右美托咪定減輕紅藻氨酸引起的神經(jīng)毒性作用

孟明華 馬賓 趙坤 王紀(jì)明 任偉華

(1濟(jì)南市第二婦幼保健院，山東 濟(jì)南 271199；濟(jì)南市人民醫(yī)院 2麻醉科；3藥劑科)

癲癇是最常見的大腦疾病之一，全世界約有5 000萬(wàn)人受其影響〔1,2〕。雖然癲癇發(fā)作的確切原因尚不清楚，但大量證據(jù)表明，過度釋放谷氨酸參與了癲癇發(fā)作的發(fā)病機(jī)制。如腦內(nèi)應(yīng)用谷氨酸受體激動(dòng)劑已被證明可誘發(fā)動(dòng)物癲癇。右美托咪定具有鎮(zhèn)靜，鎮(zhèn)痛麻醉作用。右美托咪定的神經(jīng)保護(hù)作用已在各種腦損傷模型中被報(bào)道〔3〕。然而，右美托咪定的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚未完全清楚。紅藻氨酸(KA)是一種類似于興奮毒性谷氨酸的物質(zhì)，它在嚙齒動(dòng)物體內(nèi)的全身性給藥會(huì)導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作和隨后大腦中選擇性神經(jīng)元群的退化，特別是在海馬的CA3區(qū)域。因此，KA常被用于研究興奮性毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)變性機(jī)制，以提出具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用的藥理學(xué)藥物〔4〕。本研究以KA誘導(dǎo)的癲癇模型為基礎(chǔ)，探討右美托咪定對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 動(dòng)物：成年雄性SD大鼠，體重200～220 g，所有大鼠飼養(yǎng)房間溫度為(23±2)℃，濕度為50%～60%，并保持12 h的晝夜循環(huán)光照。藥品與試劑：右美托咪定(批號(hào)：026M4732V，美國(guó)Sigma公司)；KA(美國(guó)Abcam公司)；Tunnel染色試劑盒(中國(guó)碧云天公司)；尼氏染色試劑盒(中國(guó)索萊寶公司)；兔多克隆抗體Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12(美國(guó)Abcam公司)。儀器：FM0530化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó) Protein Simple公司)；DM 750 光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Thermo VarioskanTMLUX多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)的Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2構(gòu)建KA誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的模型及給藥 大鼠隨機(jī)分對(duì)照組、KA組、K+D組各15只。對(duì)照組：大鼠腹腔注射0.9% NaCl；KA組：大鼠腹腔注射KA(15 mg/kg)構(gòu)建模型；K+D組：在注射KA前30 min腹腔注射右美托咪定(5 μg/kg)，1次/d，給藥3 d。

1.3癲癇發(fā)作評(píng)分 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在注射KA后4 h內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確定癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度。根據(jù)Racine量表對(duì)大鼠KA模型進(jìn)行癲癇評(píng)分。該量表評(píng)分為0～5分，0分為正常現(xiàn)象，1分為面部和耳部抽搐，2分為單側(cè)前肢抽搐，3分為雙側(cè)前肢完全抽搐，4分為強(qiáng)制性陣攣發(fā)作，5分為廣泛的強(qiáng)制性陣攣發(fā)作。模型鼠出現(xiàn)4級(jí)及以上評(píng)分的視為達(dá)到癲癇模型的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4尼氏染色 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在第3天后用1%戊巴比妥鈉麻醉，待麻醉成功后，逐層皮膚解剖大鼠暴露心臟后，先用0.9%生理鹽水灌注，再用4%多聚甲醛灌注，灌注成功后，斷頭解剖海馬組織，放于多聚甲醛固定48 h。組織經(jīng)過沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸透制作石蠟切片。選出完整的海馬組織切片，按尼氏染色試劑盒進(jìn)行染色，然后脫水、透明，封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5TUNEL染色 為了觀察凋亡細(xì)胞，根據(jù)TUNNEL染色試劑盒對(duì)海馬組織切片進(jìn)行染色。用新鮮配制的透性處理液(含0.1% Triton X-100的0.1%檸檬酸鈉的緩沖液)處理海馬組織切片，然后在冷磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌，在37℃的潮濕環(huán)境中與TUNEL反應(yīng)液避光孵育60 min，用PBS洗滌3次，加入封閉液于室溫封閉30 min，PBS洗滌，加入轉(zhuǎn)化劑37℃孵育10 min，洗滌，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物，室溫15 min，蘇木素復(fù)染50 s，進(jìn)行酒精脫水，二甲苯透明，封片，最后使用熒光顯微鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。

1.6Western印跡 將各組大鼠斷頭處死，解剖出腦組織，在冰上立即分離海馬組織，通過研磨勻漿提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度〔二喹啉甲酸(BCA)定量〕。然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，先清洗玻璃板，灌膠和上樣，然后電泳至溴酚藍(lán)跑出即可終止電泳，按照濾紙-膠-膜-濾紙夾三明治的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，若膠上的條帶均轉(zhuǎn)移到膜上即成功，進(jìn)行封閉，將膜取出在5%脫脂奶粉的皿中常溫慢搖60 min，然后Caspase-3一抗1∶1 000，Caspase-9一抗1∶1 000，Caspase-12一抗1∶1 000在4℃冰箱孵育過夜，用TBST清洗3次，然后二抗在室溫下孵育1～2 h，用TBST在搖床上清洗兩次，每次10 min，再用TBST洗10 min，最后用BIO-RAD公司凝膠成像系統(tǒng)顯色成像進(jìn)行定量分析，分析蛋白表達(dá)情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠癲癇發(fā)作評(píng)分結(jié)果 在給予KA后30 min內(nèi)，動(dòng)物均表現(xiàn)出持續(xù)3～4 h的癲癇行為。與對(duì)照組〔(0.00±0.00)分〕比較，KA組癲癇發(fā)作評(píng)分〔(4.51±0.42)分〕明顯升高；與KA組相比，K+D組評(píng)分〔(2.44±0.51)分〕降低(P<0.05)。

2.2尼氏染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元 與對(duì)照組相比，KA組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目顯著減少，細(xì)胞排列疏松。K+D組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目較KA組增多，且細(xì)胞排列較密集，有顯著改善作用，見圖1。

圖1 尼氏染色觀察各組海馬神經(jīng)元的病理學(xué)形態(tài)(×200，框中×400)

2.3TUNEL染色測(cè)定神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 對(duì)照組存在少量凋亡細(xì)胞；與對(duì)照組相比，KA組顯著增加了海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目；與KA組比較，K+D組海馬組織CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目顯著減少，因此右美托咪定具有抑制由KA引起的細(xì)胞凋亡的作用，見圖2。

圖2 Tunnel染色觀察各組海馬神經(jīng)元凋亡情況(×200)

2.4各組海馬組織Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12的蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，KA組海馬神經(jīng)元Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達(dá)顯著升高，而K+D組海馬神經(jīng)元Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12表達(dá)較KA組明顯降低(P<0.05)，見表1，圖3。

表1 各組海馬組織Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達(dá)比較

圖3 Western印跡檢測(cè)海馬組織Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12蛋白表達(dá)

3 討 論

眾所周知，在阿爾茨海默病、帕金森病、癲癇、亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病中，興奮性應(yīng)激是急性神經(jīng)元損傷的促進(jìn)因素〔5，6〕。以前的報(bào)告已經(jīng)證明，在嚙齒動(dòng)物中使用類似于谷氨酸興奮毒素的KA會(huì)導(dǎo)致癲癇發(fā)作〔7〕。本研究表明右美托咪定對(duì)KA引起的癲癇發(fā)作有體內(nèi)抗驚厥作用。海馬體的CA3區(qū)是kainate受體最豐富的區(qū)域，它們的激活導(dǎo)致海馬體和其他大腦結(jié)構(gòu)中選擇性種群的神經(jīng)元缺失。此外，大量研究表明，在這種興奮毒性模型中觀察到的神經(jīng)元損失至少部分涉及凋亡〔8，9〕。本研究結(jié)果表明，KA注射可導(dǎo)致海馬CA3區(qū)選擇性神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。右美托咪定預(yù)處理減少了這種誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，提示右美托咪定除了是一種抗驚厥劑外，還是一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑。

研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路可誘導(dǎo)興奮性毒性模型的凋亡〔10〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)存的場(chǎng)所之一，興奮性毒性誘導(dǎo)的鈣在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中起重要作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔11〕。凋亡信號(hào)傳導(dǎo)包括3個(gè)階段：信號(hào)誘導(dǎo)、Caspase級(jí)聯(lián)激活和執(zhí)行階段。其中Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12在細(xì)胞凋亡中具有重要作用，Caspase-3是多種Caspase亞型中的主要Caspase，它能導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，是凋亡細(xì)胞死亡過程中主要的Caspase執(zhí)行者，其特異性地裂解許多關(guān)鍵的細(xì)胞蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的解體〔12〕，Caspase-9是凋亡小體內(nèi)固有凋亡的關(guān)鍵啟動(dòng)子，在多種細(xì)胞死亡誘導(dǎo)因子的作用下被激活，Caspase-12特異性定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞質(zhì)部位(外膜)，被認(rèn)為在應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡〔13〕中發(fā)揮作用。細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑包括線粒體外膜的通透化、死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物的形成、DNA片段化和Caspase-3的激活。本研究結(jié)果表明，KA誘導(dǎo)的Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12激活的減少與右美托咪定發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制有關(guān)。

綜上，右美托咪定對(duì)KA構(gòu)建的癲癇模型大鼠海馬凋亡具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，而這種神經(jīng)保護(hù)作用可能是由于通過抑制神經(jīng)元凋亡起作用，減輕了由KA引起的神經(jīng)毒性作用。而對(duì)于具體抑制凋亡的機(jī)制還尚不清楚，未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步研究。