MicroRNA-155靶向SOCS1基因對冠心病內皮細胞炎癥損傷的影響

徐濤 王超

(1河北北方學院附屬第一醫院心血管內科，河北 張家石 075000；2河北省人民醫院代謝病重點實驗室)

據現代研究表明，冠狀動脈粥樣硬化心臟病(CHD) 是由動脈內膜脂類物質的堆積引起的動脈粥樣病變〔1～3〕。近幾年來，CHD發病率逐年上升，發病年齡逐漸呈年輕化〔4〕。研究顯示，炎癥反應通過破壞動脈粥樣硬化斑塊的穩定性導致斑塊破裂，進而導致CHD〔5～7〕。MicroRNA在CHD發病機制中起關鍵作用。研究〔8～10〕顯示許多MicroRNA分子在調控糖脂代謝、促進血管炎癥反應及平滑肌細胞增殖方面產生作用。MicroRNA-155作為一個典型多功能的MicroRNA，位于21號染色體上BIC基因的第三個外顯子，此基因可以調控免疫細胞和造血細胞的發育分化，從而在炎癥和抗體合成等免疫反應中發揮著重要作用〔11〕。研究發現，MicroRNA-155能夠通過靶向調節細胞因子信號轉導抑制因子(SOCS)1表達，進而產生免疫調節作用，此作用在巨噬細胞炎癥反應中觀察得到〔12,13〕。本實驗通過研究MicroRNA-155靶向SOCS1基因對CHD內皮細胞炎癥損傷的影響，探索CHD的治療方法。

1 材料和方法

1.1動物模型 選取純種SD雄性大鼠24只，鼠齡3～4個月，體重(240±60)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號:SCXKC(湘)200900004，動物合格證編號:HNASLKJ20100330。飼養在塑料籠內，每籠6只。室內溫度25℃，濕度65%，大鼠自行隨意攝取飼料和自來水。飼養1 w適應環境，以降低應激反應。動物實驗嚴格遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2主要試劑 培養基DMEM購自美國Gibco公司，TRIzol組織提取試劑盒、轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，質粒提取試劑盒購自美國Promega公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天，MicroRNA-155 mimics、陰性對照(miR-NC)購自吉瑪公司，反轉錄試劑盒A5000購自Promega公司，兔抗SOCS1、GAPDH一抗購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗購自碧云天公司，AerosetTM生物化學分析儀購自美國亞培公司，Bio-rad Gel Dol EZ成像儀購自美國Bio-rad公司。

1.3病理模型的構建及分組 制備冠狀動脈粥樣硬化(AS)模型，分為正常組和AS組各12只。正常組喂養基礎飼料，AS組喂養高脂飼料，并添加維生素D3粉劑。實驗開始時，在大鼠右下肢肌肉注射維生素D3粉針劑，每隔30 d重復1次。

1.4血脂和血鈣的檢測 實驗3個月后，采集各組大鼠動脈血，檢測血脂和血鈣。檢測正常組和AS組血漿中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和Ca2+的濃度。

1.5冠狀動脈內皮細胞的分離、培養及鑒定 將動脈組織剪碎，先后加入Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶消化后，加入DMEM完全培養基培養于37℃、5%CO2細胞培養箱中，待細胞生長至80%融合，加入胰酶消化細胞，調整到適宜的密度后傳代并培養。細胞使用PBS洗滌后，先后加入一抗和二抗，37℃孵育30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。37℃培養24 h后，使用倒置顯微鏡觀察細胞形態，

1.6細胞轉染 在大鼠冠狀動脈內皮細胞中，加入同型半胱氨酸，共培養24 h，制造CHD模型。設計促MicroRNA-155表達的靶序列，合成DNA Oligo，制成雙鏈DNA。與雙酶切后的pGCSIL-GFP報告基因載體連接并轉化，篩選陽性克隆細胞，提取質粒進行酶切測序。合成MicroRNA-155 mimics、MicroRNA-155 inhibitor及siSOCS1，并用脂質體包裝；將脂質體加入細胞培養基中共培養24 h，構成空白對照組、陰性對照組、MicroRNA-155過表達(MicroRNA-155 mimics)組、MicroRNA-155抑制(MicroRNA-155 inhibitor)組、SOCS1基因失活(MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1)組。

1.7雙熒光素酶實驗檢測MicroRNA-155與SOCS1的靶向關系 通過軟件http://www．microrna.org 預測MicroRNA-155與SOCS1的靶向關系。合成含MicroRNA-155結合位點的SOCS1 3′UTR啟動子區序列，構建野生型質粒SOCS1 3′UTR-WT和突變型質粒SOCS1 3′UTR-MUT。使用Lipofectamine 2000試劑，將SOCS1-3′ UTR-WT和MicroRNA-155 mimic質粒共轉染于293T細胞；同時設野生型質粒轉染陰性對照組(SOCS1-3′UTR-WT+NC)、突變型質粒轉染陰性對照組(SOCS1-3′UTR MUT+NC)和突變型質粒轉染MicroRNA-155 mimic質粒組(SOCS1-3′UTR-MUT+MicroRNA-155 mimic)。用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.8定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測檢測MicroRNA-155、SOCS1 mRNA的表達水平 TRIzol試劑盒提取組織和細胞總RNA進行，酶標儀檢測RNA濃度。采用反轉錄試劑盒A5000合成cDNA，按照SYBR方法進行qRT-PCR。MicroRNA-155上游引物：5′-GGAGGTTAATGCTAATTGTGAT-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；SOCS1上游引物：5′-CCGCTCCCACTCCGATTACC-3′，下游：5′-CCGAA GCCATCTTCACGCTGA-3′，U6上游引物：5′-CTCGC TTCGGCAGCA CA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3′。

1.9Western印跡檢測SOCS1蛋白表達 提取每組大鼠心肌組織和細胞蛋白，使用BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度后進行電泳。轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜后加入5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。加入兔抗鼠SOCS1一抗，孵育4℃過夜；再加羊抗兔二抗室溫孵育2h，ECL液暗室發光顯影。β-actin 作為內參，成像系統采集圖像Image J軟件分析。

1.10細胞活性檢測 CMEC細胞懸液按接種于96孔板中，設6個平行孔/組。待細胞生長達80%融合后，按之前實驗分組處理細胞。加入四甲基偶氮唑藍(MTT)液20 μl，置于37℃、5% CO2環境中培養4 h，棄去MTT溶液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min后，于490 nm波長處檢測每孔細胞吸光度值。細胞存活率=(試驗組吸光度值-空白組吸光度值) /空白組吸光度值×100%。

1.11細胞凋亡率檢測 將細胞接種于24孔板中，37℃、5% CO2環境中培養。待細胞貼壁后，使用PBS清洗細胞，并用多聚甲醛固定。加入Hochest33258工作液染色。在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態：細胞固縮、濃集且細胞核變亮為凋亡細胞。凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.12白細胞介素(IL)-6、IL-10、IL-18和IL-1β水平 吸取細胞培養液，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測細胞培養液中IL-6、IL-10、IL-18和IL-1β濃度。

1.13統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1兩組血清總膽固醇、血脂和血鈣水平 與正常組比較，AS組TC、TG、LDL-C和Ca2+水平均有顯著差異(P<0.05)，而HDL-C水平無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、Ca2+水平

2.2兩組心肌組織中MicroRNA-155和SOCS1 mRNA表達水平 與正常組比較，AS組心肌組織中MicroRNA-155 mRNA水平顯著上升，而SOCS1 mRNA表達水平則顯著下調(P<0.05)。見表2。

表2 兩組MicroRNA-155與SOCS1 mRNA表達水平

2.3兩組心肌組織中SOCS1蛋白表達水平 Western印跡法檢測結果顯示，與正常組(1.02±0.08)比較，AS組SOCS1蛋白表達(0.32±0.02)顯著下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組SOCS1蛋白表達水平

2.4雙熒光素酶實驗檢測結果 生物信息網站http://www.microrna.org預測MicroRNA-155與SOCS1有靶向關系。見圖2。293T細胞內共轉染SOCS1-3′UTR-WT質粒和MicroRNA-155 mimics質粒。結果顯示，野生型中，與SOCS1-3′UTR-WT + NC組(1.12±0.13)比較，SOCS1-3′UTR-WT + MicroRNA-155 mimics組熒光素酶活性(0.72±0.08)顯著降低(P<0.05)。在突變型中，與SOCS1-3′UTR-MUT+NC組(1.13±0.15)比較，SOCS1-3′UTR-MUT+MicroRNA-155 mimics組熒光素酶活性(1.18±0.22)無顯著差異(P>0.05)。

圖2 MicroRNA-155靶向調控SOCS1表達

2.5冠狀動脈內皮細胞形態觀察及鑒定原代 冠狀動脈內皮細胞培養1 d細胞形態呈鵝卵石狀；培養5～7 d時，形態呈多角形或梭形。見圖3。

圖3 冠狀動脈內皮細胞形態(×400)

2.6各組細胞中MicroRNA-155和SOCS1 mRNA表達水平 qPCR結果顯示:與空白對照組比較，MicroRNA-155 mimics組中MicroRNA-155表達水平顯著上升，SOCS1 mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)；而MicroRNA-155 inhibitor組中MicroRNA-155表達水平顯著下降，SOCS1 mRNA表達水平顯著上升(P<0.05)?？瞻讓φ战M、陰性對照組和MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組各指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 MicroRNA-155和SOCS1 mRNA表達水平

2.7各組細胞中SOCS1蛋白表達水平 Western印跡結果顯示，與空白對照組(1.01±0.05)比較，MicroRNA-155 mimics組中SOCS1的蛋白表達水平(1.76±0.32)顯著上升；而MicroRNA-155 inhibitor組中SOCS1的蛋白表達水平(0.41±0.04)顯著下降(P<0.05)?？瞻讓φ战M、陰性對照組(1.06±0.03)和MicroRNA-155 inhibitor + siSOCS1組SOCS1蛋白水平(0.62±0.05)差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：MicroRNA-155 mimics組；4：MicroRNA-155 inhibitor組；5:MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組；圖5同

2.8各組細胞活性 MTT法檢測結果顯示，與空白對照組(0.62±0.04)比較，MicroRNA-155 mimics組細胞活性(0.38±0.02)顯著下降(P<0.05)；MicroRNA-155 inhibitor組細胞活性(1.02±0.03)顯著上升(P<0.05)?？瞻讓φ战M、陰性對照組(0.65±0.06)和MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組細胞活性(0.72±0.05)差異無統計學意義(P>0.05)。

2.9細胞凋亡率檢測 細胞進行冠心病應激后，使用Hochest33258染色，出現細胞核殘缺、核固縮、染色質濃集等凋亡特征。與空白對照組(15.32%±3.28%)比較，MicroRNA-155 mimics組細胞凋亡率(31.65%±4.12%)顯著升高(P<0.05)；而MicroRNA-155 inhibitor組細胞凋亡率(8.19%±4.37%)顯著降低(P<0.05)。MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組的凋亡率(13.29%±2.34%)與空白對照組和陰性對照組(16.61%±3.87%)差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 Hochest33258染色檢測各組細胞凋亡(×400)

2.10各組細胞炎癥因子表達水平 與空白對照組和陰性對照組比較，MicroRNA-155mimics組IL-1β、IL-6和IL-18含量顯著上升，而IL-10含量顯著下降(P<0.05)；而MicroRNA-155 inhibitor組中IL-1β、IL-6和IL-18含量顯著下降，IL-10含量顯著上升(P<0.05)。空白對照組、陰性對照組和MicroRNA-155 inhibitor+siSOCS1組IL-1β、IL-6、IL-10和IL-18含量無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組細胞炎癥因子表達水平

3 討 論

現代社會，人們的生活水平逐漸升高，醫療衛生條件也持續改善，使得人口老齡化加劇，進而導致老年性疾病的發病率逐年上升，其中最嚴重的便是AS〔14〕。AS是許多重要血管事件的病理基礎，其造成的心血管疾病在全球發病率和死亡率中居于首位〔15〕。因而對AS的發病機制及病理基礎進行深入研究具有重大意義?，F代研究表明，免疫炎癥反應在AS的發生及發展過程中有重要作用。

MicroRNAs是近年來新發現的一類內源性非編碼RNA分子，普遍存在于真核生物中，通過抑制其標靶分子的表達，進而發揮在腫瘤發生、免疫炎癥等生命過程中重要的調節作用〔16，17〕。MicroRNA-155是與炎癥關系最為密切的MicroRNAs之一，許多研究發現 MicroRNA-155 在AS病人中呈高表達〔18〕。并且，MicroRNA-155能通過調控不同的靶標分子來調節巨噬細胞炎癥反應、脂質攝取，進而在AS中發揮重要的作用〔19〕。SOCS細胞產生，包括SOCS1～7，是一種反饋性的負性調節因子。通過阻斷細胞因子信號傳導，進而參與人體多種炎性疾病的發生發展〔20〕。包括SOCS1在AS的炎癥機制中發揮著重要作用，研究表明SOCS1可負性調節免疫細胞中干擾素(IFN)和Toll樣受體介導反應〔21〕：SOCS1缺陷小鼠成纖維細胞、DC細胞、巨噬細胞對脂多糖(LPS)和Toll樣受體配體均高度敏感，促進動脈粥樣硬化斑塊形成〔22〕的炎性細胞因子，如IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IFN-γ的分泌量均增高。

現代研究證明，IL-1β通過結合IL-1受體1，是重要的炎癥信號之一〔23，24〕。本實驗結果顯示，MicroRNA-155過表達可抑制冠心病大鼠心肌微血管內皮細胞活力，并使細胞凋亡率上升。因此，MicroRNA-155可靶向抑制SOCS1增加冠心病大鼠心肌微血管內皮細胞的凋亡率。MicroRNA-155通過抑制SOCS1表達，從而促進炎癥因子的表達，使細胞產生炎癥損傷。

綜上，MicroRNA-155通過靶向抑制SOCS1基因，促進冠心病大鼠心肌微血管內皮細胞凋亡，提高促炎因子IL-1β、IL-6 和IL-18表達，從而大鼠心肌微血管內皮細胞炎癥損傷。