環狀RNA在老年神經系統疾病中作用研究進展

李欣 張金鳳 宮萍

(吉林工程職業學院醫護學院,吉林 四平 136001)

非編碼(nc)RNA主要包括微小RNA(miRNA)，長非編碼(lnc)RNA和環狀(circ)RNA，在真核細胞轉錄組中占總RNA的95%〔1〕。circRNA由外顯子，內含子或兩者的反向剪接產生，以形成外顯子或內含子circRNA〔2，3〕。circRNA轉錄本的最早是在30年前發現的，但當時被認為是RNA剪接錯誤的產物，近年來隨著高通量測序技術及生物信息學方法的快速發展，并結合實驗驗證，但隨著研究的深入，目前普遍認為circRNA在基因調控中具有重要功能〔4，5〕。Salzman等〔6〕針對癌癥細胞系、非癌細胞系及急性淋巴細胞白血病患者的RNA樣本進行RNA測序(RNA-Seq)以鑒定circRNA。這一研究首次鑒定出上萬種內源性circRNA，這些circRNA與其線性對應物相比具有高度的穩定性〔7〕。與線性RNA不同，circRNA分子中的3′和5′末端通過共價鍵連接在一起，形成閉合的連續環狀結構。這一特殊結構由于缺少游離末端，可防止其被RNA外切核酸酶降解，這一特點使得circRNA分子更加穩定，并且在細胞質中含量豐富并不斷累積〔3〕。circRNA的表達水平具有組織特異性，在病理條件下，某些circRNA的表達水平明顯失調，這引起了人們對其在人類疾病和癌癥中作用的極大興趣〔8〕。盡管circRNA的確切作用和其調控基因表達的機制仍有待闡明，但目前學界普遍認為，circRNA具有作為疾病生物標記物和新型治療靶標的巨大潛力。

circRNA在神經組織中表達水平極其豐富，尤其在神經元細胞質中，并且在突觸中積累。腦組織中約20%的編碼基因都會產生其相對應的circRNA〔9〕，某些circRNA在大腦中的表達水平遠遠高于其他組織器官，甚至有些circRNA僅在大腦的特定區域中表達，這些circRNA會產生對于神經系統的特異性調節功能〔10〕，并且隨著病理生理狀態的不同而發生變化〔11〕。越來越多的證據表明circRNA在腦功能中起著關鍵的作用〔12〕，尤其在神經組織發育和衰老過程中發揮重要的調控作用，例如在響應神經元活動和突觸形成過程中具有明顯差異表達〔9，13〕，在衰老過程中大腦組織會大量積累circRNA分子〔14，15〕。衰老神經元中選擇性剪接過程的異常可能是造成circRNA表達水平增加的重要因素之一，另外，circRNA能夠抵抗核酸外切酶的特性可能是導致其在衰老腦組織中進一步積累的另一個重要因素。由于這些大腦特異性和與衰老相關的特征，人們對circRNA在遲發性神經退行性疾病中的作用越來越感興趣〔16，17〕。考慮到circRNA的穩定性，它們還可以作為潛在的生物標志物和治療靶標〔18〕。本文將總結研究circRNA及其在常見的老年性神經系統疾病中的作用及其作為生物標志物和治療靶點的潛力。

1 circRNA的合成、降解、作用機制及主要功能

1.1circRNA的生物合成與降解 circRNA大致可分為三種類型：僅由外顯子序列構成的外顯子circRNA(EcircRNA)，這種類型占circRNA的絕大部分，主要存在于細胞質中；僅由內含子序列構成的內含子circRNA(ciRNA)及同時包含外顯子和內含子序列的外顯子-內含子circRNA(EIciRNA)，后兩者主要存在于細胞核中。DDX39A和DDX39B是將形成的環狀結構從細胞核輸出到細胞質的蛋白質，較短的circRNA由DDX39A轉運，較長的circRNA則由DDX39B介導進入細胞質〔19〕。CircRNA 的產生依賴于RNA結合蛋白(RBP)及順式元件和反式因子的組合〔20〕。circRNA可以通過直接反向剪接過程產生，其中RNA的3′末端在前體mRNA的剪接過程中直接連接到5′末端，從而形成環狀結構。在內含子互補序列驅動的反向剪接circRNA合成模型中，外顯子兩側的內含子區域含有互補序列，這些互補序列配對緊密相連，促進反向剪接形成環狀結構〔5〕。在RBP驅動的反向剪接circRNA合成模型中，在RBP的橋接作用下，外顯子兩端的剪接位點直接相連，促進反向剪接形成環狀結構。在套索驅動的反向剪接circRNA合成模型中，在線性RNA剪接過程中被切斷的RNA序列形成套索結構，然后通過反向剪接形成環狀結構〔21〕。但是，circRNA具體的環化和線性可變剪接調節機制仍然有許多無法解釋的問題。

由于circRNA獨特的環狀結構，它們無法通過常規的RNA降解途徑被消除。circRNA的N6-甲基化修飾(m6A)可以被HRSP12蛋白識別，并與RNase P/MRP核酸內切酶復合物相互作用以觸發circRNA降解〔22〕。有報道顯示，miR-671可以與CDR1as上的保守結合位點具有高度互補性，并啟動AGO2介導的降解過程〔23〕。此外，poly(I∶C)刺激或腦心肌炎病毒(EMCV)感染將病理性外源性雙鏈RNA引入HeLa細胞并激活核糖核酸內切酶RNase L〔24〕。這種RNase L介導的circRNA降解需要蛋白激酶R激活，該激活由內部雙鏈RNA形成調節，這種激活的RNase L會導致circRNA的整體降解。對于具有復雜二級結構的circRNA，高度結構化的區域可以被ATP依賴性RNA解旋酶UPF1及核酸內切酶G3BP1識別并誘導circRNA降解〔25〕。

1.2circRNA的調控機制及主要功能 目前針對circRNA研究最為深入的是其充當miRNA“海綿”的作用機制。CircRNA可以與miRNA的靶mRNA競爭性吸附miRNA，從而削弱miRNA介導的miRNA表達抑制〔26〕。Hansen等〔26〕首先通過CDR1as揭示了circRNA在腦組織中的miRNA海綿作用。CDR1as具有70多個miR-7結合位點，它還與作為miRNA調節劑的AGO蛋白結合。在這項研究之后，越來越多的研究進一步證明了circRNA充當miRNA海綿的作用〔27〕。這種機制在多個系統中發揮作用。除了circRNAs海綿性吸附miRNA的作用外，研究者們還進一步研究了circRNA、lncRNA、miRNA和mRNA之間交互環的作用，以確定這些競爭性內源性RNA功能背后的潛在網絡。除了充當miRNA海綿外，circRNA還可以通過直接結合蛋白質發揮其功能，從而充當蛋白質“支架”。CircRNA可以直接與一種或多種蛋白質相互作用，并充當動態支架來組裝RNA-蛋白質復合物〔28，29〕。這種支架功能強調直接的蛋白質相互作用，這與其海綿性吸附功能不同，后者是指解離蛋白質或蛋白質與mRNA之間的結合。

Pamudurti等〔30〕首先發現circRNA能夠進行翻譯。生物信息學平臺和計算分析表明，一些circRNA具有開放閱讀框，因此具有翻譯潛力。CircRNA的翻譯機制可分為依賴內部核糖體進入位點(IRES)的翻譯或不依賴IRES的翻譯。CircSHPRH被證明以IRES依賴方式翻譯為SHPRH-146aa多肽〔31〕。還有一些其他的 circRNA 被發現可以編碼具有致癌或腫瘤抑制活性的功能性肽和蛋白質。一些circRNA以不依賴IRES的方式編碼肽。例如，m6A修飾促進蛋白質翻譯〔32，33〕。

2 circRNA在老年性神經系統疾病中的作用

2.1帕金森病(PD) PD在產生臨床癥狀的數年前即開始病理性改變，其臨床癥狀包括靜息性震顫、運動遲緩、僵硬及非焦慮、抑郁、自主神經紊亂和神經認知功能下降等〔34〕。編碼αSYN蛋白的SNCA基因突變是導致PD的分子機制之一，PD神經元中αSYN表達水平異常升高〔35～37〕。研究發現CDR1as可以通過海綿性吸附miR-7調控其靶基因SNCA，這表明CDR1as可能促進αSYN的異常表達，起到促進PD的作用〔38〕。另一項研究發現SNCA基因的環狀產物circSNCA同樣可以通過抑制miR-7的活性從而促進αSYN的異常表達〔39〕。使用多巴胺激動劑可以下調PD細胞模型中的circSNCA表達水平，從而導致miR-7上調和αSYN下調〔39〕。另一項針對PD小鼠模型和細胞模型的研究發現，circDLGAP4在PD中表達水平下調，其可能通過調節miR-134-5p促進PD的進展〔40〕。

近期的一項研究發現，在表達人類αSYN的轉基因秀麗隱桿線蟲模型中，來源于Zip-2基因的環狀產物circZip-2表達水平明顯降低，進一步的研究發現，circZip-2可能海綿性吸附miR-60，而miR-60可以抑制PD保護性基因〔41〕。由此可見，circZip-2可能在PD中具有保護作用，而circZip-2的缺失可能有助于αSYN聚集，進而促進PD發生。

氧化應激被認為是包括PD在內的許多神經退行性疾病的重要原因之一。CircSLC8A1在PD患者大腦組織的黑質紋狀體中表達水平失調，并且在暴露于氧化應激誘導劑百草枯的培養細胞中表達水平顯著升高〔42〕。CircSLC8A1包含7個miR-128結合位點，可與miRNA效應蛋白Ago2結合。Sirt1蛋白可以中和αSYN的神經毒性，對PD產生神經保護作用；它也恰好可以被miR-128靶向抑制，miR-128本身靶向幾種與神經退行性和衰老調節劑高度相關的mRNA。因此，circSLC8A1可以通過海綿性吸附miR-128調節Sirt1等PD相關基因。

CircRNA還可能通過調節基因轉錄水平參與PD的發病和進展。CircDLGAP4在PD模型中下調并參與PD的病理生理過程，它可以通過海綿效應調節miR-134-5p的表達〔40〕，并進一步影響其靶標基因CAMP反應元件結合蛋白(CREB)，CREB是cAMP信號通路中的重要轉錄因子，可通過Ser133位點的磷酸化激活〔43〕。激活的CREB通過轉錄激活下游靶基因如Bcl2凋亡調節因子〔44〕、腦源性神經營養因子(BDNF)〔43〕和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子(PGC)-1α〔45〕。因此，circDLGAP4 可能通過調節 miR-134-5p/CREB通路參與PD的發病機制〔40〕。

除了探討circRNA在PD致病機制中的作用以外，針對circRNA作為診斷和預測PD生物標志物的研究，也正受到越來越多的關注。最近的一項研究對60例PD患者和60名健康對照者的外周血單核細胞中的circRNA進行了對比分析，微陣列結果顯示，6個circRNA在PD患者組中顯著減少。為進一步評價差異表達的circRNAs對PD患者的診斷價值，采用受試者工作特征(ROC)曲線，計算曲線下面積(AUC)，統計結果顯示，circ_0000497、circ_0000826、circ_0003848和circ_0126525在PD組中均顯著下調，可用作PD診斷的生物標志物〔46〕。

2.2阿爾茨海默病(AD) AD是遲發性癡呆的最常見病因。AD最主要的神經病理學標志是β-淀粉樣斑塊和神經原纖維的積累。研究發現ciRS-7在AD患者的海馬中表達水平下調〔47〕，如前文所述，ciRS-7可以通過海綿性吸附miR-7從而調節其生物活性〔48〕，其中泛素蛋白連接酶(UBE)2A的表達水平也受到miR-7的調節作用，UBE2A可促進β淀粉樣斑塊的清除。因此，ciRS-7表達水平降低可能增加β-淀粉樣蛋白的沉積，從而促進AD發生。

針對AD死亡患者的腦組織RNA測序研究發現，9中circRNA與AD的診斷、臨床癡呆評分(代表臨床癥狀嚴重程度)和Braak評分(代表神經病理學嚴重程度)具有相關性，超過160種circRNA與至少1項AD癥狀具有相關性〔49〕。其中circHOMER1來自于Homer1基因，該基因編碼一種涉及突觸可塑性和神經元存活的蛋白質〔50〕。通過生物信息學分析發現，circHOMER1可以通過miRNA途徑調控PSEN1&2蛋白的表達水平，從而影響淀粉樣蛋白的沉積。值得注意的是，這些circRNA在大腦皮層不同區域的變化水平是相同的，這表明AD相關的circRNA變化可能在整個腦皮質中是一致的，并且可能在疾病進展的早期即發生表達水平的改變。Zhang等〔51〕應用生物信息學分析了來自多個大腦區域的4個AD RNA測序數據集并構建了circRNA-miRNA-mRNA分子調控網絡。結果表明，circRNA KIAA1586具有3個與AD相關的miRNA(hsa-miR-29b，hsa-miR-101，hsa-miR-15a)的結合位點，這些miRNA通過靶向PSEN2等多個mRNA，從而在AD中具有潛在的調控作用〔51〕。Wang等〔52〕通過向大鼠腦室注射β-淀粉樣蛋白成功誘導出AD大鼠模型，通過對海馬體RNA Microarrary數據的分析確定了在AD大鼠模型中差異表達的555個circRNA、183個miRNA和319個mRNA，并構建了circRNA-miRNA-mRNA分子調控網絡。在另一項研究中，Huang等〔53〕應用RNA Microarrary技術對散發性轉基因AD小鼠模型進行了circRNA表達譜分析，通過進一步的RT-qPCR驗證發現，circRNA_017963的表達水平變化最為顯著。通過生物信息學構建circRNA-miRNA-mRNA分子調控網絡確定了至少5種可能與circRNA_017963結合的miRNA。進一步的GO分析和KEGG分析表明，這些miRNA參與了AD進展有關的多種生物學過程，如胞吐、突觸小泡循環、凋亡和RNA剪接等。在淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素(PS)1轉基因小鼠的大腦中發現，circTulp4是導致AD發展的潛在因素。CircTulp4通過與U1小核核糖核蛋白顆粒(snRNP)和RNA聚合酶Ⅱ相互作用來調節其親本基因TULP4的表達，影響神經元的生長和分化。在另一項研究中，研究人員對 8 個月大的APP/PS1小鼠海馬中的circRNA-miRNA-mRNA調控網絡進行了表征，并發現了一種新的mmu_circ_0003012/mmu-miR-298-3p/Smoc2信號軸，通過cGMP-PKG信號通路調控AD發生〔54〕。

除了探討circRNA在AD致病機制中的作用以外，針對circRNA作為診斷和預測AD的生物標志物的研究，也正受到越來越多的關注。通過對8例AD患者和8名對照受試者的腦脊液中circRNA的表達模式的分析發現，AD患者中163個circRNA的表達水平顯著失調，其中許多circRNA富集在AD經典的通路上，如自然殺傷細胞介導的細胞毒性、神經營養因子信號通路和膽堿能突觸等。此外，該研究指出，circ-AXL、circ-GPHN和circ-PCCA是具有臨床價值的潛在生物標志物，可用于預測AD的疾病風險和進展〔55，56〕。在對50例AD患者和50名對照受試者進行的對比研究中發現，AD患者的外周血中hsa_circ_0003391表達水平顯著下調，并且其表達水平與AD的臨床表現之間存在潛在的相關性〔57〕。

2.3肌萎縮側索硬化癥 肌萎縮側索硬化癥是一種進行性神經退行性疾病，會導致腦干和脊髓中的選擇性運動神經元丟失。大多數患者發生肌萎縮側索硬化癥的原因尚不清楚，但之前的研究證實了融合肉瘤(FUS)基因的突變與家族性肌萎縮側索硬化癥的關系。目前對于circRNA在肌萎縮側索硬化癥發病機制中的作用的研究尚處于起步階段〔58〕。該領域的第一項研究是由Errichelli等〔59〕在小鼠胚胎干細胞(ESC)衍生的運動神經元中首先進行研究。他們發現FUS通過與環狀外顯子相鄰的內含子序列結合從而促進circRNA的合成。在FUS耗盡后，circRNA表達失調。FUS可以直接影響特定circRNA的生物合成，致病性FUS突變可能通過影響剪接調節的機制影響circRNA的生物合成。與FUS的功能類似，TDP-43也是一種定位于細胞核中的DNA和RNA結合蛋白。前腦TDP-43基因的條件性缺失小鼠模型證實，肌萎縮側索硬化癥相關的RBP對circRNA表達具有重要的調控作用，該小鼠表現出一系列額顳葉癡呆樣異常行為。RNA-seq 數據顯示，新皮質中的數百個circRNA在TDP-43敲除小鼠和對照小鼠之間有顯著差異表達〔60〕。最近的一項研究表明，源自C9orf72的一段含有內含子G重復序列的RNA序列可以在細胞質中形成穩定的circRNA，在那里它可以作為含有二肽重復的蛋白質(DRP)翻譯的模板，這也從側面解釋了C9orf72內含子導致肌萎縮側索硬化癥的機制〔61〕。

2.4多發性硬化癥 多發性硬化癥是一種復發性或進行性免疫介導的炎癥性脫髓鞘疾病，其特征是少突膠質細胞的喪失。最近的一項研究表明，在多發性硬化癥患者的白細胞中，超過400個circRNA的表達水平出現異常，其中大多數被下調〔62〕。各種ncRNA之間的相互作用也可能在調節多發性硬化癥相關的可變剪接事件中發揮重要作用，例如，在多發性硬化癥患者中上調的lncRNA可以調節剪接調控基因的表達，從而影響全局剪接和反向剪接過程〔63〕。其中lncRNAMALAT1參與調節49個circRNA的反向剪接和表達調控，從而導致多發性硬化癥發病機制的異質性〔63〕。

2.5多系統萎縮 多系統萎縮是一種罕見的、散發的、進展迅速的神經退行性疾病，會影響身體的非自主功能，包括呼吸和血壓〔64〕。多系統萎縮的許多癥狀與PD相似〔65〕。多系統萎縮患者大腦中的病理性αSYN 積累在多系統萎縮疾病進展中起主導作用〔66〕。有趣的是，多種circRNA如circRNA-IQCK、circRNA-MAP4K3、circRNA-EFCAB11、circRNA-DTNA和circRNA-MCTP1在多系統萎縮患者額葉皮質組織中表達水平顯著升高，而它們的線性轉錄本沒有改變〔67〕。這種差異還表明，circRNA 及其親本線性RNA的表達在某些特定情況下是獨立調控的〔68〕。值得注意的是，有一些熱點基因可以產生不止一個circRNA，在針對多系統萎縮的轉錄組分析中就發現了21個類似的circRNA熱點基因，這些熱點基因都可以形成10個以上不同的circRNA〔67〕。然而，circRNA在多系統萎縮病理學中的確切作用尚未確定。

2.6腦卒中 在出現急性頸動脈相關缺血性腦卒中的患者血清樣本中，circR-284與miR-221的概率升高，表明circRNA可以作為頸動脈相關性腦血管缺血的診斷標志物〔69〕。通過對短暫大腦中動脈閉塞6、12和24 h再灌注后的小鼠大腦中circRNA的表達情況的分析發現，與對照組相比，有283個circRNA的表達水平出現明顯改變〔70〕。通過進一步的生物信息學分析發現，這些circRNA通過與蛋白質，離子和核酸的結合所參細胞代謝，細胞通訊等調控過程〔70〕。這項研究首次表明，circRNA對腦缺血敏感，其表達水平的改變可能與腦卒中后的病理生理改變相關。另一項相似的研究顯示，在急性缺血性腦卒中患者和小鼠腦卒中模型的血漿中circDLGAP4水平顯著降低，circDLGAP4可以通過海綿性吸附內源性miRNA-143抑制其活性，并導致miR-143靶標HECTD1基因的表達水平增加〔71〕。這兩項最新研究均表明circRNA可能作為缺血性腦卒中治療的靶標和疾病活動的標志物。

綜上，circRNA參與了老年神經系統疾病的復雜病理生理調控過程。circRNA的異常表達，可能會導致神經退行性疾病的發展，但該領域尚缺乏系統的大規模人類樣本研究。未來仍需要更多針對circRNA在神經退行性疾病和健康大腦中的作用的研究。未來的研究中建議同時囊括所有類型的調節性RNA(如circRNA，miRNA，lncRNA)及mRNA，并采取更為先進的circRNA數據分析和生物信息學算法，以全面了解其在老年神經系統疾病中的相互作用，同時闡明circRNA在健康和疾病中的作用及其潛在的診斷，預后和治療用途。