食欲素-B對急性缺血性腦卒中大鼠睡眠促進及神經保護作用

謝陽 張淑江 孟仁亮 楊洋 羅映 李作孝

(西南醫科大學附屬醫院，四川 瀘州 646000)

急性缺血性腦卒中〔1〕是最常見的腦卒中類型，具有高發病率、高致殘率、高致死率的特點，預后較差，嚴重影響著患者及家屬的生活質量，因此及時有效對急性缺血性腦卒中患者進行治療尤為重要〔1，2〕。急性缺血性腦卒中主要由于腦動脈粥樣硬化和血栓形成導致管腔狹窄甚至閉塞，造成局灶性急性腦組織損傷，嚴重時會引發神經細胞不可逆性失活，甚至導致永久性殘疾和死亡〔3〕。腦卒中后睡眠障礙(PSSD)是腦卒中的常見并發癥。PSSD會影響患者認知水平、神經功能恢復和獨立生活能力，使住院時間延長，患者發生致殘率和死亡率的概率增加〔4～6〕。研究表明，急性缺血性腦卒中患者睡眠障礙的發生率在40%～80%〔7，8〕，發病18個月后，18.1%～49.0%的患者仍有睡眠障礙〔9〕。食欲素首先在下丘腦外側區中發現，它主要在攝食、睡眠-覺醒、能量代謝等生理功能中發揮著重要作用。食欲素由編碼食欲素A、食欲素B、前食欲素原，食欲素受體-1和食欲素受體-2組成。食欲素-B可與食欲素受體-1和食欲素受體-2相結合。研究表明，食欲素A在阿爾茨海默病和抑郁癥等疾病中起到神經保護的作用，但食欲素-B的研究較少。本研究探討食欲素-B對急性缺血性腦卒中大鼠的睡眠促進及神經保護作用的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選取SPF級7～9周齡雄性健康SD大鼠108只，均購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016，自由飲食，12 h/12 h明暗周期飼養。

1.1.2主要試劑 食欲素-B購自美國Phoenix藥物有限公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色試劑盒、電化學發光(ECL)試劑盒均購自美國Thermo公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)試劑盒均購自南京建成生物有限公司，一抗p65、缺氧誘導因子(HIF)-1α、β-actin、二抗IgG均購自美國Cell Signaling公司；其余試劑均購自生工(上海)生物工程股份有限公司。

1.2方法

1.2.1分組及腦梗死大鼠模型的建立 所有大鼠隨機分為模型組、假手術組、食欲素-B組各36只。參照文獻方法〔10〕，使用水合氯醛麻醉大鼠，模型組和食欲素-B組使用線栓法制作腦缺血大鼠模型，線栓插入深度為18～20 mm，假手術組操作同上，但線栓插入深度10 mm，根據神經行為學評分來確定模型是否制備成功。造模時向側腦室內注射10 μg食欲素-B，假手術組和模型組給予同等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.2.2TTC染色測定腦梗死體積 每組取6只造模后的大鼠，連續給藥3 d，末次給藥1 h后取出完整腦組織切片后，切片厚度約2 mm，然后將腦組織切片后放入TTC試劑盒進行染色，正常組織為深紅色，腦梗死組織為蒼白色。腦梗死體積=(對側面積均值總和-梗死側非梗死面積均值總和)×梗死腦組織厚度(2 mm)。

1.2.3大鼠腦組織含水量測定〔11〕每組取6只造模后的大鼠，連續給藥3 d，末次給藥1 h后進行麻醉后，取出腦組織，稱取腦組織濕體重，然后將腦組織放入烘箱中，24 h后稱取腦組織干體重，反復稱取3次后，取平均值，計算腦組織含水量。大鼠腦組織含水量=(腦組織濕體重-腦組織干體重)/腦組織濕體重×100%。

1.2.4大鼠神經功能障礙評分 根據文獻〔12〕，每組取6只造模后的大鼠，連續給藥3 d，末次給藥1 h后進行神經功能障礙評分，分數越高，大鼠的行為障礙則越嚴重。評分為1～3 分的大鼠納入實驗。

1.2.5大鼠睡眠記錄 根據文獻〔13〕，運用PC-30記錄肌電和腦電活動，每組取6只造模后的大鼠，連續給藥3 d，末次給藥1 h后，開始記錄，連續記錄6 h，每10 s進行1次分段，分為非快眼動睡眠(NREMS)潛伏期和快眼動睡眠(REMS)潛伏期。其中NREMS以高幅慢波和睡眠梭形波為主要表現，肌電活動減少；REMS以低幅快波為主要表現，無明顯肌電活動，偶爾有肌肉抽動除外。

1.2.6氧化應激指標檢測 每組取6只造模后的大鼠，連續給藥3 d，末次給藥1 h后取出腦組織，加入PBS進行超聲研磨，離心取上清，采用化學熒光試劑盒根據試劑盒說明書檢測SOD、GSH、NO、MDA含量。

1.2.7Western印跡檢測p65/HIF-1α的表達 每組取6只造模后的大鼠，連續給藥3 d，末次給藥1 h后取出腦組織，用RIPA裂解緩沖液提取裂解產物，采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白質測定試劑盒測定蛋白濃度。高溫變性后，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質從樣品緩沖液中分離，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜中并用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后在4℃下與p65，HIF-1α孵育過夜，β-actin為內參；然后與二抗IgG在室溫下孵育2 h。使用ECL試劑盒檢測蛋白質信號。

1.3統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1食欲素-B對急性缺血性腦卒中大鼠腦梗死體積的影響 假手術組無明顯梗死灶，腦梗死體積為(30.09±4.15)cm3，而模型組出現明顯梗死灶，腦梗死體積為(30.09±4.15)cm3，食欲素-B組梗死灶體積(19.89±4.08)cm3，較模型組顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 TTC檢測各組大鼠腦梗死體積

2.2食欲素-B對急性缺血性腦卒中大鼠腦組織含水量和神經功能的影響 模型組和食欲素-B組腦組織含水量均高于假手術組，食欲素-B組腦組織含水量低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；假手術組神經功能評分均為(0.00±0.00)分，食欲素-B組神經功能評分低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 食欲素-B對急性缺血性腦卒中大鼠腦組織含水量和神經功能的影響

2.3食欲素-B對急性缺血性腦卒中大鼠睡眠的促進作用 與假手術組相比，模型組和食欲素-B組NREMS潛伏期明顯延長，REMS潛伏期明顯縮短，且食欲素-B組NREMS潛伏期短于模型組，REMS潛伏期長于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4食欲素-B對急性缺血性腦卒中大鼠氧化應激的影響 與假手術組相比，模型組和食欲素-B組SOD、GSH降低，MDA、NO升高，且食欲素-B組SOD、GSH高于模型組，MDA、NO低于模型組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 食欲素-B對急性缺血性腦卒中大鼠睡眠的促進作用及氧化應激的影響

2.5食欲素-B對急性缺血性腦卒中大鼠p65/HIF-1α信號通路的影響 與假手術組(1.02±0.07、1.09±0.06)相比，模型組(1.83±0.14、1.71±0.12)和食欲素-B組p65、HIF-1α蛋白(1.38±0.09、1.25±0.08)升高，且食欲素-B組p65、HIF-1α蛋白低于模型組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖2。

圖2 Western印跡檢測p65/HIF-1α信號通路蛋白表達

3 討 論

近年來急性缺血性腦卒患者逐年增多并且表現出年輕化的趨勢，給家庭和社會帶來嚴重的經濟負擔，因此對急性腦卒中的預防和治療尤為重要〔14，15〕。Hearse等〔16〕研究表明當受損的缺血腦組織突然獲得O2-時會使其損傷加重，這也是再灌注損傷。臨床上常用重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)，如阿替普酶等藥物作為急性腦梗死靜脈溶栓藥物，其作用確切且出血發生風險較小〔17〕，但阿替普酶半衰期較短，約75%的患者容易遺留神經功能障礙，常不能達到預期效果〔18〕。早在1998年，Sakurai等〔19〕發現了食欲素，它是一種與進食相關的神經肽，可以分為食物素A與食欲素-B，其共同作用于腦內廣泛分布的受體發揮作用。研究表明，食欲素神經元在中樞神經系統廣泛分布，他們可以抑制神經元的凋亡，對神經有明顯的保護作用。食欲素A在臨床的研究較多，Yuan等〔20〕研究表明在腦缺血再灌注損傷和腦血管疾病的神經細胞的死亡中起到舉足輕重的作用，而且食欲素不僅對缺血性腦卒中的血壓、血糖、炎癥有調節作用，而且對腦卒中后的抑郁和認知功能障礙也有作用。Kitamura等〔21〕研究也表明,食欲素A具有神經保護作用，腦缺血大鼠側腦室再灌注食欲素A后，腦梗死面積顯著降低。Paulina等〔22〕研究表明，食欲素-B與食欲素A都有神經保護作用，其作用機制可能是通過降低caspase-3的活性來發揮。Guerreiro等〔23〕研究發現食欲素-B對于多巴胺神經元的自發死亡起到保護作用，其作用機制可能通過作用于食欲素2型受體而實現的，而食欲素A對多巴胺神經元的保護作用較少。本研究結果表明，食欲素-B在腦梗死大鼠中發揮著重要作用，其對急性缺血性腦卒中大鼠具有神經功能保護作用，需要進一步研究其機制。

睡眠對于人體極為重要，任何人都離不開睡眠，人類有1/3左右的時間都在睡眠中度過。腦卒中后睡眠障礙與性別、年齡、腦卒中部位、神經功能缺損程度、焦慮等相關。PSSD的表現形式主要有過度睡眠、異態睡眠、失眠、睡眠呼吸暫停、不安腿綜合征、周期性肢體運動障礙等〔24～26〕。正常人的睡眠分為NREMS或慢波睡眠和REMS或異相睡眠，曹瑞等〔27〕研究表明，機體受到創傷后，NREMS潛伏期會明顯延長，導致覺醒時間會增加，REMS會縮短，相關腦組織會發生放電異常情況。本研究結果說明，食欲素B對急性缺血性腦卒中大鼠具有睡眠促進作用。

腦組織缺血缺氧損傷的重要因素可能是氧化應激反應的過度激活，在該過程中生產大量的活性氧(ROS)〔28，29〕。ROS在腦組織中有極強的氧化性，它可以與腦組織在細胞膜和細胞器膜內的脂質發生氧化反應，這會造成細胞功能的損害和膜結構破壞，同時也會產生大量的脂質氧化產物MDA〔30〕。SOD可以通過歧化反應來清除體內生成的ROS，大量的ROS可以使SOD、過氧化氫酶(CAT)不斷消耗，超出抗氧化酶的代償能力范圍并出現組織損害。SOD是一種具有還原活性的抗氧化酶，可以催化ROS還原成過氧化氫。SOD，GSH是機體內清除自由基重要的抗氧化酶類，可以抑制ROS和氧化應激的產生〔31〕。NO是一種神經毒性自由基，其可以與超氧自由基或者O2反應生成超氧亞硝酸根，后者可釋放出OH-和NO2-自由基，進而引發氧化作用，產生脂質過氧化，導致細胞凋亡和組織損傷〔32〕。本研究結果提示，腦梗死組織中氧化應激反應過度激活，食欲素-B可能通過抗氧化應激促進急性缺血性腦卒中大鼠睡眠，改善神經功能。HIF-1α是一種轉錄因子，它可以調節與缺氧相關的靶基因的表達，可以使機體適應缺氧環境。研究表明，當急性缺血性腦卒中發生時細胞內 HIF-1α的表達上調，這是由于缺血區的腦組織在缺氧條件下產生代償性的適應反應。這種代償性的反應主要包括：減少缺血區腦組織梗死體積，增加缺血區腦組織側支循環生成，改善缺血區腦組織的缺氧耐受力、調控細胞凋亡通路、降低缺血區腦組織缺血再灌注損傷的發生等。研究發現，調控 HIF-1α轉錄因子的轉錄后，可以影響其他血管生成因子的生成，可以對缺血狀態下的腦組織達到分子治療的目的〔33～35〕。P65是核轉錄因子(NF)-κB蛋白家族5個亞基中的一員，還有P50，P65，P52，RelB 4個亞基。NF-κB是細胞增殖和炎性調節的重要核轉錄因子，它參與多種疾病的發生，并且參與著腫瘤生長因子、細胞因子和細胞黏附因子的基因調控等〔36〕。NF-κB存在于神經膠質細胞、腦血管內皮細胞和神經元中，它可以調節多種炎癥。王海蓮〔37〕的研究表明，腦缺血發生時NF-κB被激活，主要發生在神經元中，而星形膠質細胞、內皮細胞和小膠質細胞中也有少量活化因子表達。HIF-1α和P65是缺氧和炎癥相關指標，本研究結果表明，食欲素-B在急性缺血性腦卒中大鼠發揮的睡眠促進和神經保護作用，可能與調節p65/HIF-1α信號通路相關。

綜上，食欲素-B可能通過調節p65/HIF-1α信號通路促進急性缺血性腦卒中大鼠睡眠，發揮神經保護作用，有望成為治療急性缺血性腦卒中的一種新的神經保護和睡眠促進藥物。