miR-369-3p通過靶向調控DYRK1A對乳腺癌MDA-MB-231細胞放療敏感性的影響

萬江花 尤曉光 蘇蘭芳 劉旭東 林娟 鄧丹瓊

(海南醫學院第一附屬醫院放射科，海南 海口 570102)

乳腺癌屬女性常見惡性腫瘤，發病率高，是導致女性癌癥患者死亡的主要原因，其中三陰性乳腺癌占乳腺癌的20%左右，相較于其他類型預后更差、轉移率更高，目前治療以化療或輔助化療為主〔1，2〕。化療后患者化療敏感性降低，可能出現預后較差、復發等嚴重現象，化療后中位生存時間約1年〔3〕，因此尋找新輔助化療方法從而提高化療敏感性對于疾病治療意義重大。微小RNA(miRNA)在改善化療敏感性中逐漸被發現，miRNA通過介導內源性或外源性凋亡通路蛋白從而影響化療敏感性〔4〕，其中miR-369-3p在大腸癌中靶向雙特異性酪氨酸磷酸化調節激酶(DYRK)1A可調節放療敏感性，而DYRK1A影響細胞凋亡〔5〕。但乳腺癌中并未發現相關研究報道。本研究以三陰性乳腺癌MDA-MB-231為研究對象，檢測miR-369-3p對細胞放療敏感性的影響，為輔助乳腺癌化療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞 人乳腺癌MDA-MB-231購自中國科學院上海細胞庫，目錄號：TCHu227。

1.2主要試劑與儀器 L-15培養基、胎牛血清(FBS)購于美國GIBIO公司，貨號分別為：41300039、10099-141；逆轉錄試劑盒(美國Ambion公司，貨號：AM1552)；熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，貨號：ARR041A)；CCK-8試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司，貨號分別為：C0039、C1062M)；一抗DYRK1A(兔抗)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3(兔抗)、caspase9(兔抗)、內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH，兔抗)、羊抗人二抗(美國Abcam公司，貨號分別為：ab65220、ab181602、ab32539、ab32539、ab97051)；引物由上海生工生物公司合成；miR-369-3p mimic、miR-369-3p mimic NC、miR-369-3p inhibitor、miR-369-3p inhibitor NC、Lipofectamine 2000均購自上海吉瑪公司。

CO2培養箱(德國WIGGENS公司，型號：WCI-180)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國ABI公司，型號：7500)；Varian 2100直線加速器(美國Ohio公司，型號：Clinac-2100C/D)；酶標儀(美國BIO-RAD公司，型號：550)；流式細胞儀(美國Thermo Fisher公司，型號：Attune NxT)；蛋白凝膠成像儀(上海天能科技有限公司，型號：5200)。

1.3細胞培養和處理 細胞培養：L-15培養基中加10%FBS制成L-15完全培養基，4℃冰箱保存待用。MDA-MB-231，75%酒精消毒培養瓶后立即置于37℃ CO2培養箱中培養，觀察細胞形態，第2天分離出部分細胞置于L-15完全培養基中培養待用，培養瓶中細胞繼續培養保種。實驗細胞傳2～3代后收集對數生長期細胞進行下一步研究。

細胞處理：生長良好的MDA-MB-231稀釋成1×105個/ml，24孔板中添加500 μl稀釋液，待細胞密度達60%時，吸出舊培養液進行轉染。1 μl Lipofectamine 2000與50 μl L-15培養基混勻，室溫孵育5 min；2 μl(miR-369-3p mimic、miR-369-3p mimic NC、miR-369-3p inhibitor、miR-369-3p inhibitor NC)分別與50 μl L-15培養基混勻，室溫孵育5 min。上述兩混合液1∶1混勻后，室溫放置15 min。miR-369-3p mimic組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor組、miR-369-3p inhibitor NC組分別添加500 μl對應混合液，對照組只添加MDA-MB-231細胞換新的L-15培養基對照處理。輕輕搖板混勻，37℃ CO2培養箱中培養6 h，換成L-15完全培養基繼續培養。

1.4qRT-PCR檢測細胞中miR-369-3p水平1.4.1細胞培養至細胞密度90%左右時，檢測細胞中miR-369-3p的表達水平。每個孔中加1 ml Trizol裂解細胞，部分并提總RNA，采用逆轉錄試劑盒將總RNA合成cDNA，qRT-PCR儀對miR-369-3p、內參U6擴增。引物序列 miR-369-3p正義鏈：5′-TGGGAATAATACATGGTTGATC-3′、反義鏈：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6正義鏈：5′-TGCTGGGGCTTTCCGGCAGCGC-3′、反義鏈：5′-CCCAGTGAGGTCCGGAGGT-3′。上樣體系20 μl：2×熒光定量PCR試劑(10 μl)、cDNA(1 μl)，正義鏈/反義鏈(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O(8 μl)。反應條件：95℃、5 min；95℃、60 s，62℃、45 s，45個循環。2-ΔΔCt法計算細胞中miR-369-3p水平。

1.4.2CCK-8法檢測細胞增殖能力 細胞接種至96孔板(5.0×104個/孔)，L-15完全培養基為空白對照，每孔100 μl，6個重復。Varian 2100直線加速器6 MV X線為放射源(劑量率400 cGy/min、照射野100 mm×100 mm)照射MDA-MB-231，劑量用計算機治療系統進行調整，包括2、4、6、8 Gy 4個計量點繪制劑量存活曲線，每個計量點照射完成時間1～2 min。照射完成后置CO2培養箱中繼續培養48 h，加入CCK-8試劑繼續培養2 h，酶標儀檢測450 nm下各孔細胞光密度(OD)，OD450=實驗孔OD450-空白對照孔OD450。存活率=〔OD450-0 Gy-OD450-(2、4、6、8)Gy〕/OD450-0 Gy×100%。

1.4.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 0、6 Gy照射檢測細胞凋亡情況，1.4.1各組細胞每孔2×105個細胞接種于6孔板中，細胞過夜后貼壁，按1.4.2操作6 Gy照射，繼續培養48 h，胰酶消化處理各組細胞，各組細胞濃度調整為1×106個，加入Annexin V-FITC和PI試劑，混勻避光15 min，1 h內流式細胞儀上機檢測。

1.4.4Western印跡檢測細胞中DYRK1A、caspase3、caspase9蛋白表達情況 0、6 Gy照射檢測細胞中DYRK1A蛋白的表達情況，按1.4.2操作6 Gy照射細胞，裂解細胞，部分3 000 r/min 4℃離心20 min，取上清檢測DYRK1A蛋白水平。BCA試劑盒測定每個樣本中蛋白總濃度，補ddH2O使每孔總蛋白濃度相同。每孔上樣30 ng，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質，280 mA轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應加入一抗DYRK1A(1∶1 000)、caspase3(1∶2 000)、caspase9(1∶5 000)、GADPH(1∶5 000)，4℃孵育過夜；對應加入二抗，室溫孵育1 h。二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.5統計學分析 采用SPSS25.0進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。Targetscan預測DYRK1A基因與miR-369-3p結合位點。

2 結 果

2.1各組細胞中miR-369-3p水平比較 分別與對照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，miR-369-3p mimic組細胞中miR-369-3p水平顯著升高(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組細胞中miR-369-3p水平顯著降低(P<0.05)。與miR-369-3p mimic組相比，miR-369-3p inhibitor組細胞中miR-369-3p水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-369-3p水平、細胞凋亡率及DYRK1A蛋白表達比較

2.2miR-369-3p對MDA-MB-231細胞放療敏感性的影響 分別與對照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，0、2、4、6、8 Gy中miR-369-3p mimic組存活率均顯著降低(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組存活率均顯著升高(P<0.05)。隨著X線照射劑量升高，對照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p mimic組、miR-369-3p inhibitor組細胞存活率顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 miR-369-3p對MDA-MB-231不同劑量X線照射的存活率

2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡結果 在0、6 Gy中，分別與對照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，miR-369-3p mimic組凋亡率顯著升高(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組凋亡率顯著降低(P<0.05)。與0 Gy相比，6 Gy照射下對照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p mimic組、miR-369-3p inhibitor組均凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

1～5：對照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p mimic組、miR-369-3p inhibitor組；圖2、3同

2.4各細胞中DYRK1A蛋白表達的比較 在0、6 Gy中，分別與對照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，miR-369-3p mimic組DYRK1A蛋白水平顯著降低(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組DYRK1A蛋白水平顯著升高(P<0.05)。與0 Gy相比，6 Gy照射下對照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p mimic組、miR-369-3p inhibitor組DYRK1A蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測細胞中DYRK1A蛋白表達情況

2.5各組細胞中caspase3、caspase9蛋白表達比較 在0、6 Gy中，分別與對照組、miR-369-3p mimicNC組、miR-369-3p inhibitor NC組相比，miR-369-3p mimic組caspase3、caspase9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor組caspase3、caspase9蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與0 Gy相比，6 Gy照射下對照組、miR-369-3p mimic NC組、miR-369-3p inhibitor NC組、miR-369-3p inhibitor組caspase3、caspase9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，miR-369-3p mimic組caspase9蛋白水平升高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 Western印跡檢測細胞中caspase3、caspase9蛋白表達

表3 各組caspase3、caspase9蛋白表達

2.6miR-369-3p靶向DYRK1A基因 Targetscan(http：//www.targetscan.org/vert_72/)預測結果顯示，DYRK1A基因與miR-369-3p存在結合位點，見圖4。

圖4 DYRK1A基因與miR-369-3p結合位點預測〔4〕

3 討 論

乳腺癌目前治療方法以化療為主，仍有30%～40%患者出現化療抗性〔6〕。提高患者化療敏感性對于改善患者生存質量意義重大。其中細胞凋亡在化療敏感性中發揮重要作用，癌細胞凋亡指數增加，化療敏感性明顯增強，可以通過增強細胞凋亡改善化療敏感性，從而治療腫瘤〔7〕。

miRNA在癌細胞凋亡〔8〕和放射抵抗〔9〕中起重要作用。miR-205-3p在結直腸癌細胞中低劑量電離輻射潛在的放射增敏劑，增強化療敏感性可增強對毒性細胞的殺傷作用，降低對正常細胞的毒性作用，減少正常細胞DNA的損傷，從而達到治療疾病目的〔10〕；放射抗性神經膠質瘤組織miR-320表達下調，而叉頭框轉錄因子(Fox)M1表達上調，miR-320過表達直接靶向FoxM1下調沉默信息調節因子(sirtuin)1型蛋白表達，促進細胞凋亡，增強神經膠質瘤的放射敏感性〔11〕。miR-369-3p是miR-369的成熟剪輯體之一，是一種功能多樣的miRNA，可通過自噬調節參與子宮內膜樣腺癌〔12〕；亦是一種與放療敏感性有關的基因〔13〕。miR-369-3p在順鉑耐藥的非小細胞肺癌組織和細胞中表達上調，下調miR-369-3p可提高肺癌細胞對順鉑的耐藥性〔14〕；可調控miRNA的表達來影響相關信號通路可調節乳腺癌的化療敏感性〔15〕。本研究結果提示X線照射可抑制乳腺癌細胞存活，隨著X線照射劑量強度的增加，抑制作用加強，X線照射對治療疾病具有一定療效，X線照射水平越高，治療效果越明顯。但隨著X線照射的增加，對正常細胞殺傷作用加強，同時機體出現放射抵抗〔16〕，發現在較低劑量X線照射對癌細胞有較強殺傷作用是接下來探索重點。升高miR-369-3p水平存活率降低，降低miR-369-3p水平存活率升高；miR-369-3p可在一定程度上影響MDA-MB-231存活率，升高miR-369-3p可抑制細胞增殖提高化療敏感性，緩解疾病。相同劑量X線照射，升高miR-369-3p水平可提高MDA-MB-231細胞化療敏感性，從而增強對癌細胞的殺傷作用，同時降低對正常細胞的損害達到治療疾病目的。

miRNA的3′UTR區結合靶基因調控基因發揮增殖〔17〕、侵襲〔18〕、凋亡〔19〕、化療敏感性〔20〕等作用。其中DYRK1A作為一種脯氨酸/精氨酸指導下的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化蛋白激酶，可以介導哺乳動物Fox1的表達，而Fox1可以調控細胞增殖、分化和凋亡，從而增加細胞化療敏感性〔21〕。另一方面DYRK1A可以直接影響細胞凋亡，例如在神經系統中高表達可促進DNA損傷介導細胞凋亡等引起神經元病變、死亡等病理變化，起致病作用〔22〕；在非小細胞肺癌中表達上調，抑制DYRK1A水平可有效治療表皮生長因子受體(EGFR)敏感性突變和耐藥基因(T790 M)耐藥性突變的非小細胞肺癌患者的敏感性從而實現抗癌作用〔23〕。DYRK1A抑制劑可抑制MDA-MB-231增殖從而緩解乳腺癌〔24〕。miR-369-3p與DYRK1A靶向結合，升高miR-369-3p水平降低DYRK1A水平可能緩解乳腺癌〔5〕。本研究提示化療后可降低DYRK1A蛋白水平，對細胞的殺傷作用加強；低表達DYRK1A蛋白可能促進Fox1的表達，調控DNA的損傷作用加強，促進細胞凋亡從而增加細胞化療敏感性，從而達到治療疾病目的。

caspase3、caspase9作為促凋亡蛋白，在MDA-MB-231中促進凋亡蛋白caspase3、caspase9水平可抑制細胞增殖、降低細胞毒性從而實現抗癌作用〔25,26〕。細胞凋亡在化療敏感性中發揮重要作用，癌細胞凋亡率可以判定腫瘤細胞對化療的敏感性〔27〕，在宮頸癌耐藥細胞中促進caspase3、caspase9水平可提高細胞的化療敏感性〔28〕。本研究提示相同劑量X線照射，提高miR-369-3p水平可直接作用DYRK1A，抑制DYRK1A蛋白表達從而加強促凋亡蛋白表達、加速癌細胞DNA損傷，從而加速細胞凋亡，提高化療敏感性。

綜上所述，miR-369-3p通過靶向調控DYRK1A可改變乳腺癌MDA-MB-231細胞放療敏感性，可能是通過凋亡途徑實現的。上調miR-369-3p表達可靶向抑制DYRK1A表達，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖，提高細胞對X線敏感性。本研究只初步探討miR-369-3p變化對凋亡蛋白水平的影響，并沒有進一步驗證DYRK1A與促凋亡蛋白的關系，接下來研究中將探討二者之間直接關系。