LncRNA XLOC_036125-Lgmn-Beclin-1 軸在 STEMI 中的功能

楊和銀 魏海燕 田云濤 阿依帕夏·艾沙 姜伶 吐爾遜娜依·艾海提

(喀什地區第一人民醫院，新疆 喀什 844000)

心血管疾病是嚴重威脅人類生命健康的疾病之一，隨著患病人群的不斷增多，碘造影劑的使用率也逐年增加，同時，由于使用碘造影劑造成的碘造影劑急性腎衰竭患者量也有一定增加〔1〕。臨床研究發現，患者碘造影劑腎病主要由急性腎損傷發展而來，在患者接受碘造影劑初期及時發現急性腎損傷并采取有效的干預措施，可有效降低患者進展為慢性腎衰竭的概率，大大提高患者的生活質量和預后〔2〕。急性腎衰竭患者腎小管上皮細胞呈不同程度的急性變性、壞死狀態，腎小管擴張，間質水腫〔3〕。前期研究〔3〕結果顯示，造影劑所致急性腎損傷組的自噬相關蛋白Beclin-1表達升高，長鏈非編碼RNA(LncRNA)非編碼基因(XLOC_036125)和與之空間位置相鄰的Lgmn亦表達升高，且 Lgmn與Beclin-1 功能相似，但尚不明確 LncRNA 是否通過Lgmn 調控自噬而影響對比劑所致急性腎損傷(CI-AKI)發生，本研究擬在前期研究基礎上從細胞和基因水平，探究CI-AKI中XLOC_036125與Lgmn、Beclin-1的作用關系。

1 資料與方法

1.1主要試劑 實驗用大鼠腎小管上皮細胞HK-2 購于美國模式菌種收集中心(ATCC)。DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；CCK8試劑盒購于日本同仁公司；RIPA裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡試劑盒購于美國Invitrogen公司；兔抗鼠β-actin抗體、鼠抗人Lgmn抗體、鼠抗人 Beclin-1抗體均購于美國Abcam公司；碘化丙啶(PI)購于中國上海翊圣生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠腎小管細胞 CI-AKI 模型構建 腎小管上皮細胞HK-2 培養于含10%磷酸鹽緩沖液(PBS)的DMEM/F12完全培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞長至80%～90%融合時，用0.25%胰酶消化并接種于培養瓶中繼續培養。選取對數生長期細胞均勻接種，隔天換液，當細胞處于亞融合狀態時換無血清培養基孵育 24 h，添加10 μmol/L順鉑常規孵育 24 h，構建大鼠腎小管細胞 CI-AKI 模型。

1.2.2重組表達質粒構建及質粒提取 LncRNA XLOC_036125及Lgmn穩定過表達重組表達質粒、空載體對照質粒及菌種均委托美國 GeneCopoeia 公司進行構建，LncRNA XLOC_036125-siRNA、Lgmn-siRNA及LncRNA XLOC_036125-siRNA-control、Lgmn-siRNA-control購于廣州銳博生物技術有限公司，置于-80℃保存。

質粒提取參照OMEGA公司產品無內毒素質粒中量提取試劑盒操作說明進行，收集菌落培養后形成的菌液，離心，棄上清，依次加入溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進行重懸，離心，將上清液轉移至新的EP管，加入等體積內毒素吸附(ETR Binding)緩沖液，轉移至純化柱，離心，棄廢液，加入內毒素洗滌(ETR Wash)緩沖液，重新離心后加入純化柱；加入3-羥基丁酸乙酯(EHB)緩沖液，離心后加入純化柱；加入DNA Wash緩沖液，離心清洗；轉移至新EP管，加入無內毒素緩沖液，離心，收集DNA溶液，置于-20℃保存。

1.2.3細胞轉染 細胞轉染采用lipofectamine 2000試劑盒，LncRNA XLOC_036125及Lgmn穩定過表達重組表達質粒、空載體對照質粒及LncRNA XLOC_036125-siRNA、Lgmn-siRNA、LncRNA XLOC_036125-siRNA-control、Lgmn-siRNA-control分別轉染至大鼠腎小管細胞CI-AKI 模型細胞HK-2中,分別為pcDNA3.1-PC-3.1組、pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-PC-3.1組、LncRNA XLOC_036125 siRNA control 組、LncRNA XLOC_036125 siRNA 組、pcDNA3.1-pc-3.1組、pcDNA3.1-Lgmn-pc-3.1 組、Lgmn siRNA NC組、Lgmn siRNA組 。取對數期生長細胞，重選調整濃度，按1.5×105個/孔接種于6孔板中，待細胞生長狀態良好達70%～80%融合時進行轉染。分別配制a液(240 μl無血清無抗生素培養基+10 μl脂質體)、 b液(240 μl無血清無抗生素培養基+4 μg質粒/100 pmol siRNA)、c液(b液+a液)，充分混勻，室溫靜置待用。常規細胞換液后，加入1.5 ml無血清無抗生素培養基，均勻滴加c液后，置于細胞培養箱中培養4～6 h，更換完全培養基。

1.2.4RT-qPCR實驗 各組細胞總RNA提取采用Trizol法，用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。按照mRNA反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄，參照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明進行RT-PCR。反應程序：95℃ 30 s預變性，95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環，收集熒光信號，計算相對定量結果，求出各組細胞中Lgmn、Beclin-1表達水平。

所有試驗重復3次，各標本目的基因和管家基因GAPDH的表達量的有關數據記為Ct值，Ct值的含義是指每個反應管內的熒光信號達到所設定的閾值時經歷的擴增循環數。以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。Lgmn、Beclin-1引物及管家基因GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。

1.2.5Western印跡實驗 待各組細胞融合度達90%以上，棄去培養基，用PBS洗滌3次后，使用含有Halt蛋白抑制劑的裂解液，置冰上裂解30 min，收集細胞置于4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，-80℃保存。使用BCA蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量，根據標準曲線計算蛋白含量。各組以30～60 μg相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳完成后，使用半干轉儀轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后用1%脫脂牛奶稀釋Lgmn、Beclin-1一抗，4℃孵育過夜。次日使用TBST洗脫一抗，再37℃孵育二抗1 h，最后使用化學發光劑進行顯影。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗 使用TargetScan (http：//www.targetscan.org)和microRNA.org-Targets and Expression (http：//www.microrna.org)數據庫預測XLOC_036125和Lgmn結合區域。將Lgmn的XLOC_036125預測靶點序列或突變序列3′-UTR構建于pmirGLO載體。突變序列以正常Lgmn的3′-UTR序列為模板，在與XLOC_036125相結合的預測位點進行點突變。將LncRNA XLOC_036125穩定過表達重組表達質粒、空載體對照質粒及LncRNA XLOC_036125-siRNA、Lgmn-siRNA分別與所構建的載體同時利用DharmFECT Duo試劑進行轉染待測細胞，分別為LncRNA XLOC_036125 siRNA control 組、LncRNA XLOC_036125 siRNA 組、Lgmn siRNA NC 組、Lgmn siRNA組，置于培養箱中培養48 h，采用Dual-Glo Luciferase分析系統分析實驗結果。具體按雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書操作。

1.2.7GST-pull down ChIP 實驗 將編碼蛋白A與GST 的重組質粒化轉BL21菌株，挑取單個克隆到含有5 ml LB(+100 μg/ml Amp)的10 ml試管里，37℃培養過夜。將培養菌液轉移到含有500 ml LB(+100 μg/ml Amp)的1 L錐形瓶中，37℃，225 r/min培養至OD600 nm 1.0～1.5，加入適當濃度的IPTG，在適當溫度下培養適當時間，3 000 r/min，10 min，4℃離心收集細菌，去盡上清。每500 ml培養液加入10～20 ml細菌裂解液(PBS+1%Triton-100+PMSF)，吹打混勻。冰上超聲破碎，開2 s，停9 s，總40～60 min。至裂解液充分清涼。11 000 r/min，15 min，4℃離心分離上清，-80℃保存備用。將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標簽蛋白的真核表達載體上，細胞轉染48 h后，取適量融合蛋白GST-A冰上凍融。取50～70 μl GST-Beads到EP管中，用800 μl PBS+1%Triton-100潤洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析柜旋轉結合1 h。PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。同時，裂解真核融合蛋白B，吹打收集至1.5 ml EP管，超聲破碎。13 000 r/min，15 min，4℃離心取上清。4℃旋轉結合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。40 μl 5×上樣緩沖液溶解beads上的蛋白，煮沸3 min，高速離心，Run-SDS PAGE做Western印跡檢測進行驗證。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行兩獨立樣本t檢驗、近似t檢驗。

2 結 果

2.1LncRNA XLOC_036125 對Lgmn基因及蛋白表達水平的影響 RT-PCR實驗結果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組(1.02±0.02)比較，pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3.1組質粒組HK-2細胞中，Lgmn mRNA 表達水平明顯增高(5.74±0.21，P<0.05)，與LncRNA XLOC_036125 siRNA control組(1.09±0.05)比較，LncRNA XLOC_036125 siRNA.1組HK-2細胞中，Lgmn mRNA表達水平則明顯降低(0.41±0.02，P<0.05)。Western印跡實驗結果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組比較，pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3組HK-2細胞中，Lgmn 蛋白表達水平明顯較高(1.02±0.02 vs 2.83±0.17,P<0.05)，與LncRNA XLOC_036125 siRNA control組比較，LncRNA XLOC_036125 siRNA組HK-2細胞中，Lgmn 蛋白表達水平明顯較低(1.06±0.03 vs 0.35±0.03，P<0.05)，見圖1。

1～4：pcDNA3.1-pc-3.1組、pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3.1組、LncRNA XLOC_036125 siRNA control組、LncRNA XLOC_036125 siRNA組

2.2LncRNA XLOC_036125 和 Lgmn 靶向作用分析 LncRNA XLOC_036125與 Lgmn 3′UTR存在結合位點(圖2)。轉染野生型Lgmn熒光報告載體的HK-2細胞中，LncRNA XLOC_036125 siRNA組細胞熒光活性明顯低于LncRNA XLOC_036125 siRNA control組細胞(0.32±0.04 vs 1.00±0.00,P<0.05)。LncRNA XLOC_036125與 Lgmn存在直接靶向作用關系。

圖2 LncRNA XLOC_036125 和 Lgmn 靶向作用分析

2.3Lgmn 蛋白與 Beclin-1 蛋白靶向作用 GST-pull down ChIP 實驗結果顯示，在HK-2細胞中，與陽性對照組比較，Lgmn 蛋白與 Beclin-1 蛋白存在直接結合的作用關系。見圖3。

圖3 Lgmn 蛋白與 Beclin-1 蛋白靶向作用

2.4Lgmn 對 Beclin-1 基因及蛋白表達水平的影響 RT-PCR實驗結果及Western印跡實驗結果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組比較，pcDNA3.1-Lgmn-pc-3.1組HK-2細胞中，Beclin-1 mRNA 及蛋白表達水平均明顯增高(P<0.05)，與Lgmn siRNA NC組比較，Lgmn siRNA組HK-2細胞中，Beclin-1 mRNA 及蛋白表達水平則均明顯降低(P<0.05)。見表1、圖4。

1～4：pcDNA3.1-pc-3.1組、pcDNA3.1-Lgmn-pc-3.1組、Lgmn siRNA NC組、Lgmn siRNA組

表1 Lgmn 對 Beclin-1 基因表達水平的影響

2.5LncRNA XLOC_036125 對 Beclin-1 基因及蛋白表達水平的影響 RT-PCR實驗結果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組比較，pcDNA3.1-pc-Lgmn-pc-3.1組HK-2細胞中，Beclin-1 mRNA 表達水平明顯增高(1.04±0.03 vs 7.73±0.31,P<0.05)；與Lgmn siRNA NC組比較，Lgmn siRNA組HK-2細胞中，Beclin-1 mRNA 表達水平則明顯降低(1.10±0.05 vs 0.32±0.03,P<0.05)。Western印跡實驗結果顯示，與pcDNA3.1-pc-3.1組比較，pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3.1組HK-2細胞中，Beclin-1 蛋白表達水平也明顯較高(1.07±0.02 vs 3.42±0.20,P<0.05)；與LncRNA XLOC_036125 siRNA control組比較，LncRNA XLOC_036125 siRNA組HK-2細胞中，Beclin-1 蛋白表達水平也明顯較低(1.12±0.05 vs 0.52±0.07，P<0.05)。見圖5。

1～4：pcDNA3.1-PC-3.1組、pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-PC-3.1組、LncRNA XLOC_036125 siRNA control組、LncRNA XLOC_036125 siRNA組

3 討 論

碘造影劑腎病指碘造影劑在血管內給藥48～72 h內出現的無其他原因的不能解釋的腎功能損害性疾病，以血清肌酐較基礎水平升高25%或絕對值升高≥0.5 mg/dl為診斷標準，其中以急性腎損傷在臨床中最為常見〔4〕。心血管疾病介入治療是目前臨床上治療冠心病的主要技術，盡管碘造影劑工藝發展迅速，但隨著接受碘造影劑影像學檢查和介入治療患者數的不斷增加，碘造影劑的應用范圍越來越廣，其帶來的碘造影劑急性腎損傷患者總量也逐漸呈現出增多的趨勢，其臨床干預與治療也越來越受到關注。有研究比較不同手術引起碘造影劑急性腎損傷患者發生率發現，心臟造影術后患者并發碘造影劑急性腎損傷的發生率明顯高于非心臟造影術后患者，合并基礎腎臟疾病及腎功能不全患者的發生率則更高〔5，6〕。

有研究發現，碘造影劑急性腎損傷與炎癥因子的產生和炎癥反應密切相關，炎癥是導致碘造影劑急性腎損傷的主要原因之一〔7，8〕。一方面碘造影劑可引起細胞內外液滲透壓不同，導致細胞內液向細胞外轉移，干擾腎皮質氧化，引起腎小管上皮細胞間質水腫，破壞腎小管上皮細胞完整性，導致細胞骨架發生破壞，最終引起細胞死亡〔9〕，另一方面，碘造影劑還可在一定程度上引起短時間的腎血管擴張及長時間的腎血管收縮，介導舒血管物質分泌減少，進而引起腎髓質發生缺血缺氧，導致腎小管細胞出現損傷，甚至發生壞死〔10，11〕。隨著對碘造影劑急性腎損傷發生機制研究的不斷深入，近年來不斷有研究提升，在碘造影劑急性腎損傷缺血再灌注誘導期間及順鉑等腎毒性藥物干預過程中，腎小管近端管狀細胞均可誘導自噬的發生〔12〕。自噬誘導是一個低氧應激早期反應，主要發生于管狀細胞凋亡之前，在體內外腎缺血-再灌注模型中均可見大鼠近端小管細胞在缺氧條件下誘導產生自噬〔13，14〕。Beclin-1 是酵母自噬基因 6(Ap96/Vps30)在哺乳動物中的同源物，它是自噬重要的正調節因子，其主要通過控制自噬體的形成，調節其他的自噬蛋白定位到前自噬體膜上，控制自噬體的形成，從而調節自噬活性，在自噬起始階段起重要作用〔15，16〕。本研究結果提示LncRNAs XLOC_036125 調控 Lgmn 與 Beclin-1表達，在一定程度上參與自噬過程的調節，在造影劑急性腎損傷中存在LncRNA XLOC_036125-Lgmn-Beclin-1軸作用。

綜上，在造影劑急性腎損傷中，LncRNA XLOC_036125可通過靶向結合Lgmn調控Lgmn及下游Beclin-1表達水平，參與HK-2細胞自噬調控作用。由于急性腎損傷中腎小管細胞自噬發生在凋亡之前，自噬主要是細胞應激和凋亡的早期反應，但此過程中自噬調節的具體作用仍存在爭議，LncRNA XLOC_036125-Lgmn-Beclin-1軸參與的自噬調節信號通路尚未完全明了，將在后續研究中深入探索。