不同海拔大鼠習服過程中肝臟脂肪酸代謝相關指標變化

任明 保積英 賈晨陽 張尉華，4

(1青海大學附屬醫(yī)院心內科，青海 西寧 810001；2青海省人民醫(yī)院心內科；3寶雞市中心醫(yī)院老年心腦血管病科；4吉林大學第一醫(yī)院心內科)

高原的低氧氣候環(huán)境可直接影響人類的身體健康，對于人體的重要組織器官〔1～3〕、關鍵的調節(jié)分子及遺傳物質〔4，5〕、腸道菌群的種類及數量均產生影響〔6～8〕，高原從各個方面影響人體的身體健康〔9，10〕。高原習服是機體適應高原環(huán)境的過程，是機體為了適應高原低氧低壓環(huán)境而發(fā)生的相應變化〔11〕。平原人移居高原后會因海拔高度、暴露時間、氣候條件、登高速度、營養(yǎng)狀況、個體差異等眾多因素的不同產生不同的適應結果〔12〕。越來越多的研究認為能量代謝對生活在高原低氧環(huán)境中的物種的生存起著重要作用〔13〕，認為高原習服中物質代謝及能量代謝的有效調節(jié)在高原習服過程中是最為關鍵的〔14～17〕。

肝臟中含有大量的參與脂肪酸代謝的酶類及其上游轉錄因子，乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、棕櫚酰基轉移酶(CPT)分別是脂肪酸合成與氧化的關鍵酶〔18，19〕。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)也是表達于肝臟中的一類蛋白激酶，參與脂肪酸代謝調控。ACC是AMPK的靶蛋白，AMPK被發(fā)現可以使ACC失活，從而使丙二酰輔酶(Malonyl)-A含量降低，使Malonyl-A對CPT-1的抑制作用減弱，使脂肪酸的β-氧化過程增強。脂肪酸代謝在缺氧環(huán)境中對碳水化合物起著很重要的補充作用〔20〕。研究證實，低氧刺激會激活AMPK，進而對下游靶蛋白實現調控功能，最終維持機體能量平衡。在低氧環(huán)境下參與脂肪酸代謝的相關蛋白主要受到海拔高度及暴露時間的影響。本研究設置了低、中、高海拔及不同暴露時間，同時在以往實驗的基礎上增加樣本含量，動態(tài)觀察大鼠肝組織中參與肝臟脂肪酸相關指標的水平變化，探討中高海拔地區(qū)不同暴露時間下肝臟脂肪酸代謝特點。

1 材料與方法

1.1實驗動物與材料 健康成年SPF級雄性SD大鼠110只，體質量168～206 g，購于西安站夢生物科技有限公司。酶標儀、聚合酶鏈反應(PCR)儀、蛋白轉膜儀購自Bio-Rad公司。凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能有限公司。漩渦混合器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。RT-PCR儀購自ABI公司。電泳儀購自北京六一公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏試驗設備有限公司。化學發(fā)光成像儀系統(tǒng)購自上海勤翔科學儀器有限公司。大鼠酮體(KB)、游離脂肪酸(FFA)、丙氨酸轉氨酶(ALT)檢測試劑盒購自南京建成有限公司。重組Anti-CPT1A抗體、山羊抗兔IgG H&L、重組Anti-Acetyl Coenzyme A Carboxylase抗體、Anti-AMPK alpha 1抗體、Anti-低氧誘導因子(HIF)-1 alpha抗體購自Abcam公司。beta-Actin Loading Control antibody Mouse MAb購自義翹神州有限公司。

1.2動物分組與處理 根據飼養(yǎng)環(huán)境不同分為對照組(n=10)及中、高海拔組(中、高海拔組又分別分為1、3、7、15、30 d組5個亞組各10只)。對照組在西安交通大學醫(yī)學部運動實驗中心動物房(海拔400 m)飼養(yǎng)30 d；中、高海拔1、3、7、15、30 d組分別在青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學中心動物房(海拔2 260 m)和瑪多縣人民醫(yī)院(海拔4 200 m)飼養(yǎng)1、3、7、15、30 d。各組大鼠居住和飲食條件均一致，室溫25℃，空氣流通，攝食及飲食自由，有專業(yè)人員給予定期消毒，飼養(yǎng)過程中無動物死亡。飼養(yǎng)的各環(huán)節(jié)均遵循各動物實驗中心要求。本研究經青海大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并按照國家衛(wèi)生部動物管理條例進行。大鼠分別在達到實驗規(guī)定的暴露時間后，給予水合氯醛腹腔注射麻醉，從心臟抽取血液4 ml于抗凝管內，用低溫高速離心機3 000 r/min離心10 min，取上清液于凍存管內，置于-80℃冰箱內；隨后取大鼠適量肝組織置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3血漿ALT、NEFA及肝組織中KB測定 采用ALT試劑盒、KB試劑盒和NEFA試劑盒分別檢測血漿中的ALT、NEFA及肝組織中的KB，嚴格按照試劑盒操作步驟進行。

1.4AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α mRNA檢測 將肝組織在液氮急速冷凍后研磨成粉，取50 mg加入含有Trizol試劑1 ml的離心管中，混勻，室溫放置15 min以上。加入200 μl的氯仿，顛倒混勻后室溫放置5 min。4℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上清至新的離心管中，加入等體積異丙醇混勻，-20℃放置60 min。4℃、12 000 r/min離心15 min去上清液。加入75%乙醇洗滌，4℃、12 000 r/min離心15 min去上清液，用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度，瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。取總RNA 800 ng，加入1 μl引物(0.1 μg/μl)、10 μl 2×TS Reaction Mix、1 μl TransScript@RT/RI Enzyme Mix、1 μl TransScript@RT/RI Enzyme Mix、加RNase-free水至總體積為20 μl。輕輕混勻，25℃反應10 min，85℃反應5 s取出。將合成cDNA置于-80℃保存，后續(xù)熒光定量檢測的樣本cDNA使用RNase-free Water按照1∶1稀釋進行反應。引物序列見表1。PCR體系包括Evagreen 2×qPCR Master Mix(10 μl)、上下游引物(各0.6 μl)、cDNA(2 μl)、無RNA酶水(6.8 μl)。PCR反應條件：預變性95℃ 10 min；變性95℃，5 s，40個循環(huán)；退火/延伸60℃，30 s，40個循環(huán)。 待測基因引物序列β-Actin：正向5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,反向5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′;ACC1：正向5′-TTGGACAACGCCTTCAC-3′,反向5′-GCAGCCCATTACTTCATCA-3′;CPT：正向5′-AGGTCGGAA GCCCATGTTGTA-3′,反向5′-GCTGTCATGCGCTGGAAGTC-3′;AMPK：正向5′-AACCTGAAAACGTCCTGCT-3′,反向5′-CGCTGCTCCAGATGTCTAC-3′;HIF：正向5′-GCATCTCCACCTTCTACCC-3′,反向5′-TCTTTCCTGCTCTGTCTGG-3′。

1.5AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α蛋白檢測 肝組織樣本研磨后，取100 mg加入到預冷的1.5 ml離心管中，加入400 μl RIPA裂解液，充分混勻，4℃放置60 min后，4℃下12 000 r/min離心15 min收集上清。二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白濃度。樣本加入適量5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)，100℃沸水加熱處理5 min，使蛋白充分變性，12 000 r/min離心5 min，取上清備用。預染蛋白Marker 9 μl，樣品每孔上樣蛋白50 μg。電泳結束后，轉膜時采用恒壓轉膜，電壓100 V，使用0.45 μm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜。AMPK、β-actin(內參)轉膜時間為60 min，CPT-1、HIF-1α轉膜時間為90 min，ACC-1轉膜時間為150 min。使用含5%脫脂奶粉的封閉液，封閉轉印膜1 h，然后TBST洗3次，5 min/次。加一抗4℃孵育過夜后加入二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次，將顯色液A液和B液混合，加2 ml至膜上，用ChemiScope mini化學發(fā)光儀檢測、拍照。使用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t或TamhaneT2檢驗。

2 結 果

2.1不同海拔習服過程中大鼠血漿ALT及FFA含量 中海拔和高海拔暴露期間，各組血漿中ALT、FFA含量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2不同海拔習服過程中大鼠肝臟HIF-1α、AMPK、ACC1、CPT-1 mRNA表達 與對照組比較，HIF-1α mRNA在中、高海拔暴露的1、3、7、15 d顯著升高；與對照組比較，AMPK mRNA在中海拔暴露的1、3、7、30 d及高海拔暴露的1、3、7、15、30 d顯著降低；高海拔暴露第15天顯著低于中海拔暴露第15天；與對照組比較，ACC1 mRNA在中、高海拔暴露的1、3 d顯著升高，且高海拔暴露1、3 d顯著高于中海拔暴露1、3 d；與對照組比較，CPT-1 mRNA在中海拔暴露的3 d顯著升高，15 d顯著降低；在高海拔暴露的3 d顯著升高，第7、15天顯著降低；高海拔暴露3 d顯著高于中海拔的3 d，高海拔暴露7、15 d顯著低于中海拔7、15 d(P<0.05)。見表1。

表1 各組血漿ALT、FFA含量及AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α mRNA表達水平比較

2.3不同海拔習服過程中大鼠肝臟KB含量 與對照組比較，中海拔各組肝臟KB均無顯著差異(P>0.05)；高海拔3 d組KB含量顯著高于對照組及高海拔1 d組(P<0.05)；至暴露第7天開始恢復正常。見表2。

2.4不同海拔習服過程中大鼠肝臟HIF-1α、AMPK、ACC1、CPT-1蛋白表達 與對照組比較，HIF-1α蛋白在中海拔3 d顯著升高，高海拔暴露1、3 d顯著升高，且顯著高于中海拔組1、3 d；與對照組比較，AMPK蛋白在中海拔暴露3、7、15、30 d及高海拔暴露1、3、7、15、30 d顯著降低；高海拔暴露各組顯著低于中海拔各組；與對照組比較，ACC1蛋白在中海拔暴露3 d顯著升高，在高海拔暴露1、3 d顯著升高，且顯著高于中海拔暴露1、3 d；與對照組比較，CPT-1蛋白在中海拔暴露3 d顯著升高；在高海拔暴露3 d顯著升高，第7天開始降低，第15天顯著降低；高海拔暴露第7、15天顯著低于中海拔第7、15天(P<0.05)。見表2。

表2 各組肝臟組織中KB含量及AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α蛋白表達水平比較

3 討 論

高原低氧對能量代謝的影響主要表現為多種代謝產物和關鍵酶的顯著變化〔21〕，能量代謝對生活在高原低氧環(huán)境中的物種的生存起著重要作用，代謝調節(jié)能有效提高機體對低壓缺氧的適應性反應。在青藏高原可可西里自然保護區(qū)(4 630 m)和拉吉山腳(2 600 m)設陷阱捕獲了10只鼠兔，生活在海拔4 630 m的鼠兔體內，涉及碳水化合物、脂肪、能量和氧化還原穩(wěn)態(tài)通路的幾種代謝物發(fā)生了顯著的改變〔22〕。并且有研究認為新陳代謝的適應，是人類進化到高海拔生活的基礎〔23〕。越來越多的研究試圖確定高原適應的遺傳基礎，并共同提出這種適應是通過改變多個分子機制發(fā)生的，人們意識到適應不僅涉及氧輸送的變化，而且還涉及在細胞水平上改變氧利用的代謝改變〔24〕。

高原低氧習服是機體是在低氧低壓環(huán)境下發(fā)生的可逆的適應性變化〔11〕。適應高原低氧的過程受到眾多因素的影響，而海拔高度和低氧暴露的時間是最重要的影響因素〔12〕。目前研究更多集中于高原習服過程中能量代謝模式的轉變，發(fā)現提高氧氣利用率可以更好適應低氧環(huán)境〔4〕。

有學者研究顯示，慢性高原暴露(4 300 m，8 w)高脂飲食組與高原暴露正常飲食組的大鼠肝組織磷酸化(p)-AMPK表達明顯高于對照組，而與非高原暴露高脂飲食組比較差異無顯著性，證明低氧環(huán)境下會激活AMPK的活性〔25，26〕。本研究結果提示，低氧的存在會抑制AMPK的表達，且海拔越高抑制越明顯。而對于AMPK的磷酸化水平未予以評估。ACC-1作為AMPK的下游靶蛋白大量表達于肝臟，催化乙酰輔酶A為轉化為Malonyl-A。激活的AMPK通過磷酸化及基因表達調控ACC-1抑制脂肪酸合成代謝〔27〕。本研究結果提示，大鼠肝臟脂肪酸的合成在中海拔早期會有暫時的增強，以滿足更多的能量需求。在高海拔早期肝臟脂肪酸合成代謝可能增強，之后恢復至對照組水平。但AMPK一直呈低表達，提示在此過程ACC-1可能還受到其他系統(tǒng)的調控。同時同一暴露時間下海拔越高ACC1表達越高，脂肪酸的合成能力可能越強。CPT1是進行β氧化的限速酶。CPT1活性受Malonyl-A抑制，從而抑制β氧化。酮體是肝臟中氧化分解的中間產物，通過觀察期變化水平間接了解脂肪酸氧化水平。本研究結果提示，中海拔地區(qū)由于低氧狀態(tài)很快被糾正，肝臟脂肪酸氧化代謝增強的持續(xù)時間短暫，并且程度較弱。早期高海拔組CPT1 mRNA表達及蛋白表達呈現一過性增，但與中海拔不同的是從暴露的第7天開始CPT1 mRNA表達及蛋白表達逐漸降低，至暴露15 d最低，至30 d又恢復對照組水平，呈現先升高后降低再恢復至對照組的趨勢。而肝臟酮體在高海拔急性期顯著升高，后期恢復對照水平。本研究結果提示，脂肪酸的氧化能力在中、高海拔早期可能升高，在中海拔很快就恢復到正常組水平，而在高海拔組中卻發(fā)現在高原暴露的第15天卻降至最低，但酮體的水平卻沒有發(fā)生這種變化。因此尚不能判斷CPT-1的這種變化是否代表脂肪酸的氧化過程。目前更多的研究發(fā)現過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α，是CPT的上游調控因子〔8〕。夏爾巴人單倍型與骨骼肌PPARα及其靶點CPT1B表達降低有關，導致線粒體有氧氧化降低〔24〕。本研究未涉及該通路，以后可對低氧下肝臟組織中PPARα/CPT-1通路進行深入研究。

關于脂肪酸代謝尤其是氧化代謝在低氧環(huán)境下的研究有很多，但都沒有統(tǒng)一的認識。一項模擬低氧的研究發(fā)現〔28〕，大黃魚在急性低氧應激(96 h內)條件下，可能由于持續(xù)時間很短，肝臟對脂質利用沒有顯著變化。考慮到高原通常還伴有低溫，研究指出高原鼠兔在相同的體重下，冬季的消耗量比夏季低29.7%，使它們在冬季的代謝范圍異常低。一項冷缺氧相關研究顯示，暴露1 d和暴露7 d大鼠的肌肉和肝臟中CPT1表達顯著減少，認為脂肪酸代謝、氧化代謝水平降低可能是動物低代謝狀態(tài)的原因〔29〕。有學者發(fā)現，將肝細胞暴露于1% O2可降低CPT1 mRNA表達，抑制氧化代謝，誘導小鼠肝臟脂肪積聚，而對脂肪酸的合成無顯著影響〔30〕。本研究結果提示，在中、高海拔低氧急性暴露下(3 d)，參與脂肪酸合成與氧化的關鍵酶表達均增加，但中、高海拔組由于缺氧狀態(tài)很快被糾正(HIF-1α很快恢復到非暴露水平)，持續(xù)時間短暫，隨后恢復到對照組水平。在短期低氧應激期間，肝臟呼吸容量增強和脂質代謝改變支持代謝穩(wěn)態(tài)。另外喜馬拉雅夏爾巴人是西藏后裔，非常適應高海拔低壓缺氧的生活。與低地種群相比，組織氧輸送明顯增強，此外發(fā)現組織氧利用(即代謝適應)的差異同樣支持這種適應，與低地人相比，夏爾巴人在骨骼肌活組織檢查中顯示出較低的脂肪酸氧化能力，同時提高了氧氣利用效率，改善了肌肉能量代謝，以及防止氧化應激〔15〕。高原鼢鼠一生都生活在地下密封的洞穴中，氧氣非常的有限，與褐鼠相比，高原鼢鼠的能量代謝相關基因(如線粒體和脂肪酸β氧化)進化速度加快〔31〕。以上實驗均提示，在氧供應不足的情況下機體內的能量代謝過程錯綜復雜，這個除了不同的實驗設計導致的結果差異外，另外有文獻報道，即使在相同的海拔下，季節(jié)差異〔32〕、年齡性別差異及不同研究對象都會導致不同的結果〔29，33～35〕。宏基因組學預測顯示，高原鼠兔中大部分與新陳代謝(如能量代謝和脂質代謝)有關的基因功能在冬季較少，從而降低能量需求〔10〕。另外高原環(huán)境具有多種混雜因素，高海拔環(huán)境并不是單獨研究缺氧生理反應的理想環(huán)境〔36〕，如高海拔地區(qū)活動或飲食的變化，未來的研究可將不同的低氧方案與可控的活動/不活動和飲食相結合。

也有研究支持的結果和本研究相似。在慢性暴露于模擬海拔5 500 m，2個月的大鼠，肝臟和骨骼肌中脂肪酸的氧化水平增加〔37〕。海拔4 300 m慢性暴露(8 w)，使AMPK活化，進而使CPT1表達增加，糾正非酒精性脂肪肝的脂質的形成〔9〕。一項研究通過轉錄組學的方法，研究了布氏田鼠骨骼肌組織對低氧環(huán)境的反應，發(fā)現其通過加強磷酸戊糖途徑和線粒體的脂肪酸合成途徑來維持身體的能量供應〔15〕。藏羊作為青藏高原適應較好的物種，與漢羊相比，藏羊肝臟中脂肪酸氧化能力較強，以應對青藏高原惡劣環(huán)境下的低能量攝入〔38〕。在高海拔地區(qū)，藏豬的能量代謝相關的代謝途徑(包括脂肪酸的氧化)不斷增加〔39〕。此外，惡性腫瘤會使體內的脂肪酸持續(xù)合成，需要滿足能量需求，而ACC控制這一過程，從而研究提出ACC抑制劑有望用于腫瘤治療〔40〕。以上研究與本文得出相似結果，提示只要氧氣供應不足，機體脂肪酸氧化會增強，因為這樣會產生更多的能量。另外，本研究發(fā)現肝臟內CPT1蛋白表達變化趨勢與HIF-1α一致。一項腎透明細胞癌相關研究指出，CPT1A是HIF-1和HIF-2復合物的直接靶基因，并且在腫瘤細胞中被抑制，弱化脂肪酸的分解代謝，但在真實的高原暴露下兩者的關系有待深入研究。

綜上，中、高海拔地區(qū)與平原地區(qū)大鼠脂肪酸代謝存在差異。不同氧濃度下的脂肪酸代謝變化規(guī)律及機制錯綜復雜，以后研究應深入探討其分子機制，以便更好地適應高原低氧環(huán)境。