circ_0031739通過下調miR-98-5p促進高糖誘導的心肌細胞損傷

杜美玲 王曉元 李會賢 李方江 張愛愛

(河北北方學院附屬第一醫院心血管內科，河北 張家口 075400)

糖尿病是一種以長期高血糖為特征的代謝性疾病，隨著人們生活水平和飲食習慣的改變，其發病率呈不斷上升趨勢，已成為21世紀全球最嚴重的公共衛生問題之一〔1,2〕。人體異常的葡萄糖水平可導致多種嚴重并發癥，其中糖尿病心肌病是糖尿病的心血管并發癥，也是糖尿病致死致殘的主要原因〔3〕。研究表明〔4,5〕，高糖誘導心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病發生和發展的重要因素。

環狀RNA(circRNA)是一類具有閉合環狀結構的非編碼RNA〔6〕。近年來多項研究表明〔7～9〕，circRNA在糖尿病及其并發癥中發揮重要調控作用。如房遠等報道〔10〕，circ_0031739在糖尿病患者血清和高糖處理的人臍靜脈內皮細胞中均出現高表達，提示circ_0031739可能參與了糖尿病的病理機制。但目前circRNA在高糖誘導的心肌細胞凋亡中的作用及機制鮮有報道。本研究探討circ_0031739在高糖誘導的心肌細胞損傷中的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；葡萄糖(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(中國Takara公司)；CCK8試劑(美國Sigma公司)；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/磺化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；ABI 7500型定量PCR儀(美國ABI公司)；HBS-1101酶標分析儀(南京德鐵實驗設備有限公司)；FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2細胞培養 人心肌細胞系AC16購自美國 Millipore公司。細胞接種于含有1%青霉素和鏈霉素、12%胎牛血清的DMEM培養液，放入37℃，5% CO2的培養箱中培養。

1.3方法

1.3.1細胞轉染及分組 對數生長其的AC16細胞分為以下組別，即為對照組：用含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液培養；高糖+si-NC組、高糖+si-circ#1組、高糖+si-circ#2組、高糖+miR-NC組、高糖+miR-98-5p組、高糖+si-circ#1+anti-miR-NC組、高糖+si-circ#1+anti-miR-98-5p組：使用Lipofectamine3000轉染試劑分別將小干擾RNA(siRNA)陰性對照、circ-0031739 siRNA#1、circ-0031739 siRNA#2、miRNAmimics、miR-98-5pmimics及circ-0031739 siRNA#1+miRNAinhibitor、circ-0031739 siRNA#1+miR-98-5p inhibitor轉染至細胞，轉染48 h后，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液培養。

1.3.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗 收集各組生長至對數期的細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度和質量，使用逆轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR，程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環。qRT-PCR用circ_0031739、miR-98-5p、U6、GAPDH引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。結果采用2-△△Ct法計算circ_0031739、miR-98-5p的相對表達水平。

1.3.3CCK8實驗檢測細胞增殖活性 收集各組生長至對數期的細胞，消化后制成濃度為1×105/ml的單細胞懸液，以每孔200 μl接種于96孔板中，每組細胞設置5個重復孔，放入培養箱培養24 h后，吸除孔內培養液，分別加入含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液或含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養液，繼續培養24 h。然后向每孔加入10 μl CCK8溶液，孵育4 h。使用酶標儀檢測每孔在450 nm處的吸光度(OD)值。

1.3.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集處理后的各組細胞，消化并制成濃度為1×105ml的單細胞懸液，離心，PBS沖洗細胞。參照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書，加入1×結合緩沖液重懸細胞，然后分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混勻，避光反應20 min。1 h內使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.5雙熒光素酶實驗 通過circBank網站預測到circ_0031739與miR-98-5p具有結合位點。將含有miR-98-5p結合位點的circ_0031739片段及突變片段克隆到熒光素酶報告載體，分別命名為circ_0031739-WT、circ_0031739-MUT，然后分別與miR-NC、miR-98-5p共轉染心肌細胞，轉染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞中熒光素酶活性。

1.4統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行LSD-t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1circ_0031739在高糖誘導的心肌細胞中高表達 與對照組比較，高糖組心肌細胞中circ_0031739相對表達量明顯升高(1.00±0.06 vs 3.22±0.42，P<0.05)。

2.2抑制circ_0031739對高糖誘導的心肌細胞增殖和凋亡的影響 與對照組和si-NC組比較，高糖+si-circ#1組和高糖+si-circ#2組心肌細胞中circ_0031739的相對表達量明顯減少(1.00±0.05、1.00±0.03 vs 0.31±0.05，1.00±0.05、1.00±0.03 vs 0.49±0.08，P<0.05)，高糖+si-circ#1的抑制效率最佳，用于后續實驗。

CCK-8實驗結果顯示，與對照組比較，24、48、72 h時高糖組心肌細胞的增殖活性明顯降低(P<0.05)；與高糖+si-NC組比較，48、72 h時高糖+si-circ#1組心肌細胞的增殖活性明顯升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果顯示，與對照組比較，高糖組心肌細胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)；與高糖+si-NC組比較，高糖+si-circ#1組心肌細胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果

表1 抑制circ_0031739對高糖誘導的心肌細胞增殖和凋亡的影響

2.3circ_0031739靶向結合miR-98-5p 通過circBank網站預測到circ_0031739與miR-98-5p具有靶向結合位點，見圖2。雙熒光素酶實驗結果，circ_0031739 WT和miR-98-5p共轉染的心肌細胞中熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見表2。qRT-PCR結果顯示，與對照組和si-NC組比較，si-circ#1組心肌細胞中miR-98-5p相對表達水平明顯升高(1.00±0.09、1.00±0.12 vs 3.41±0.34，P<0.05)。

圖2 circ_0031739與miR-98-5p的靶向結合位點

表2 雙熒光素酶活性檢測結果

2.4過表達miR-98-5p對高糖誘導的心肌細胞增殖和凋亡的影響 qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，高糖組心肌細胞中miR-98-5p相對表達量明顯降低(1.00±0.06 vs 0.49±0.07，P<0.05)。miR-98-5p過表達效率檢測結果，與空白組和miR-NC組比較，miR-98-5p組心肌細胞中miR-98-5p相對表達量明顯升高(1.00±0.10、1.00±0.13 vs 5.63±0.69，P<0.05)。CCK8和流式細胞儀檢測細胞增殖活力和凋亡率，與對照組比較，48、72 h時高糖組心肌細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡率明顯升高(均P<0.05)；與高糖+miR-NC組比較，48、72 h時高糖+miR-98-5p組心肌細胞增殖活性明顯增強，凋亡率明顯降低(均P<0.05)。見圖3和表3。

表3 過表達miR-98-5p對高糖誘導的心肌細胞增殖和凋亡的影響

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果

2.5抑制miR-98-5p逆轉抑制circ_0031739對高糖誘導的心肌細胞增殖和凋亡的保護作用 與空白組和anti-NC組比較，anti-miR-98-5p組心肌細胞中miR-98-5p相對表達量明顯降低(1.00±0.06、1.00±0.04 vs 0.39±0.07，P<0.05)。CCK8實驗和流式細胞儀檢測細胞增殖活性和凋亡率，與高糖+si-NC組比較，24、48、72 h時高糖+si-circ#1組心肌細胞增殖活性明顯升高，細胞凋亡率明顯降低(均P<0.05)；與高糖+ si-circ#1+anti-miR-NC組比較，高糖+ si-circ#1+anti-miR-98-5p組細胞24、48、72 h時增殖活性明顯降低，細胞凋亡率明顯升高(均P<0.05)。見圖4和表4。

圖4 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果

表4 抑制miR-98-5p逆轉circ_0031739的作用

3 討 論

糖尿病心肌病主要病理特征是心肌細胞凋亡、心肌纖維化、代謝紊亂及微血管病變等〔11〕。心肌細胞凋亡與心血管疾病的發生及發展密切相關，牟嬌等〔12〕通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)構建糖尿病大鼠模型，發現糖尿病大鼠構建成功第4周，大鼠心肌細胞凋亡明顯增加，且隨著糖尿病形成時間的延長，心肌細胞凋亡逐漸加重，說明心肌細胞凋亡參與糖尿病心肌病的發展過程。Zhang等〔13〕研究發現高糖可以激活心肌細胞內源性和外源性凋亡通路，誘導乳鼠心肌細胞凋亡。提示高糖可通過多種途徑誘導心肌細胞凋亡，進而參與糖尿病心肌病的進展。

circRNA多位于細胞質中，具有穩定性、保守性、組織特異性等特性，已被發現在糖尿病、心血管疾病及神經系統疾病等多種疾病的發生及發展中發揮重要調控作用〔14～16〕。Zhou等〔17〕研究發現circ_010567在糖尿病小鼠心肌和心臟成纖維細胞中均顯著上調，功能實驗證實敲除circ_010567能夠抑制小鼠心肌纖維化。Li等〔18〕研究發現circNCX1在缺氧再灌注刺激的心肌細胞中高表達，促進心肌細胞凋亡，而心肌缺血再灌注小鼠的心肌細胞和心臟組織中circNCX1表達的降低可減輕心肌細胞凋亡和缺血再灌注損傷。本研究結果說明circ_0031739高表達參與高糖誘導的心肌細胞凋亡過程，敲除circ_0031739則能夠減弱高糖誘導的心肌細胞凋亡，促進心肌細胞增殖，對心肌細胞起保護作用。circRNA的功能研究表明〔19，20〕，circRNA分子富含microRNA(miRNA)結合位點，在細胞中主要作為miRNA的海綿起作用。miRNA是一類長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，在機體各種組織和器官中廣泛表達，參與調節多種細胞的生理和病理過程〔21〕。李祖霞等〔22〕研究表明，高糖可誘導小鼠心肌細胞中miR-26a和miR-197表達升高，干擾miR-26a和miR-197可通過調節MCL1基因表達，促進高糖誘導的心肌細胞增殖活力，降低細胞凋亡率。miR-98被報道在缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷中表達降低，而姜黃素可通過上調miR-98減輕缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷〔23〕。此外，有研究表明〔24，25〕，miR-98在心肌炎和心肌梗死中表達降低，參與調節心肌細胞凋亡。

本研究證實抑制circ_0031739能夠上調細胞中miR-98-5p的表達。進一步功能實驗分析發現，過表達miR-98-5p能夠增強高糖誘導的心肌細胞增殖活性，減少細胞凋亡，而將miR-98-5p inhibitor和circ_0031739 siRNA共轉染細胞后， circ_0031739對高糖誘導的心肌細胞的保護作用減弱或消失，說明抑制circ_0031739對高糖誘導的心肌細胞的保護作用是通過上調miR-98-5p實現的。