終濃度分別為0、1、2、4、8、16、32、64 和128 mg/L，每組設6 個平行孔，置于培養箱中孵育24 h，之后每孔加入100 μL 含10% CCK-8 的培養基，繼續孵育4 h，并在450 nm 處檢測吸光度（OD450）值，按下式計算細胞存活率[4-6,13,16]：

CDDP 誘導兩種細胞損傷模型的最佳使用濃度由CDDP 對HEK293 細胞及A549 細胞的半數抑制濃度（IC50）確定。

1.2.2.2 CCK-8 法檢測魚油對HEK293 細胞和A549細胞存活率的影響 處理計算方法同1.2.2.1，A549細胞中魚油終濃度為0、0.5、1、2、4、8、16、32 mg/L，HEK293 細胞中魚油終濃度分別為0、0.5、1、2、3、4、8、16、32、64、128 mg/L[4-6,13,16]。

1.2.2.3 CCK-8 法檢測魚油對CDDP 致HEK293 細胞和A549 細胞損傷的影響 將處于對數生長期的細胞按1×105個/mL 接種到96 孔板中，待細胞生長至匯合狀態時，進行加藥處理。試驗分3 組：a.對照組，未加入CDDP 和魚油；b.CDDP 組（CDDP 終濃度為20 mg/L）；c.魚油+CDDP 組，提前4 h 加入不同濃度魚油（HEK293 細胞魚油濃度分別為1、2、4、8、16、32、64 mg/L；A549 細胞魚油濃度分別為2、4、8、16、24、32、40、48 mg/L）。孵育細胞之后加入CDDP（HKE293 細胞為20 mg/L；A549 細胞為10 mg/L）。每組設6 個復孔，在37 ℃，含5%的CO2培養箱中培養24 h，并按照1.2.2.1 所述方法檢測細胞存活率[4-6,13,16]。

1.2.3 魚油對HEK293 細胞蛋白濃度及細胞內MDA、SOD、GSH 含量的影響 將細胞分為4 組：a.正常對照組（不對細胞做任何其他處理）；b.魚油組（加入4 mg/L 魚油）；c.CDDP 模型組（加入20 mg/L CDDP）；d.魚油+CDDP 聯合處理組（加入4 mg/L 魚油和20 mg/L CDDP）。將1×105個/mL 細胞接種到96 孔板中，待細胞生長至融合狀態時，分別加藥處理。繼續培養24 h 后棄培養液，用PBS 洗1 遍后每孔再加入300 μL PBS，細胞刮收集細胞于離心管中并放入冰水浴，之后用細胞破碎儀破碎細胞30 s（30 Hz）；12000 r/min 離心10 min，收集上清液，并按照試劑盒說明書進行細胞蛋白濃度和SOD 活力以及GSH、MDA 的含量測定[4-6,13,16]。

1.3 數據處理

使用SPSS22.0 進行數據統計分析，結果以平均值±標準差（±s）表示，多組間數據比較采用獨立樣本t檢驗進行分析，以α=0.05 為檢驗水準。用Origin9.1 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 魚油對CDDP 所致HEK293 細胞損傷的保護作用

2.1.1 CDDP 對HEK293 細胞的毒性作用 如圖1所示，不同濃度的CDDP 作用于HEK293 細胞24 h后，對細胞生長有不同程度地抑制作用。隨著濃度的升高，CDDP 對HEK293 細胞存活率的抑制作用逐漸增強，且呈劑量依賴效應。當濃度為128 mg/L 時，CDDP 對HEK293 細胞的抑制率達到最高，為82.0%±4.0%。CDDP 對HEK293 細胞的IC50為20.058 mg/L，故選用20 mg/L 的CDDP 建立CDDP 損傷HEK293細胞模型。

圖1 CDDP 對HEK293 細胞的毒性作用（n=6）Fig.1 Toxic effect of CDDP on HEK293 cells (n=6)

2.1.2 魚油對HEK293 細胞存活率的影響 由圖2可知，不同濃度的魚油作用于HEK293 細胞24 h后，隨著魚油濃度的升高，細胞相對活力不斷上升。當魚油濃度為4 mg/L 時，HEK293 細胞的存活率達到最高，與對照組（0.0 mg/L）相比具有統計學意義（P＜0.05）。隨著魚油濃度的升高，HEK293 細胞存活率逐漸降低，當魚油濃度達到128 mg/L 時，HEK293細胞存活率與對照組相比無顯著性差異。即一定濃度范圍內的魚油可使HEK293 細胞增殖。

圖2 不同濃度魚油對HEK293 細胞存活率的影響（n=6）Fig.2 Effects of different concentrations of fish oil on the survival rate of HEK293 cells (n=6)

2.1.3 魚油對CDDP 所致HEK293 細胞損傷的保護作用 不同濃度魚油對CDDP 致HEK293 細胞損傷的影響見圖3。與對照組相比，CDDP 模型組細胞存活率顯著降低。當魚油濃度小于4 mg/L 時，魚油對CDDP 所致HEK293 細胞的損傷無顯著影響；當魚油濃度在4～16 mg/L 時，HEK293 細胞活力顯著高于CDDP 組（P＜0.05），提示在一定濃度范圍內，魚油對CDDP 損傷的HEK293 細胞具有保護作用。當魚油濃度為4 mg/L 時，HEK293 細胞的存活率達到最高，因此，選用此濃度的魚油對CDDP 致HEK293細胞損傷影響進行下一步試驗。

圖3 不同濃度魚油對CDDP 誘導HEK293 細胞損傷的影響（n=6）Fig.3 The effect of different concentrations of fish oil on the damage of HEK293 cells induced by CDDP (n=6)

2.1.4 魚油對CDDP 損傷HEK293 細胞內SOD 活力、GSH 和MDA 含量的影響 由表1 可知，與對照組相比，魚油組SOD 活力顯著增加（P＜0.05），GSH、MDA 含量與對照組無顯著性差異；CDDP 單獨作用HEK293 細胞時，SOD 活力和GSH 含量顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著增高（P＜0.05），提示CDDP可使HEK293 細胞內脂質過氧化程度增加，抗氧化水平降低；魚油+CDDP 組與CDDP 組相比GSH 含量顯著增加（P＜0.05），MDA 含量顯著降低（P＜0.05），提示一定濃度的魚油可以拮抗CDDP 所致HEK293細胞內抗氧化指標的改變。

表1 魚油和順鉑聯合用藥對HEK293 細胞內抗氧化指標的影響Table 1 The effect of the combination of fish oil and cisplatin on the anti-oxidation indexes in HEK293 cells

2.2 魚油和CDDP 對A549 細胞的影響

2.2.1 CDDP 對A549 細胞的抑制作用 如圖4 所示，隨著濃度的升高，CDDP 對A549 細胞生存抑制率逐漸增高。當CDDP 濃度為30 mg/L 時，抑制率達到最高為70.0%±4.0%。CDDP 對A549 的IC50為10.685 mg/L，因此選擇10 mg/L 濃度的CDDP 作為建立細胞損傷模型的濃度。

圖4 CDDP 對A549 細胞的抑制作用（n=6）Fig.4 Inhibition effect of CDDP on A549 cells (n=6)

2.2.2 魚油對A549 細胞的抑制作用 由圖5 可知，當魚油濃度為2 mg/L 時，細胞存活率顯著增加，但此時無濃度效應關系。當濃度小于8 mg/L 時，魚油對A549 細胞存活率的影響與對照組性比無顯著性差異，隨著魚油濃度的增大，細胞存活率逐漸降低，且當魚油濃度大于16 mg/L 時，魚油對A549 細胞有顯著的抑制作用（P＜0.05），說明魚油對A549 細胞的抑制作用與魚油濃度存在濃度效應關系。

圖5 不同濃度魚油對A549 細胞存活率的影響（n=6）Fig.5 Effects of different concentrations of fish oil on survival rate of A549 cells (n=6)

2.2.3 魚油聯合CDDP 對A549 細胞的影響 如圖6所示，與對照組相比，模型組的細胞抑制率顯著增加（P＜0.05）。與CDDP 模型組比，當魚油濃度小于32 mg/L 時無統計學意義（P＞0.05）；當魚油濃度為32 mg/L 時，A549 細胞的抑制率顯著高于CDDP 模型組（P＜0.05），且隨著魚油濃度的增大，A549 細胞的抑制率逐漸增高。提示高濃度的魚油可增強CDDP殺傷A549 細胞的效果。本實驗結果顯示當CDDP濃度為20 mg/L 時，會導致50%的HEK293 死亡，同時可顯著抑制A549 細胞增殖。

圖6 不同濃度的魚油聯合CDDP 對A549 細胞的影響（n=6）Fig.6 The effect of different concentrations of fish oil combined with CDDP on A549 cells (n=6)

3 討論與結論

有報道稱，魚油可抑制激活型Caspase-3 活性，減少活性氧（reactiveoxygen species，ROS）的生成，同時合成大量抗氧化酶參與氧自由基的清除，使氧化應激導致的細胞凋亡明顯減少[29-30]，修復局部受損傷的組織。趙艷鳳[31]發現魚油能夠明顯改善惡病質小鼠的一般狀態，增加體重，改善其營養指標并降低血脂，從而達到抗癌性惡病質效果。但魚油對CDDP 抗腫瘤活性的影響尚未見報道，本實驗研究結果表明，當魚油大于32 mg/L 時可增強CDDP 殺傷人肺腺癌細胞A549 細胞的效果，且隨著魚油濃度的增加，抑制效果逐漸增強。

CDDP 腎毒性主要原因是氧化應激[6]。使用CDDP 化療時，其腎臟中線粒體和細胞膜功能失調是由于CDDP 產生大量脂質過氧化產物和氧自由基，從而造成腎毒性[25]。本課題組前期的研究也表明HEK293 細胞的自身清除自由基的能力明顯不及CDDP 誘發產生自由基的能力，會造成生物體腎臟的氧化損傷[32]。脂質過氧化反應會產生一種重要代謝產物—MDA，其含量增加會破壞細胞膜的結構。細胞中GSH 合成量增加提示機體內存在著抵抗化學損傷的保護機制，其含量的減少或合成能力降低都會使細胞對某些特定的藥物變得異常敏感[33-34]。GSH活力的高低可體現機體清除氧自由基的能力，MDA的高低可反映細胞內脂質過氧化程度和細胞受自由基攻擊的嚴重程度。Aziroglu 等[35]研究表明CDDP對腎臟中GSH-Px、SOD 和CAT 等抗氧化酶系統具有抑制作用。本研究結果表明，CDDP 模型組GSH含量和SOD 活力明顯低于對照組，MDA 的含量明顯高于對照組，提示HEK293 細胞抗氧化系統的自由基清除能力顯著低于CDDP 誘發產生的自由基，最終導致細胞氧化損傷；CDDP+魚油組細胞內MDA含量明顯低于CDDP 組，GSH 含量明顯高于CDDP組，提示魚油能夠清除超氧化物陰離子等自由基，抑制了CDDP 引起的GSH 耗竭，減少脂質過氧化反應，拮抗CDDP 誘發的HEK293 細胞氧化損傷。

綜上所述，魚油能夠在一定質量濃度范圍提高HEK293 細胞存活率，拮抗CDDP 所致GSH 含量降低、MDA 含量升高，提示適當劑量的魚油對CDDP損傷HEK293 細胞具有保護作用，其機制可能是魚油抑制了CDDP 引起的GSH 耗竭，從而抑制了CDDP引起的HEK293 細胞損傷，提高了細胞的生存率。低濃度魚油對CDDP 所致A549 細胞的抑制作用沒有明顯的影響，高濃度的魚油增強了CDDP 的抗癌效果。由于本研究主要的實驗方法和手段為細胞活性檢測和氧化應激相關指標檢測，因此有關魚油確切的作用機制還有待進一步研究，比如后期進行細胞周期及周期蛋白檢測，細胞凋亡及凋亡蛋白等其他相關指標的檢測等。